本發(fā)明涉及一種功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與應(yīng)用，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

O-連接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的翻譯后修飾。與經(jīng)典的O-糖基化修飾有所不同，O-GlcNAc糖基化修飾僅存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，只有一個單糖結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)簡單，是一種高度動態(tài)、可誘導(dǎo)且可逆的修飾方式。盡管蛋白質(zhì)上的這種修飾豐度極低，但O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)扮演著重要角色，從基因轉(zhuǎn)錄到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期的調(diào)控等都有著O-GlcNAc糖基化修飾蛋白質(zhì)的參與。研究表明蛋白質(zhì)上O-GlcNAc糖基化修飾水平異常與許多人類疾病如神經(jīng)退行性疾病、代謝類疾病及癌癥等密切相關(guān)。鑒于此，對O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行深度鑒定對疾病的發(fā)生發(fā)展、疾病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及治療靶標(biāo)有著深遠(yuǎn)意義。然而由于O-GlcNAc糖基化修飾處于極低的化學(xué)計量水平且O-GlcNAc糖苷鍵易斷裂，對其鑒定手段提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為了提高質(zhì)譜鑒定靈敏度，在質(zhì)譜鑒定前在復(fù)雜生物樣品中對O-GlcNAc糖基化修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行富集是必要步驟。近年來國內(nèi)外發(fā)展了針對O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集方法有：凝集素富集法、抗體富集法、酰肼富集法和代謝標(biāo)簽富集法等。凝集素是一種可以與某種特殊結(jié)構(gòu)單糖或聚糖結(jié)合的糖蛋白，因此可利用凝集素與糖鏈間的親和作用富集糖蛋白/糖肽。但其親和力不足、選擇性有限且偏愛簇生的GlcNAc修飾，因此富集效率低。抗體富集法是基于抗體抗原的特異性結(jié)合進(jìn)行選擇性富集。目前已商業(yè)化的O-GlcNAc修飾的抗體中使用較多的是RL2和CTD110.6，此方法的特異性和富集效率都強(qiáng)于凝集素富集法，但抗體存在底物氨基酸序列依賴性且制備周期長、價格昂貴而難以廣譜性富集所有的O-GlcNAc修飾蛋白/肽段。酰肼富集法是利用氧化劑將O-GlcNAc糖鏈上相鄰的兩個羥基氧化形成醛基再利用其與帶有酰肼基團(tuán)的固相載體共價結(jié)合選擇性富集O-GlcNAc修飾蛋白/肽段，但此方法需要進(jìn)行多步化學(xué)反應(yīng)，且氧化后糖鏈開環(huán)使得糖鏈結(jié)構(gòu)不能完整保留，影響下游對糖鏈的結(jié)構(gòu)解析。代謝標(biāo)簽富集法通過細(xì)胞代謝標(biāo)記在O-GlcNAc修飾上引入疊氮等修飾基團(tuán)再利用生物正交反應(yīng)選擇性富集O-GlcNAc修飾蛋白/肽段。此外，現(xiàn)有O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集載體均為固相材料，在富集時與溶液中的靶分子蛋白形成異相體系，固液界面間的傳質(zhì)阻力和固相材料與目標(biāo)蛋白間的空間位阻等因素都會降低富集反應(yīng)速率和效率。因此需要提供一種新的富集O-GlcNAc修飾蛋白/肽段的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種功能化溫度敏感型聚合物及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明通過自由基聚合反應(yīng)和化學(xué)修飾的方式(三苯基磷基團(tuán)修飾)制備得到功能化溫度敏感型聚合物，能夠?qū)崿F(xiàn)選擇性富集、分離O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)，然后即可利用質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定O-GlcNAc修飾蛋白樣品。

本發(fā)明所提供的功能化溫度敏感型聚合物，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，m為40～280之間的數(shù)，n為140～850之間的數(shù)。

所述功能化溫度敏感型聚合物的數(shù)均分子量可為20000～120000，優(yōu)選50000～60000。

式Ⅰ中，m優(yōu)選為110～140之間的數(shù)，n優(yōu)選為350～420之間的數(shù)。

所述功能化溫度敏感型聚合物的數(shù)均分子量可為。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述功能化溫度敏感型聚合物的制備方法，是以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸甲酯(MA)分別為溫敏單體和功能單體，水合肼(Hydrazine Hydrate)和施陶丁格試劑2-(二苯基磷基)對苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯(2-(Diphenylphosphino)terephthalic acid 1-methyl 4-pentafluorophenyl diester，phosphine-PFP ester)為功能基團(tuán)修飾試劑；經(jīng)自由基聚合反應(yīng)得到溫度敏感型聚合物后，依次加入兩種功能基團(tuán)修飾試劑，對所得溫度敏感型聚合物共價修飾，生成帶有大量三苯基磷基團(tuán)的溫度敏感型聚合物，也即所述功能化溫度敏感型聚合物。具體包括如下步驟：

(1)在引發(fā)劑存在的條件下，溫敏單體和功能單體經(jīng)自由基聚合反應(yīng)得到溫度敏感型聚合物；

所述溫度敏感型聚合物同時帶有溫度響應(yīng)基團(tuán)以及能與水合肼酰肼化的羧基基團(tuán)；

所述溫敏單體為N-異丙基丙烯酰胺；

所述功能單體為丙烯酸甲酯或丙烯酸；

(2)所述溫度敏感型聚合物與水合肼經(jīng)酰肼化反應(yīng)得到酰肼修飾的溫度敏感型聚合物；

(3)所述酰肼修飾的溫度敏感型聚合物與2-(二苯基磷基)對苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯經(jīng)反應(yīng)即得所述功能化溫度敏感型聚合物。

上述的制備方法中，步驟(1)中，所述溫敏單體與所述功能單體的摩爾比可為1：4～4：1，具體可為4：1；

所述引發(fā)劑可為過硫酸鉀、過硫酸銨和過硫酸鈉中任一種；

所述引發(fā)劑的用量可為所述溫敏單體質(zhì)量的5％～50％，具體可為10％；

所述自由基聚合反應(yīng)的溫度可為50～75℃，具體可為60℃，時間可為8～12小時，具體可為8h；

所述自由基聚合反應(yīng)在水與甲醇或異丙醇的混合液中進(jìn)行；

所述自由基聚合反應(yīng)在惰性氣氛中進(jìn)行，如氮?dú)饣驓鍤鈿夥铡?/p>

上述的制備方法中，步驟(2)中，所述水合肼與所述溫度敏感型聚合物的摩爾比可為8：1～2：1，具體可為6：1；

在冰浴條件下將所述溫度敏感型聚合物與所述水合肼混合；

所述酰肼化反應(yīng)的溫度可為20～25℃，時間可為2～6小時，具體可為5小時；

所述酰肼化反應(yīng)在水與甲醇或異丙醇的混合液中進(jìn)行；

所述酰肼化反應(yīng)在惰性氣氛中進(jìn)行，如氮?dú)饣驓鍤鈿夥铡?/p>

上述的制備方法中，步驟(3)對所述酰肼修飾的溫度敏感型聚合物進(jìn)行三苯基磷修飾；

所述酰肼修飾的溫度敏感型聚合物與所述2-(二苯基磷基)對苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯的質(zhì)量比可為1：2～2：1，具體可為2：1；

所述反應(yīng)的溫度可為20～25℃，時間可為24～48小時，具體可為48小時；

所述反應(yīng)在水與N,N-二甲基甲酰肼或二甲基亞砜的混合液中進(jìn)行。

本發(fā)明提供的上述制備方法基于如下原理：

首先在引發(fā)劑存在下將溫敏單體和功能單體通過自由基聚合反應(yīng)得到溫度敏感型聚合物；之后通過酰肼化反應(yīng)將水合肼共價修飾于溫度敏感型聚合物，達(dá)到設(shè)定反應(yīng)時間后通過透析去除殘留反應(yīng)物；之后加入施陶丁格試劑與酰肼修飾的溫度敏感型聚合物混合均勻繼續(xù)反應(yīng)，達(dá)到設(shè)定反應(yīng)時間后通過透析去除殘留反應(yīng)物并進(jìn)行凍干去除溶劑，得到三苯基磷修飾的溫度敏感型聚合物，即功能化溫度敏感型聚合物。

本發(fā)明提供的功能化溫度敏感型聚合物可通過三苯基磷與疊氮基團(tuán)之間高度特異性和生物正交的施陶丁格連接反應(yīng)，對疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾蛋白進(jìn)行選擇性富集，并利用此聚合物的溫度響應(yīng)特性，在富集時完全溶解實(shí)現(xiàn)均相反應(yīng)富集，在回收時沉淀析出實(shí)現(xiàn)異相分離。富集所得的O-GlcNAc修飾蛋白可直接進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，也可酶解得到肽段后將樣品點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀靶上，或進(jìn)樣到液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

將本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物用于O-GlcNAc修飾蛋白富集和/或分離時，可按照如下步驟進(jìn)行：

將含有O-GlcNAc修飾蛋白的樣品與所述功能化溫度敏感型聚合物溶解于緩沖溶液中并充分混合，在室溫下進(jìn)行O-GlcNAc修飾蛋白的富集；之后將溫度升高使所述功能化溫度敏感型聚合物從溶液中析出，并采用離心方式回收所得沉淀；在室溫下使用緩沖溶液溶解聚合物沉淀并充分混合，再次升高溫度沉淀聚合物并離心回收。如此重復(fù)清洗3次，除去樣本中的非O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)和鹽類等雜質(zhì)。對所得O-GlcNAc修飾蛋白進(jìn)行電泳分析或者使用胰蛋白酶酶解后對所得肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析。

上述的富集步驟中，所述功能化溫度敏感型聚合物使用量可為0.4～1.0mg，優(yōu)選1.0mg；

上述的富集步驟中，所述富集的時間可為10～60min，優(yōu)選60min；

所述緩沖溶液為pH為7～8的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液、PBS緩沖溶液和Tris-HCl緩沖溶液中任一種；

所述析出的溫度為32～40℃，優(yōu)選40℃。

本發(fā)明所述功能化溫度敏感型聚合物可對疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾標(biāo)準(zhǔn)蛋白α-crystallin和牛血清白蛋白(質(zhì)量比為1：10)的混合物進(jìn)行富集和/或分離，具體步驟如下：

在室溫下將含有疊氮標(biāo)記O-GlcNAc修飾蛋白的樣品與所述功能化溫度敏感型聚合物使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液溶解并充分混合，使三苯基磷和疊氮基團(tuán)發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)，達(dá)到設(shè)定反應(yīng)時間之后升高溫度至40℃使敏感型聚合物從溶液中析出，并采用離心方式去除沉淀回收上清，對上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。可知，富集后上清中不存在殘留的疊氮標(biāo)記O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)，說明其已全部與功能化溫度敏感型聚合物反應(yīng)并被富集。

本發(fā)明所述功能化溫度敏感型聚合物還可對疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾標(biāo)準(zhǔn)蛋白α-crystallin和牛血清白蛋白(質(zhì)量比為1：100)的混合物進(jìn)行富集和/或分離，具體步驟如下：

在室溫下將含有疊氮標(biāo)記O-GlcNAc修飾蛋白的樣品與所述功能化溫度敏感型聚合物使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液溶解并充分混合，使三苯基磷和疊氮基團(tuán)發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)，達(dá)到設(shè)定反應(yīng)時間之后升高溫度至40℃使溫度敏感型聚合物從溶液中析出，并采用離心方式回收所得沉淀，在室溫下使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液溶解聚合物沉淀并充分混合，再次升高溫度沉淀聚合物并離心回收。如此重復(fù)清洗3次，除去樣本中的非O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)和鹽類等雜質(zhì)，對所得富集了O-GlcNAc蛋白的聚合物樣本使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，將酶解產(chǎn)物肽段進(jìn)行MALDI-TOF-MS表征?？芍?，富集后樣品中的非O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)基本被去除，O-GlcNAc修飾標(biāo)準(zhǔn)蛋白α-crystallin的氨基酸序列覆蓋率顯著提高。

利用本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物對O-GlcNAc修飾蛋白樣品進(jìn)行選擇性富集、分離，然后利用質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定O-GlcNAc修飾蛋白樣品。本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物是通過自由基聚合反應(yīng)和化學(xué)修飾反應(yīng)制備溫度敏感型聚合物并對其進(jìn)行三苯基磷基團(tuán)修飾而得。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1)本發(fā)明溫度敏感型聚合物是通過自由基聚合反應(yīng)得到的線型聚合物，帶有大量的可修飾位點(diǎn)，經(jīng)功能化修飾后得到攜帶大量三苯基磷基團(tuán)的溫度敏感型聚合物；

2)本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物攜帶大量的三苯基磷富集基團(tuán)將增加富集基團(tuán)與O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的碰撞機(jī)率；

3)利用本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物的溫度響應(yīng)特性，通過改變外界溫度準(zhǔn)確控制該溫敏聚合物在水溶液中的溶解性，即富集時完全溶解，回收時沉淀分離，從而實(shí)現(xiàn)了均相反應(yīng)富集和異相分離的效果，與傳統(tǒng)固相材料相比顯著降低了富集反應(yīng)時的固液界面?zhèn)髻|(zhì)阻力和空間位阻，提高了富集速率和效率；

4)本發(fā)明對疊氮標(biāo)記O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的富集原理是基于疊氮與三苯基磷間的施陶丁格連接反應(yīng)，此反應(yīng)生物正交性強(qiáng)，在水溶液中產(chǎn)率高、專一且穩(wěn)定，同時不需要催化劑從而與后續(xù)質(zhì)譜鑒定具有良好的相容性，該方法具有很高的富集效率和選擇性，大幅度提高了混合樣品中低豐度O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)譜鑒定的氨基酸序列覆蓋率。

附圖說明

圖1(a)為本發(fā)明所述功能化溫度敏感型聚合物的合成路線圖；圖1(b)為使用本發(fā)明所述功能化溫度敏感型聚合物富集O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖2為不同分子量功能化溫度敏感型聚合物的溫度響應(yīng)照片。

圖3為溫度敏感型聚合物的X射線光電子能譜分析曲線。藍(lán)色為溫度敏感型聚合物，綠色為酰肼修飾的溫度敏感型聚合物，紅色為三苯基磷修飾的溫度敏感型聚合物。

圖4為不同溫度條件下功能化溫度敏感型聚合物的水合半徑分析曲線。

圖5為功能化溫度敏感型聚合物溫度響應(yīng)及離心沉淀回收響應(yīng)照片。

圖6為功能化溫度敏感型聚合物反復(fù)升降溫后的透光率曲線；

圖7(a)為使用不同質(zhì)量的功能化溫度敏感型聚合物富集疊氮標(biāo)記的α-crystallin和牛血清白蛋白混合物后，上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖7(b)為功能化溫度敏感型聚合物富集疊氮標(biāo)記的α-crystallin，不同富集反應(yīng)時間后上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖7(c)為疊氮標(biāo)記的α-crystallin與牛血清白蛋白的混合物(質(zhì)量比1：10)經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集前后上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

圖8(a)為疊氮標(biāo)記的α-crystallin與牛血清白蛋白的混合物(質(zhì)量比1：100)經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集前，其胰蛋白酶酶解肽段的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖；圖8(b)為樣品經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集前，其酶解肽段MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對牛血清白蛋白的氨基酸序列覆蓋率；圖8(c)為樣品經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集后，富集產(chǎn)物的胰蛋白酶酶解肽段的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖；圖8(d)為樣品經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集后，富集產(chǎn)物的酶解肽段的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對牛血清白蛋白的氨基酸序列覆蓋率；圖8(e)為樣品經(jīng)功能化溫度敏感型聚合物富集后，富集產(chǎn)物的酶解肽段的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對α-crystallin的氨基酸序列覆蓋率。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、功能化溫度敏感型聚合物的制備以及性能測試

功能化溫度敏感型聚合物的合成路線如圖1a)所示。

1)溫度敏感型聚合物的合成：在引發(fā)劑條件下溫敏單體與功能單體進(jìn)行自由基共聚。

具體如下：在100mL圓底燒瓶中加入50mL 50％甲醇，磁力攪拌并通N₂以除盡圓底燒瓶中的O₂，1h后稱取800mg N-異丙基丙烯酰肼快速加入上述燒瓶中，繼續(xù)通N₂ 30min，在N₂氛圍下緩慢加入0.15mL丙烯酸甲酯，通N₂并攪拌30min后，緩慢滴入已由200μL除氧水溶解的80mg過硫酸鉀，通N₂ 30min以保證接下來的自由基聚合反應(yīng)處于N₂氛圍下，撤去N₂裝置，蓋上塞子，封口膜封口，在塞子上插入一個充滿N₂的氣球，60℃反應(yīng)8h。

2)酰肼修飾的溫度敏感型聚合物的合成：利用水合肼的氨基與溫度敏感型聚合物的丙烯酸甲酯基團(tuán)進(jìn)行酰肼化反應(yīng)，從而在溫度敏感型聚合物上引入酰肼基團(tuán)。

具體如下：在冰浴環(huán)境下邊攪拌邊用注射器緩慢滴入1.8mL水合肼(水合肼與溫度敏感型聚合物的摩爾比為6：1)，全部滴完后，在室溫下攪拌反應(yīng)5h，酰肼化反應(yīng)完成后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸以除去其中的有機(jī)溶劑甲醇，旋蒸至燒瓶內(nèi)原來體積的二分之一，將剩余溶液轉(zhuǎn)移至分子量為3KD的透析袋中，透析48h，期間要不斷的更換去離子水，透析結(jié)束后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行濃縮得到白色絮狀固體即酰肼修飾的溫度敏感型聚合物，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3)三苯基磷修飾的溫度敏感型聚合物的合成：利用施陶丁格試劑中的五氟基團(tuán)與酰肼間的共價反應(yīng)在溫度敏感型聚合物上進(jìn)行三苯基磷基團(tuán)的修飾。

具體如下：稱取1g已制備好的酰肼修飾的溫度敏感型聚合物，溶解于2mL的去離子水中，稱取0.5g施陶丁格試劑2-(二苯基磷基)對苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯溶解于500μL N,N-二甲基甲酰肼中，將其與酰肼修飾的溫度敏感型聚合物溶液混合，通N₂ 5min除去O₂后，使用旋轉(zhuǎn)混勻器室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48h，反應(yīng)完成后使用30KD的超濾管進(jìn)行超濾以除去未反應(yīng)的施陶丁格試劑，最后對溶液進(jìn)行冷凍干燥得到白色絮狀固體即三苯基磷修飾的溫度敏感型聚合物，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示，其中，m為110～140之間的數(shù)，n為350～420之間的數(shù)，數(shù)均分子量為50000～60000。

功能化溫度敏感型聚合物富集O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的流程如圖1b)所示。

1)對O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行疊氮標(biāo)記：使用體外酶催化試劑盒按照說明書進(jìn)行標(biāo)記。

具體如下：稱取適量的O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)，用20mMHepes緩沖溶液(pH 7.9)配制成濃度為3.5μgμL^-1的蛋白溶液。

表1疊氮標(biāo)記試劑及用量

按照表1中的順序依次加入試劑盒中各種試劑，且每加一種試劑都要進(jìn)行渦旋使其混合均勻后再加下一種試劑。最后管口封上封口膜，4℃過夜進(jìn)行疊氮標(biāo)記。O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)疊氮標(biāo)記完后，依次在管中加入600μL甲醇，150μL氯仿，400μL去離子水，渦旋混勻，14000g離心5min，用移液槍吸出上層溶液，從而除去過量的UDP-GalNAz，繼續(xù)在管中加入450μL甲醇，渦旋混勻，14000g離心5min，用移液槍吸出上層溶液，用氮?dú)鈱⒍嘤嗟募状即蹈?。最后將上述蛋白溶解?0μL 20MmHepes緩沖溶液(pH 7.9)中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2)富集：基于疊氮與三苯基磷間的施陶丁格反應(yīng)進(jìn)行O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的富集。

具體如下：含有疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的混合蛋白溶解于Hepes緩沖溶液(pH 7.9)中，稱取適量的功能化溫度敏感型聚合物溶解于上述溶液中，渦旋混勻，在室溫下進(jìn)行富集反應(yīng)60min，反應(yīng)完成后利用聚合物的溫度響應(yīng)特性，使用金屬浴加熱至40℃并使用離心機(jī)離心，去除上清并回收沉淀實(shí)現(xiàn)對疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的富集。使用20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)室溫下溶解沉淀并混合均勻后，再升溫并離心，去除上清并回收沉淀聚合物，如此反復(fù)升降溫清洗沉淀3次以去除非特異性吸附的非O-GlcNAc修飾蛋白，實(shí)現(xiàn)O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的高選擇性富集。

對不同引發(fā)劑條件下所制備的溫度敏感型聚合物的分子量進(jìn)行分析，所得結(jié)果如表2，同時對不同分子量的溫度敏感型聚合物進(jìn)行溫度響應(yīng)表征，所得結(jié)果見圖2。

表2不同引發(fā)劑條件下所制備溫度敏感型聚合物的分子量。

研究發(fā)現(xiàn)自由基聚合反應(yīng)中改變引發(fā)劑的量可以改變聚合物的分子量。通過凝膠滲透色譜對合成聚合物分子量進(jìn)行了表征，如表2，引發(fā)劑使用量越少，合成的聚合物分子量越大，反之，引發(fā)劑使用量越多，合成的聚合物分子量越小。同時合成聚合物分子量的大小對其溫度響應(yīng)能力和在分離富集中的應(yīng)用效果有直接影響。若聚合物分子量太小，在溫度高于其最低臨界響應(yīng)溫度時，聚合物鏈不易團(tuán)聚，溫度響應(yīng)不明顯，導(dǎo)致聚合物及其富集靶分子的回收率降低。若聚合物分子量太大，其在水溶液中的溶解度下降，而且空間位阻也會導(dǎo)致富集效率降低。從圖2中看出，分子量越大，當(dāng)改變溫度時溫度響應(yīng)效果越明顯。因此綜合考慮聚合物的水溶性、溫度響應(yīng)兩方面的因素，選擇引發(fā)劑為1mM，分子量為64980的溫度敏感型聚合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對選定分子量的溫度敏感型聚合物進(jìn)行功能化修飾，取上述方法所得各個合成階段的聚合物分別進(jìn)行X射線光電子能譜分析，所得結(jié)果見圖3。

由圖3可知，經(jīng)三苯基磷修飾后的溫度敏感型聚合物(從上之下第1條)在125～130eV處有明顯的磷元素的特征峰出現(xiàn)，前面兩步合成的溫度敏感型聚合物(從上之下第2條)和酰肼修飾的溫度敏感型聚合物(從上之下第3條)在此處沒有P的特征峰出現(xiàn)，由此證明了三苯基磷基團(tuán)已成功修飾到了溫度敏感型聚合物上。

對選定分子量的功能化溫度敏感型聚合物在不同溫度條件下的水合半徑進(jìn)行分析，所得結(jié)果見圖4。

由圖4可知，從31℃左右開始，聚合物的水合半徑隨溫度升高不斷增大，說明聚合物開始團(tuán)聚。隨著溫度的進(jìn)一步升高，聚合物的水合半徑繼續(xù)增大，說明溶液中的聚合物團(tuán)聚規(guī)模進(jìn)一步提高并逐漸從溶液中析出，直至溫度達(dá)到40℃左右，聚合物的水合半徑達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，說明聚合物已從水溶液中完全析出。因此在應(yīng)用該功能化溫度敏感型聚合物對目標(biāo)分子進(jìn)行分離富集時，選擇最適響應(yīng)溫度是40℃。

對選定分子量的功能化溫度敏感型聚合物進(jìn)行溫度響應(yīng)及離心沉淀回收表征，所得結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)環(huán)境溫度低于其最低臨界響應(yīng)溫度時，聚合物鏈的親水性酰肼基團(tuán)可以與水形成氫鍵，從而可以與水相良好的互溶，直觀表現(xiàn)是形成澄清透明的溶液。當(dāng)環(huán)境溫度高于其最低臨界響應(yīng)溫度時，氫鍵逐漸斷裂，疏水性異丙基基團(tuán)暴露在聚合物鏈的外側(cè)，聚合物在水溶液中發(fā)生相轉(zhuǎn)變，從水溶液中析出，生成白色懸濁液。在溫度高于其最低臨界響應(yīng)溫度時進(jìn)行離心，可使聚合物沉于離心管底部。通過此分析，表明了功能化溫度敏感型聚合物具有良好的溫度響應(yīng)特性，而且結(jié)合其溫度響應(yīng)特性及離心技術(shù)可以有效的實(shí)現(xiàn)樣品中靶分子的分離富集。

對選定分子量的功能化溫度敏感型聚合物進(jìn)行反復(fù)升降溫循環(huán)，進(jìn)行不同溶解狀態(tài)下的透光率分析，所得結(jié)果見圖6。

升溫前，聚合物的水溶液為清澈透明，將此時使用紫外-可見分光光度計測得透光率設(shè)為100％；升高溫度至40℃后，聚合物從溶液中析出，溶液變?yōu)榘咨珣覞嵋?，將此時使用紫外-可見分光光度計測得透光率設(shè)為0。由圖6可知，升溫前，聚合物的透光率為100％；升溫后，聚合物的透光率為0。經(jīng)6次反復(fù)升降溫循環(huán)后測定其透光率，與第一個循環(huán)的初始值是一致的。由此說明本發(fā)明溫度敏感型聚合物可以多次重復(fù)使用，其水溶性及溫度響應(yīng)能力并不會降低。

實(shí)施例2、利用實(shí)施例1所得功能化溫度敏感型聚合物對疊氮標(biāo)記O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行富集

1)稱取適量的α-crystallin標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解于20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)配制成濃度為3.5μgμL^-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。使用體外酶催化試劑盒按照說明書加入各種試劑對α-crystallin蛋白4℃過夜進(jìn)行疊氮標(biāo)記。α-crystallin標(biāo)準(zhǔn)蛋白疊氮標(biāo)記完后，依次加入甲醇、氯仿和去離子水使蛋白沉淀，從而除去過量的UDP-GalNAz，用氮?dú)鈱⒍嘤嗟募状即蹈伞Ｗ詈螃?crystallin蛋白溶解于20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)中，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)稱取4份功能化溫度敏感型聚合物，分別為0.4mg、0.6mg、0.8mg和1.0mg，溶解于含有α-crystallin蛋白的20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)中，室溫下混合反應(yīng)0-60min，富集反應(yīng)完成后，升高溫度至40℃使聚合物析出，并快速離心分別回收沉淀和上清液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜分析。

3)通過步驟2)優(yōu)化出功能化溫度敏感型聚合物的最佳使用量和富集反應(yīng)時間后，將疊氮標(biāo)記的α-crystallin或其與牛血清白蛋白的混合物(質(zhì)量比1：10)溶解于20mMHepes緩沖溶液(pH 7.9)中，加入1.0mg功能化溫度敏感型聚合物，室溫下混合反應(yīng)60min。富集反應(yīng)完成后，升高溫度至40℃使聚合物析出，并快速離心去除聚合物及其捕獲O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)，上清液凍干濃縮進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。所得結(jié)果如圖7所示。

由圖(a)可知，當(dāng)使用1.0mg功能化溫度敏感型聚合物時，在上清液中沒有殘留的疊氮標(biāo)記的α-crystallin保留，表明富集完全。且當(dāng)1.0mg功能化溫度敏感型聚合物與未疊氮標(biāo)記的α-crystallin(泳道C)進(jìn)行富集反應(yīng)時，大量的α-crystallin蛋白保留在上清液中，由此證明此富集原理是基于特異性的施陶丁格反應(yīng)而不是非特異性吸附使得疊氮標(biāo)記的α-crystallin被富集出來從而在上清液中去除，同時確定最佳功能化溫度敏感型聚合物使用量為1.0mg進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖(b)可知，隨著富集反應(yīng)時間的延長，疊氮標(biāo)記的α-crystallin在上清液中的殘留不斷減少，富集反應(yīng)時間達(dá)到60min后，上清液中幾乎沒有疊氮標(biāo)記的α-crystallin殘留，因此確定最佳富集反應(yīng)時間為60min。由圖(c)可知，只有疊氮和三苯基磷同時存在時才可以實(shí)現(xiàn)α-crystallin的富集。同時說明此功能化溫度敏感型聚合物的非特異性吸附少，從而實(shí)現(xiàn)在實(shí)際生物樣本中低豐度O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的高特異性和高選擇性富集。

實(shí)施例3、利用實(shí)施例1所得功能性溫度敏感型聚合物進(jìn)行混合樣品中O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)的富集

1)稱取適量的α-crystallin標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解于20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)配制成濃度為3.5μgμL^-1的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。使用體外酶催化試劑盒按照說明書加入各種試劑對α-crystallin蛋白4℃過夜進(jìn)行疊氮標(biāo)記。α-crystallin標(biāo)準(zhǔn)蛋白疊氮標(biāo)記完后，依次加入甲醇、氯仿、去離子水使蛋白沉淀，從而除去過量的UDP-GalNAz，用氮?dú)鈱⒍嘤嗟募状即蹈?。最后?crystallin蛋白溶解于20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)中，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)疊氮標(biāo)記的α-crystallin與牛血清白蛋白的混合(質(zhì)量比1：100)溶解于20mMHepes緩沖溶液(pH 7.9)中，稱取適量的功能化溫度敏感型聚合物溶解于上述溶液中，渦旋混勻，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻器旋轉(zhuǎn)進(jìn)行富集反應(yīng)60min，反應(yīng)完成后利用聚合物的溫度響應(yīng)特性，使用金屬浴加熱至40℃并使用離心機(jī)快速離心，回收沉淀實(shí)現(xiàn)疊氮標(biāo)記的α-crystallin與牛血清白蛋白的分離。使用20mM Hepes緩沖溶液(pH 7.9)，利用聚合物的溫度響應(yīng)特性，采用反復(fù)升降溫溶解-沉淀的方式，清洗3次以去除非特異性吸附的蛋白。

3)將富集到的O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)α-crystallin與功能化溫度敏感型聚合物的偶聯(lián)物重新溶解于含8M尿素的25mM碳酸氫銨溶液中進(jìn)行變性處理，加入二硫蘇糖醇56℃水浴中還原1小時，之后加入碘乙酰胺于暗處放置30min進(jìn)行烷基化處理。取變性蛋白按質(zhì)量比1:50(胰蛋白酶：蛋白質(zhì))加入胰蛋白酶，放置于37℃水浴孵育12小時，得到酶解產(chǎn)物。使用金屬浴升溫至40℃，功能化溫度敏感型聚合物離心析出將聚合物除去，上清液為所富集O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)α-crystallin酶解后的肽段。

4)酶解后的肽段需經(jīng)過C₁₈Zip-Tips脫鹽小柱脫鹽。脫鹽主要步驟為柱體的活化，平衡，上樣，淋洗，洗脫。洗脫液冷凍干燥后，使用0.1％FA溶液重溶，取1μL重溶液體點(diǎn)在基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀靶上，干燥后，點(diǎn)上5μLα-氰基-4-羥基肉桂酸(5mg mL^-1，5％ACN，0.1％FA)作為基質(zhì)，靶上溶液結(jié)晶后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。所得結(jié)果如圖8所示。

由圖可知，從質(zhì)譜圖上明顯觀察到富集前后的變化，富集前譜圖圖8(a)中有大量來自高豐度牛血清白蛋白肽段的質(zhì)譜峰，將譜圖以肽指紋圖譜模式與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，牛血清白蛋白的氨基酸序列覆蓋率高達(dá)90％，如圖8(b)；而α-crystallin肽段的質(zhì)譜峰全部被牛血清白蛋白肽段的信號所掩蓋，無法得到有效鑒定，對應(yīng)的氨基酸序列覆蓋率為0％。富集后的譜圖如圖8(c)，絕大部分牛血清白蛋白肽段被去除，氨基酸序列覆蓋率顯著降低至22％，如圖8(d)；低豐度α-crystallin對應(yīng)肽段的信號得到明顯提升，其中a鏈的氨基酸序列覆蓋率為75％，b鏈達(dá)到91％，如圖8(e)。以上結(jié)果說明本發(fā)明功能化溫度敏感型聚合物可以特異性富集疊氮標(biāo)記的α-crystallin，且非特異性吸附小，具有良好的選擇性和高特異性，由此功能化溫度敏感型聚合物對復(fù)雜樣品中O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)具有明顯富集效果，基本在存在大量非O-GlcNAc修飾蛋白質(zhì)干擾的條件下仍可獲得極高的富集選擇性。