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一種MagnolosideA的提取工藝及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11611540閱讀:206來源:國知局
一種MagnolosideA的提取工藝及其應(yīng)用的制造方法與工藝
本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域
,具體涉及一種magnolosidea的提取工藝及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
:厚樸(拉丁文名:magnoliaofficinalisrehd.etwils.)屬木蘭科(magnoliaceae)木蘭屬(magnolia)植物,包括凹葉厚樸m.officinalissubsp.biloba厚樸(原亞種)m.officinalissubsp.officinalis兩個種。中國植物志介紹該植物主要分布于我國南部、東南部以及東北部地區(qū);常見于海拔300-1400米的山區(qū)林中。厚樸的各部位均可入藥,以樹皮為主,為芳香化濕中藥,主治:食積氣滯;腹脹便秘;濕阻中焦,脘痞吐瀉;痰壅氣逆;胸滿喘咳?,F(xiàn)為國家ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物。厚樸別名厚皮、重皮、赤樸、烈樸、川樸、紫油厚樸,是中國歷史上使用較為傳統(tǒng)的一味中藥,常用于傳統(tǒng)中藥方劑中。古籍《傷寒論》中就有記載:大承氣湯中以厚樸,具有行氣散結(jié),消痞除滿的功效,擔(dān)當(dāng)佐使的角色;而在半夏厚樸湯中,厚樸主要的功能是下氣除滿,以散胸中滯氣,重在行氣,為君藥。以上所述足以證明厚樸在中國的傳統(tǒng)中藥中的份量。現(xiàn)代天然產(chǎn)物研究表明:厚樸中的成分多數(shù)為木脂素類和苯乙醇苷類化合物,常見的木脂素類化合物有厚樸酚(magnolol)、異厚樸酚(isomagnolol)、和厚樸酚(honokiol)等含量較高的化合物;苯乙醇苷類化合物主要包括magnolosides系列的化合物。苯乙醇苷類化合物具有廣泛的生物活性,而對中藥厚樸中苯乙醇苷類化合物的化學(xué)成分研究少有報道。magnolosidea是中藥材厚樸中的有效成分之一。magnolosidea結(jié)構(gòu)式為:。hasegawatakashi首次報道了從日本厚樸(magnoliaobovata)中分離得到magnolosidea和magnolosideb,并申請了新化合物專利(jp63310899)。其制備步驟如下:日本厚樸用甲醇提取物,混懸于水中,經(jīng)正丁醇萃取,正丁醇萃取部位反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析純化,最后經(jīng)hw-40f純化得到純品。該方法制備工藝較為復(fù)雜,制備周期較長,且沒有進(jìn)行純度檢驗(yàn)。專利cn102391328a公開了同時制備magnolosidea和magnolosideb化學(xué)對照品的方法,其中涉及到了magnolosidea的制備,具體為:厚樸干燥樹皮8.0kg,粉碎,用4倍量70%乙醇加熱回流提取2h,提取3次,濃縮至4l,用4l氯仿萃取3次。水部位經(jīng)4l的d101大孔樹脂分離,5倍柱體積蒸餾水洗脫除雜后,再用5倍柱體積的20%乙醇洗脫,收集20%乙醇洗脫部分,濃縮干燥得棕色浸膏250g。取浸膏50g,用50ml20%甲醇溶解,經(jīng)微孔濾膜濾過,注入反相中壓色譜柱,色譜柱直徑5cm,長50cm,色譜柱的填充填料為50μmc18(ymc),流速控制為100ml/min,檢測波長為328nm,流動相梯度為0-100min,11%-35%甲醇-醋酸水(ph=3)。收集兩個主峰,40℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮,得到magnolosidea10.5g,magnolosideb7g。反相高壓液相制備:取magnolosidea粗品1.5g,溶于10ml20%甲醇水中,經(jīng)微孔濾膜濾過,吸取1ml濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離,柱長度為25cm,內(nèi)徑2cm,流速10ml/min,合理收集主峰得到100mg的magnolosidea,純度大于98%。吸取5ml濾液經(jīng)高壓反相制備柱分離,柱長度為50cm,內(nèi)徑5cm,流速150ml/min,合理收集主峰得到480mg的magnolosidea,純度大于98%。外觀為淡黃色粉末。該專利中,magnolosidea的提取分離方法較為復(fù)雜,且操作繁瑣。magnolosidea自1988年在厚樸中被hasegawat等人分離得到之后便很少有人對其進(jìn)行藥理、藥動學(xué)方面的研究,其在結(jié)構(gòu)上屬于苯乙醇苷類化合物,此類化合物具有較為廣泛的藥理活性;并且厚樸作為一味傳統(tǒng)中藥來說也具有非常重要的地位,常作為君藥或者臣藥用于各種湯劑中,用于治療各種胃腸道實(shí)癥。magnolosidea作為厚樸中的含量較大的一種苯乙醇苷類化合物,研究其藥理活性有相當(dāng)?shù)谋匾浴<夹g(shù)實(shí)現(xiàn)要素:為了解決上述的技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種magnolosidea的提取工藝。本發(fā)明的另一目的在于提供了magnolosidea的一種制藥用途,即magnolosidea在制備治療胃潰瘍藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過下述的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:一種magnolosidea的提取工藝,包括下述的步驟:厚樸干皮,用10倍重量的95%乙醇加熱回流提取三次,每次2h,提出后將提取液過濾、合并、減壓濃縮后得浸膏;用硅膠拌樣,經(jīng)經(jīng)石油醚-丙酮洗脫得a部位,經(jīng)二氯甲烷洗脫得b部位,經(jīng)二氯甲烷:甲醇(30:1)洗脫得,經(jīng)二氯甲烷:甲醇(10:1)洗脫得d部位,經(jīng)純甲醇洗脫得e部位,將d部位和e部位合并為d′部位,用凝膠分離得d1-d12;d12經(jīng)制備得到magnolosidea。上述的magnolosidea的提取工藝中,所述硅膠用量為厚樸藥材重量的1/5,所述硅膠粒度為200-300目。上述的magnolosidea的提取工藝中,所述凝膠分離為采用凝膠柱sephadexlh-20分離。上述的magnolosidea的提取工藝中,所述d12制備方法為色譜制備,制備液相色譜條件為:先以甲醇/水系統(tǒng)(5%-100%)梯度洗脫30min,其保留時間為14.8min,再用島津以55%的甲醇/水,流速為7ml?min-1,每次進(jìn)樣150μl,進(jìn)行制備。上述的magnolosidea在制備治療胃潰瘍藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于:(1)本發(fā)明提供了一種magnolosidea的簡便的提取工藝,通過該工藝提取制備的magnolosidea,其純度高達(dá)98%以上。(2)magnolosidea對乙醇-阿司匹林導(dǎo)致的大鼠胃黏膜損傷具有保護(hù)作用,可用于治療胃潰瘍。該用途屬于首次公開。附圖說明圖1為厚樸生藥組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。箭頭指示為斑點(diǎn)性出血點(diǎn)。圖2為和厚樸酚組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖3為和magnolosidea低劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。箭頭指示為些許的出血部位。圖4為和magnolosidea高劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖5為和潰瘍組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。箭頭指示為嚴(yán)重潰瘍區(qū)域。圖6為和空白組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。箭頭指示為嚴(yán)重潰瘍區(qū)域。圖7為厚樸生藥組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖8為厚樸生藥組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖9為和厚樸酚組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖10為和厚樸酚組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖11為和厚樸酚組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×200)。圖12為magnolosidea低劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖13為magnolosidea低劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖14為magnolosidea高劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖15為magnolosidea高劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖16為magnolosidea高劑量組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×200)。圖17為乙醇-阿司匹林致胃潰瘍模型組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖18為乙醇-阿司匹林致胃潰瘍模型組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖19為空白組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×40)。圖20為空白組預(yù)防乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖21為空白組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖22為magnolosidea低劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖23為magnolosidea中劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖24為magnolosidea高劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖25為米索前列醇組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖26為潰瘍組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部照片。圖27為空白對照組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖28為magnolosidea低劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖29為magnolosidea中劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖30為magnolosidea高劑量組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖31為米索前列醇組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。圖32為潰瘍組magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠胃部光鏡照片(he,×100)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明,以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明,但并不因此限制本發(fā)明。實(shí)施例1magnolosidea提取分離:取原藥材厚樸干皮15kg,用95%乙醇先浸潤兩天,后加熱回流提取3次,將提取液減壓濃縮后得浸膏1.5kg,加水混懸后用3kg硅膠拌樣,完全干燥后上硅膠柱(200-300目)。經(jīng)石油醚-丙酮洗脫得a部位240g,經(jīng)二氯甲烷洗脫得b部位130g,經(jīng)二氯甲烷:甲醇(30:1)洗脫得c部位130g,經(jīng)二氯甲烷:甲醇(10:1)洗脫得d部位,經(jīng)純甲醇洗脫得e部位,后經(jīng)薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)d部位與e部位重合性較高,于是合并兩部位為d′部位(440g)。d′部位的分離純化用純甲醇將d′部位充分溶解后經(jīng)濾紙過濾,后將濾液置于凝膠柱(sephadexlh-20)上,用純甲醇緩慢勻速洗脫得12個組分:d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d9、d10、d11、d12。其中d12經(jīng)高效液相分析,以甲醇/水系統(tǒng)(5%-100%)梯度洗脫30min,其保留時間為14.8min,且發(fā)現(xiàn)其純度較高。后用島津以55%的甲醇/水,流速為7ml?min-1,每次進(jìn)樣150μl,進(jìn)行制備。后經(jīng)高效液相分析,用面積歸一化法得其純度為98%,得化合物magnolosidea(d12/10.2g)。對化合物d12進(jìn)行了鑒定,詳情如下:鑒定:。黃色無定型粉末(甲醇),esi-msm/z:623[m-h]-,提示相對分子量為624。碳譜數(shù)據(jù)中低場區(qū)化學(xué)位移為169.7的碳,該碳可能是一個羰基碳;18.8的為甲基碳;質(zhì)譜圖中325.0打出的二級質(zhì)譜中出現(xiàn)162.7的碎片峰,推測該化合物中有葡萄糖的存在,結(jié)合碳譜中101.7的糖的端基碳的化學(xué)位移證實(shí)該化合物中有糖的存在;δ116.0-150.5之間有14個高位移的碳的信號峰,推測該化合物中至少有兩個苯環(huán)存在;該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中magnolosided的波譜數(shù)據(jù)類似,這兩個化合物的區(qū)別在于結(jié)構(gòu)中的β-d葡萄糖的數(shù)據(jù)略有不同,與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)(100.6,74.8,68.8,68.9,72.8,65.1)相比該化合物的數(shù)據(jù)(99.3,74.7,72.0,68.0,71.0,61.5)只在個別的數(shù)據(jù)上大些或是小些,說明該化合物與magnolosided相比其差距主要在連接葡萄糖的位置不同,通過分析發(fā)現(xiàn)該化合物的咖啡?;B接在葡萄糖的3位而不是6位。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致,故鑒定該化合物為magnolosidea。黃色無定型粉末(甲醇),esi-msm/z:623[m-h]+,1h-nmr(600mhz,cd3od)δ7.48(1h,d,1.7hz,h-2??),6.98(1h,dd,7.7,1.7hz,h-6???),6.69(1h,dd,7.7,1.7hz,h-6),6.68(1h,d,15.5hz,h-α??),6.46(1h,s,h-3?);13c-nmr(100mhz,cd3od)δ:132.4(c-1),117.4(c-2),145.5(c-3),146.9(c-4),117.9(c-5),122.2(c-6),73.1(α),37.6(β),99.3(c-1?),74.7(c-2?),72.0(c-3?),68.0(c-4?),73.0(c-5?),63.5(c-6?),128.6(c-1"),116.0(c-2"),150.5(c-3"),147.7(c-4"),117.2(c-5"),123.9(c-6"),116.1(α"),148.1(β"),169.7(co),101.7(c-1???),76.9(c-2???),72.9(c-3???),74.6(c-4???),70.8(c-5???),17.8(c-6???)。下面通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明其藥物活性。一、magnolosidea預(yù)防大鼠胃潰瘍的藥理實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性sd大鼠60只,體重(190±10)g,購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,[許可證號:scxk(魯)2014-0007]。1.1.2試劑阿司匹林(018160392)石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司無水乙醇天津市化學(xué)試劑一廠甲醛萊陽市康德化工有限公司羧甲基纖維素鈉(f20100126)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生理鹽水magnolosidea自制厚樸提取物自制(制備方法:取原藥材厚樸干皮15kg,用95%乙醇先浸潤兩天,后加熱回流提取3次,將提取液減壓濃縮后得浸膏1.5kg,即得厚樸提取物)和厚樸酚陜西永源生物技術(shù)有限公司(hplc純度98%)1.1.3試劑配制1.1%羧甲基纖維素鈉溶液(cmc-na):稱取1gcmc-na放入100ml容量瓶中加入純凈水至刻度,倒入燒杯中加熱攪拌混勻,常溫下靜置冷卻后可使用。2.阿司匹林200mg·kg-1混懸液:阿司匹林用研缽研細(xì)后稱取2.0g放入100ml容量瓶中,加入1%cmc-na溶液至刻度,充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。3.magnolosidea80mg·kg-1(前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)溶液:稱取160.0mgmagnolosidea加生理鹽水溶至20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。4.magnolosidea160mg·kg-1溶液:稱取320.0mgmagnolosidea加生理鹽水溶至20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。5.厚樸提取物10g·kg-1溶液:稱取厚樸提取物干燥粉20.0g,加入70%乙醇全部溶解后,減壓濃縮至約20ml的藥液,現(xiàn)配先用。6.和厚樸酚100mg·kg-1混懸液:稱取和厚樸酚200.0mg用研缽研細(xì)后混懸于加有1%吐溫的20ml生理鹽水中,現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1實(shí)驗(yàn)分組60只sd大鼠隨機(jī)分成6組,每組10只。第一組為空白對照組:灌胃同等量的生理鹽水;第二組為:首日給予無水乙醇1ml·200mg-1單次灌胃后1h給予阿司匹林200mg·kg-1連續(xù)灌胃4天致胃潰瘍組(按照10ml·kg-1量給予灌胃),每日一次;第三組為:連續(xù)灌胃厚樸提取物7天組(按照10ml·kg-1量給予灌胃),每日一次;第四組為:連續(xù)灌胃和厚樸酚7天組(按照10ml·kg-1量給予灌胃),每日一次;第五組和第六組:分別給予magnolosidea80mg·kg-1和160mg·kg-1連續(xù)灌胃7天(按照10ml·kg-1量給予灌胃),每日一次;所有組別每次灌胃前12h禁食不禁水。造模期間:除模型組以及空白對照組以外其余各組在造模前1h給予各藥品,1h后再給予阿司匹林;空白對照組在相同時間給予同等量的生理鹽水;模型組則在造模前1h給予同等量的生理鹽水。所有組別的大鼠均在最后一次灌胃前24h禁食,自由飲水,最后一次灌胃后4h將大鼠脫頸處死,解剖,取胃,用10%甲醛5ml固定15min后沿胃大彎剪開,用生理鹽水洗凈,觀察胃黏膜有無損傷,紀(jì)錄出血點(diǎn)數(shù),糜爛斑點(diǎn)數(shù),胃黏膜傷口程度,按照guth計數(shù)法計算胃潰瘍指數(shù)(ulcerindex,ui)。并采集標(biāo)本,制作病理切片,于光鏡下觀察胃黏膜的病理性改變。1.2.2胃潰瘍模型的制備方法參照貢聯(lián)兵臨床合理用藥系列講座(7)抗感冒藥物臨床合理應(yīng)用[j].人民軍醫(yī),2009(1).中制備胃潰瘍模型的方法建立乙醇-阿司匹林型胃潰瘍:sd大鼠與每次灌胃前禁食12h,自由飲水,第一天灌胃時先灌胃無水乙醇(1ml·200mg-1),灌胃后1h再灌胃阿司匹林(200mg·kg-1),之后連續(xù)灌胃4天同等劑量的阿司匹林,每日一次。最后一次灌胃阿司匹林后禁食24h,脫頸處死,解剖,取胃,觀察并采集標(biāo)本。1.2.3胃潰瘍指數(shù)的計算方法以及he染色下的光鏡觀察1.guth計數(shù)法:斑點(diǎn),糜爛記作1分,糜爛長度<1mm記作2分,1-2mm記作3分,2-4mm記作4分,>4mm記作5分,最后合計每只sd大鼠的總分為該大鼠的胃潰瘍指數(shù)。2.he染色下光鏡觀察:剪取胃竇組織約1.0cm×0.5cm(包括潰瘍部分),放入4%多聚甲醛中固定3天,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片前將組織石蠟塊放入清水中置-20℃冰箱中放30min,后取出,切取約4μm后的胃組織切片,在含有酒精的48℃清水中展開,用載玻片撈起烤片,之后進(jìn)行he染色,觀察各組大鼠的胃黏膜組織的病理學(xué)上的改變。按照以下步驟進(jìn)行染色操作:(1)烤片:載玻片撈起組織切片后,60℃烤片過夜(2)脫蠟至水:將烤好的切片放在載玻片架上,依次放入二甲苯i中10min,二甲苯ii中10min,二甲苯iii中10min,二甲苯iv中10min,100%乙醇i中5min,100%乙醇ii中5min,95%乙醇5min,90%乙醇5min,85%乙醇5min,水中浸洗5min。(3)蘇木精染色:5min。(4)流水稍洗去蘇木精3s,放入1%鹽酸乙醇中3s,稍水洗10s,蒸餾水洗10s。(5)0.5%伊紅染色液3min,蒸餾水清洗2s,80%乙醇清洗2s。(6)依次放入80%乙醇1-2s,95%乙醇i2-3s,95%乙醇ii3-5s,無水乙醇5-10min。(7)二甲苯透明3次,每次5min,用中性樹膠封片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組胃黏膜組織學(xué)以及病理學(xué)形態(tài)的變化,并比較各組與潰瘍組的差異。1.2.4數(shù)據(jù)處理及分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計:各組間的比較先進(jìn)行兩組完全隨機(jī)設(shè)計資料的方差齊性檢驗(yàn),若方差齊性則進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計兩總體均數(shù)比較的t檢驗(yàn),若方差不齊則進(jìn)行近似t檢驗(yàn)。p<0.05即有統(tǒng)計學(xué)意義,則證明兩組之間的效果差異有顯著性,p<0.01表示差別有高度顯著性。1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1.1表觀觀察1.厚樸生藥組:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)該組的大鼠胃黏膜及粘膜皺襞正常,未見糜爛、潰瘍,只有如圖所示的少許斑點(diǎn)性出血。見附圖1。2.和厚樸酚組:連續(xù)給藥一周后造模5天,發(fā)現(xiàn)該組大鼠的胃黏膜表面光滑,無傷口,且發(fā)現(xiàn)皺襞正常,未見糜爛、出血和潰瘍。見附圖2。1.magnolosidea低劑量組:在該組的大鼠胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)有白色斑點(diǎn)形狀的糜爛,且有些許的部位有出血情況,見附圖3。4.magnolosidea高劑量組:胃黏膜表面平整光滑,未見糜爛、出血和潰瘍。見附圖4。5.潰瘍組:該組大鼠胃黏膜出血嚴(yán)重,且糜爛較嚴(yán)重,有橢圓形的潰瘍生成,中心呈白色,周圍粘膜水腫或是充血,直徑約0.3-0.5cm。見附圖5。6.空白組:該組的大鼠胃黏膜及粘膜皺襞正常,未見糜爛、潰瘍。見附圖6。1.1.2光鏡觀察1.厚樸生藥組:照片見附圖7和附圖8。生藥組大鼠胃黏膜固有層血管擴(kuò)張、充血。未見上皮細(xì)胞變性壞死。2.和厚樸酚組:照片見附圖9、10、11。發(fā)現(xiàn)淺層上皮細(xì)胞變性、壞死。3.magnolosidea低劑量組:照片見附圖12、13。淺層上皮細(xì)胞變性、壞死。4.magnolosidea高劑量組:照片見附圖14、15、16。淺層上皮細(xì)胞變性、壞死。5.乙醇-阿司匹林致胃潰瘍模型組:照片見附圖17、18。黏膜腺體消失,黏膜面表層見大量滲出物及壞死組織,其下為肉芽組織,伴大量炎細(xì)胞浸潤。潰瘍處黏膜腺體消失,粘膜層及黏膜下層均以肉芽組織代替,伴大量炎細(xì)胞浸潤。6.空白組:照片見附圖19、20??瞻讓φ战M胃黏膜為單層柱狀上皮,固有層結(jié)締組織中充滿胃底腺,未見上皮細(xì)胞變性、壞死。1.1.3各個給藥組對乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍預(yù)防作用的評價采用統(tǒng)計學(xué)軟件spss17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析:空白對照組大鼠未發(fā)生胃潰瘍,和厚樸酚組、生藥組以及magnolosidea組的胃潰瘍指數(shù)(ui)與空白組相比均呈現(xiàn)顯著增加,并且各組與空白組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01);潰瘍組發(fā)生了明顯的潰瘍灶,與潰瘍組相比較生藥組、和厚樸酚組以及magnolosidea低劑量、高劑量組的胃潰瘍指數(shù)(ui)有所降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);其具體數(shù)據(jù)以及評價結(jié)果詳見表1。表1各個給藥組對大鼠胃潰瘍指數(shù)(ui)的影響(`x±s)組別例數(shù)(只)ui空白對照組100.00##生藥組105.25±1.49**##和厚樸酚組107.00±2.45**#magnolosidea低劑量組107.25±2.44**#magnolosidea高劑量組107.00±1.41**#潰瘍組1015.71±2.14**與空白組相比p<0.05“*”,p<0.01“**”;與潰瘍組相比p<0.05“#”,p<0.01“##”二、magnolosidea與米索前列醇對大鼠胃潰瘍預(yù)防效果的比較2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性sd大鼠60只,體重(190±10)g,購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,[許可證號:scxk(魯)2014-0007]。2.1.2試劑阿司匹林(018160392)石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司無水乙醇天津市化學(xué)試劑一廠甲醛萊陽市康德化工有限公司羧甲基纖維素鈉(f20100126)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生理鹽水magnolosidea自制米索前列醇(161102)湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司2.1.3試劑配制1.1%羧甲基纖維素鈉溶液(cmc-na):稱取1.0gcmc-na放入100ml容量瓶中加入純凈水至刻度,倒入燒杯中加熱攪拌混勻,常溫下靜置冷卻后可使用。2.阿司匹林200mg?kg-1混懸液:阿司匹林用研缽研細(xì)后稱取2.0g放入100ml容量瓶中,加入1%cmc-na溶液至刻度,充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。3.magnolosidea40mg?kg-1溶液:稱取80.0mgmagnolosidea加生理鹽水溶至20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。4.magnolosidea80mg?kg-1溶液:稱取160.0mgmagnolosidea加生理鹽水溶至20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。5.magnolosidea160mg?kg-1溶液:稱取320.0mgmagnolosidea加生理鹽水溶至20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。6.米索前列醇0.1mg?kg-1溶液:稱取0.2mg米索前列醇研細(xì)后的粉末,加入1%的cmc-na溶液配制成20ml的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1實(shí)驗(yàn)分組60只sd大鼠隨機(jī)分成6組,每組10只。第一組為空白對照組:灌胃同等量的生理鹽水;第二組為:首日給予無水乙醇1ml?200mg-1單次灌胃后1h給予阿司匹林200mg?kg-1連續(xù)灌胃4天致胃潰瘍組(按照10ml?kg-1量給予灌胃),每日一次;第三組為:連續(xù)灌胃magnolosidea40mg?kg-17天組(按照10ml?kg-1量給予灌胃),每日一次;第四組為:連續(xù)灌胃magnolosidea80mg?kg-17天組(按照10ml?kg-1量給予灌胃),每日一次;第五組為:連續(xù)灌胃magnolosidea160mg?kg-17天組(按照10ml?kg-1量給予灌胃),第六組為:連續(xù)灌胃米索前列醇0.1mg?kg-17天組(按照10ml?kg-1量給予灌胃),每日一次;所有組別每次灌胃前12h禁食不禁水。造模期間:除模型組以及空白對照組以外其余各組在造模前1h給予各藥品,1h后再給予阿司匹林;空白對照組在相同時間給予同等量的生理鹽水;模型組則在造模前1h給予同等量的生理鹽水。所有組別的大鼠均在最后一次灌胃前24h禁食,自由飲水,最后一次灌胃后4h將大鼠脫頸處死,解剖,取胃,用10%甲醛5ml固定15min后沿胃大彎剪開,用生理鹽水洗凈,觀察胃黏膜有無損傷,紀(jì)錄出血點(diǎn)數(shù),糜爛斑點(diǎn)數(shù),胃黏膜傷口程度,按照guth計數(shù)法計算胃潰瘍指數(shù)(ulcerindex,ui)。并采集標(biāo)本,制作病理切片,于光鏡下觀察胃黏膜的病理性改變。2.2.2潰瘍模型制備方法以及大鼠胃黏膜損傷評價標(biāo)準(zhǔn)均按照第一部分進(jìn)行2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1表觀觀察1.空白對照組:照片見附圖21。2.magnolosidea低劑量組:照片見附圖22。表面觀察發(fā)現(xiàn)該組大鼠胃黏膜表面有部分面積出現(xiàn)出血現(xiàn)象,且有1-2mm的傷口出現(xiàn)。3.magnolosidea中劑量組:該組大鼠胃黏膜表面有少量出血點(diǎn)出現(xiàn),其余胃黏膜表面較為光滑,未見傷口出現(xiàn)。照片見附圖23。4.magnolosidea高劑量組:照片見附圖24。該組大鼠胃黏膜表面有些許出血點(diǎn),胃黏膜表面光滑,未發(fā)現(xiàn)糜爛。5.米索前列醇組:照片見附圖25。胃黏膜表面只有零星的出血點(diǎn)出現(xiàn),未發(fā)現(xiàn)糜爛、傷口。6.潰瘍組:照片見附圖26。該組大鼠胃黏膜表面出血較嚴(yán)重,糜爛,且傷口較長(一般約為2-4mm,也見大于4mm的傷口),面積廣(見于大部分的胃黏膜表面),傷口較深。2.3.2光鏡觀察1.空白對照組:未見明顯異常。2.magnolosidea低劑量組:胃黏膜上皮細(xì)胞明顯變性壞死,局部凹陷,黏膜下層血管充血出血、高度水腫,有大量炎細(xì)胞浸潤。3.magnolosidea中劑量組:粘膜層少量出血。4.magnolosidea高劑量組:未見明顯異常。5.米索前列醇組:未見明顯異常。潰瘍組:胃粘膜下層、肌層大量出血,局灶胃黏膜上皮細(xì)胞變性壞死,少量炎細(xì)胞浸潤。2.3.3各給藥組對乙醇-阿司匹林致大鼠胃潰瘍預(yù)防作用的評價采用統(tǒng)計學(xué)軟件spss17.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析:空白對照組大鼠未發(fā)生胃潰瘍,magnolosidea低劑量組、magnolosidea中劑量組、magnolosidea高劑量組以及米索前列醇組的胃潰瘍指數(shù)(ui)與空白組相比均呈現(xiàn)顯著增加,并且各組與空白組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01);潰瘍組發(fā)生了明顯的潰瘍灶,與潰瘍組相比較生藥組、和厚樸酚組以及magnolosidea低劑量、高劑量組的胃潰瘍指數(shù)(ui)有所降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);其具體數(shù)據(jù)以及評價結(jié)果詳見表2。表2各個給藥組對大鼠胃潰瘍指數(shù)(ui)的影響(`x±s)組別例數(shù)(只)ui空白組90##magnolosidea低劑量組917.67±2.60**##magnolosidea中劑量組98.78±2.33**##magnolosidea高劑量組98.33±1.57**##米索前列醇組92.33±1.32**##潰瘍組926.22±4.71**與空白組相比p<0.05“*”,p<0.01“**”;與潰瘍組相比p<0.05“#”,p<0.01“##”各個組大鼠的ui顯示:各個組的ui與潰瘍組相比均有顯著性差異;米索前列醇能較顯著的降低大鼠胃潰瘍指數(shù);magnolosidea高劑量組與米索前列醇組的ui相比較p<0.01即存在顯著性差異,證明magnolosidea在乙醇-阿司匹林所致大鼠胃潰瘍中降低ui的能力遠(yuǎn)低于米索前列醇。阿司匹林作為一種常用的非甾體類抗炎藥(nsaids),又名乙酰水楊酸,具有良好的解熱陣痛作用,主要用于治療感冒、發(fā)熱、頭痛、牙痛、關(guān)節(jié)痛、風(fēng)濕病,除此之外還能抑制血小板聚集,上世紀(jì)后期發(fā)現(xiàn)其可用于預(yù)防和治療缺血性心臟病、心絞痛、心肺梗塞、腦血栓形成,應(yīng)用于血管形成術(shù)及旁路移植術(shù)也有效,故俗稱其為“萬靈藥”。阿司匹林自從其問世至今仍是臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗炎鎮(zhèn)痛藥,通常也用作其他藥物評價的標(biāo)準(zhǔn)制劑;至今已逾百年的歷史。當(dāng)今時代,隨著人民生活水平不斷提高,心腦血管疾病日趨年輕化,阿司匹林成為現(xiàn)代中老年人群中的預(yù)防和治療心腦血管疾病的常用藥之一,研究其不良反應(yīng)并且采取對應(yīng)的措施顯得尤為重要。查閱文獻(xiàn)可知阿司匹林常見不良反應(yīng)為胃腸道系統(tǒng)功能紊亂,表現(xiàn)為:惡心、嘔吐、腹痛,長期大劑量服用后可引起胃炎、隱性出血、加重胃潰瘍形成和消化道出血等。nsaids引發(fā)消化性潰瘍常發(fā)生在胃和十二指腸,其機(jī)制為:傳統(tǒng)nsaids的抗炎作用是通過抑制環(huán)氧合酶(cox-2)實(shí)現(xiàn)的,而不良反應(yīng)則是抑制環(huán)氧合酶(cox-1)的結(jié)果。胃腸的cox-1被抑制,導(dǎo)致前列腺素(pgs)合成減少,黏膜屏障功能破壞,在胃酸等損害因子作用下,發(fā)生潰瘍。本實(shí)驗(yàn)所用制造胃潰瘍模型的方法則是先用乙醇直接刺激大鼠胃黏膜導(dǎo)致急性胃黏膜損傷,此時平常不表達(dá)或表達(dá)量很少的cox-2將會被誘導(dǎo)發(fā)生表達(dá)迅速上調(diào)而占優(yōu)勢,進(jìn)而合成前列腺素(pge2)以發(fā)揮維持黏膜完整性和促進(jìn)愈合的作用;而緊接著給予大鼠的阿司匹林則是抑制了大鼠胃黏膜損傷區(qū)高表達(dá)的cox-2的活性而阻礙了pge2的合成,從而使得大鼠胃黏膜損傷的愈合延緩并加重其損傷,最終保證了實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷臐冃Ч?。本?shí)驗(yàn)第一部分通過上述方法建立大鼠胃潰瘍模型,并初步研究了magnolosidea對于乙醇-阿司匹林引起的大鼠慢性胃潰瘍是否具有預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用該方法成功制作了大鼠胃潰瘍模型。在對大鼠胃黏膜表面進(jìn)行直觀的觀察之后發(fā)現(xiàn):空白對照組的大鼠胃黏膜表面沒有發(fā)現(xiàn)任何的糜爛、出血,沒有潰瘍灶形成;厚樸生藥組大鼠胃粘膜表面有少量的出血性斑點(diǎn)出現(xiàn),未出現(xiàn)潰瘍;和厚樸酚組以及magnolosidea高劑量組大鼠胃黏膜表面光滑,胃壁無褶皺;magnolosidea低劑量組大鼠胃黏膜出現(xiàn)白色斑點(diǎn)性糜爛;潰瘍組大鼠胃黏膜出血嚴(yán)重,且糜爛較嚴(yán)重,有橢圓形的潰瘍生成,中心呈白色,周圍粘膜水腫或是充血,直徑約0.3-0.5cm。通過ui發(fā)現(xiàn)magnolosidea可降低ui,且高劑量一組稍顯明顯,結(jié)果顯示magnolosidea對胃黏膜具有一定的保護(hù)作用。通過對大鼠胃組織進(jìn)行he染色后的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):空白對照組胃黏膜為單層柱狀上皮,固有層結(jié)締組織中充滿胃底腺,未見上皮細(xì)胞變性、壞死;生藥組胃黏膜固有層細(xì)胞擴(kuò)張、充血,但未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壞死;和厚樸酚組以及magnolosidea低、高劑量組的大鼠胃黏膜只發(fā)現(xiàn)淺層上皮細(xì)胞變性、壞死;潰瘍處黏膜腺體消失,粘膜層及黏膜下層均以肉芽組織代替,伴大量炎細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)二考察了magnolosidea和米索前列醇對乙醇-阿司匹林致胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用,并對其進(jìn)行了比較。直觀觀察大鼠胃黏膜表面發(fā)現(xiàn):潰瘍組的大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯的損傷,模型制作成功;magnolosidea低劑量組的大鼠胃黏膜也有大面積的出血,且伴有糜爛,但相對于潰瘍組較輕;magnolosidea中劑量組和高劑量組的大鼠胃黏膜表面只有少許的出血點(diǎn)出現(xiàn),胃黏膜較為光滑,未見潰瘍形成;米索前列醇組的大鼠胃黏膜表面完整,有少許出血點(diǎn)見于幾只大鼠,未見潰瘍形成。通過ui發(fā)現(xiàn):各個組的ui與潰瘍組相比均有顯著性差異;米索前列醇能較顯著的降低大鼠胃潰瘍指數(shù);magnolosidea高劑量組與米索前列醇組的ui相比較p<0.01即存在顯著性差異,證明magnolosidea在乙醇-阿司匹林所致大鼠胃潰瘍中降低ui的能力遠(yuǎn)低于米索前列醇。綜上所述magnolosidea對乙醇-阿司匹林導(dǎo)致的大鼠胃黏膜損傷具有一定的保護(hù)作用,可用于治療胃潰瘍。當(dāng)前第1頁12
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