本發(fā)明涉及一種提高淀粉分支酶在大腸桿菌中胞外分泌表達的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術：

淀粉分支酶(branchingenzyme；be；ec2.4.1.18)是一種屬于糖苷水解酶家族13的糖基轉(zhuǎn)移酶，是合成糖原及支鏈淀粉的關鍵酶。經(jīng)淀粉分支酶改性的淀粉具有高支化的特點，因此在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中具有廣闊的應用前景。

淀粉分支酶主要來源于植物，而微生物來源的淀粉分支酶又通常是胞內(nèi)酶，天然菌產(chǎn)酶能力低下，嚴重制約了該酶的發(fā)展應用。為了克服這一缺陷，通過構建基因工程菌實現(xiàn)酶的胞外過量表達是行之有效的途徑之一。通過大腸桿菌bl21(de3)表達的geobacillusthermoglucosidans淀粉分支酶，所得淀粉分支酶基本都在胞內(nèi)，一直未能實現(xiàn)大量的胞外分泌表達，需提從胞內(nèi)提取淀粉分支酶，不可避免地需要破壁，而破壁成本高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于淀粉分支酶的胞內(nèi)表達需破壁，工藝復雜；胞外表達酶活較低。針對這一問題提出一種提高淀粉分支酶在大腸桿菌中胞外分泌表達的方法，通過兩階段變溫誘導提高淀粉分支酶的胞外產(chǎn)量。

本發(fā)明技術方案主要包括以下步驟：

(1)將來源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(geobacillusthermoglucosidans)的成熟淀粉分支酶基因連接質(zhì)粒pet-20b(+)的t7啟動子下游，構建表達載體e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)并轉(zhuǎn)化宿主菌e.colibl21，得到基因工程菌e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)。

(2)將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)，接種入tb培養(yǎng)基發(fā)酵，37℃下培養(yǎng)至發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷，繼續(xù)37℃培養(yǎng)12h，然后降溫至25℃培養(yǎng)12h；或者在加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，調(diào)節(jié)溫度至25℃培養(yǎng)12h，再調(diào)節(jié)溫度為30℃或37℃培養(yǎng)12h；或者在加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，調(diào)節(jié)溫度至30℃培養(yǎng)8～16h，再調(diào)節(jié)溫度為25℃培養(yǎng)8～16h。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過多階段溫度控制策略提高淀粉分支酶的胞外酶活，相對于優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，成本更低；獲得較高的胞外酶活(48.2u/ml)后，避免了菌體破壁，降低了工業(yè)成本；淀粉分支酶產(chǎn)量的提高更利于高支化淀粉的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為在20℃、25℃、30℃、37℃恒溫誘導溫度下的分支酶的胞外分泌(a)與菌體生長(b)情況，其中■：20℃；○：25℃；▲：30℃；▽:37℃。

圖2為在兩階段不同誘導溫度下分支酶的胞外分泌情況，其中a(×)：25℃升溫至30℃(實施例3)；b(●):25℃升溫至37℃(實施例4)；c(▲)：30℃降溫至25℃(實施例5)；d(◆):37℃降溫至25℃(實施例6)。

圖3為在不同時間變溫后分支酶的胞外分泌情況，其中a(×)：30℃誘導12h降溫至25℃后繼續(xù)誘導12h(實施例5)；b(●):30℃誘導24h降溫至25℃后繼續(xù)誘導12h(實施例7)；c(▲)：30℃誘導36h降溫至25℃后繼續(xù)誘導12h(實施例8)。

具體實施方式

實施例1

淀粉分支酶酶活力測定方法:用50mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)配制0.25％(w/v)馬鈴薯支鏈淀粉標準溶液，取0.9ml底物，加入0.1ml發(fā)酵上清液，在50℃下反應15min。反應結(jié)束后沸水浴滅酶10min，并以10000r/min離心2min待顯色用，空白為滅活后的酶。顯色體系為0.3ml反應上清液與5.0ml顯色液(0.05％(w/v)ki，0.005％(w/v)i2，ph7.5)于7ml離心管中混合，顯色15min后在530nm處測定吸光值。

淀粉分支酶酶活定義：常溫下在530nm處，吸光值每分鐘降低1％為一個酶活單位。

實施例2

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，分別在20℃、25℃、30℃、37℃溫度下誘導培養(yǎng)。在20℃、25℃、30℃、37℃誘導溫度下的分支酶的胞外酶活與菌體生長情況如圖1所示。結(jié)果表明發(fā)酵時間為12h時，30℃條件下的酶活最大；進一步發(fā)酵至24h時，25℃條件下的酶活最大，而20℃和37℃均不利于酶的分泌；因此，在25℃恒溫發(fā)酵24h時，酶活最高可達到19.9u/ml。

實施例3

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導溫度至25℃誘導12h后，升高溫度至30℃繼續(xù)誘導12h。結(jié)果如圖2a所示，隨著誘導時間的延長，酶活逐漸增長，變溫誘導24h后獲得最高酶活37.4u/ml。

實施例4

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導溫度至25℃誘導12h后，升高溫度至37℃繼續(xù)誘導12h。結(jié)果如圖2b所示，隨著誘導時間的延長，酶活逐漸增長，在誘導18h后有所降低，因此最高酶活為28.4u/ml。

實施例5

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導溫度至30℃誘導12h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導12h。結(jié)果如圖2c所示，隨著誘導時間的延長，酶活逐漸增長，變溫誘導24h后獲得最高酶活48.2u/ml。

實施例6

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，繼續(xù)37℃誘導12h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導12h。結(jié)果如圖2d所示，隨著誘導時間的延長，酶活逐漸增長，變溫誘導24h后獲得最高酶活45.9u/ml。

實施例7

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導溫度至30℃誘導8h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導16h。結(jié)果如圖3b所示，在誘導8h變溫后，酶活逐漸增長速率加快后有所減慢，最高酶活為42.6u/ml。

實施例8

將保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)進行種子培養(yǎng)8h。按2％的接種量將活化好的種子培養(yǎng)液接入tb培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，待菌體發(fā)酵液吸光值od600達到0.5～0.6，加入誘導劑異丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，調(diào)節(jié)誘導溫度至30℃誘導16h，降低溫度至25℃繼續(xù)誘導8h。結(jié)果如圖3c所示，在誘導16h變溫后，酶活逐漸增長速率加快，最高酶活為40.2u/ml。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。