本發(fā)明涉及天然植物有效成分分離提純領(lǐng)域，具體涉及一種二氫楊梅素的分離純化方法。
背景技術(shù)：
：二氫楊梅素(3,3’,4’,5,5’,7-六羥基-2,3-雙氫黃酮醇，二氫楊梅素)是一種多羥基雙氫黃酮醇，其廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中，尤其在顯齒蛇葡萄植物的幼嫩莖葉中含量更高。藥理研究表明二氫楊梅素具有消炎、抑菌、止咳、鎮(zhèn)痛、消脂及抗脂質(zhì)、保肝護(hù)肝、抗高血壓、抗腫瘤、清除自由基、增強(qiáng)人體免疫力等功效。文獻(xiàn)報道對二氫楊梅素進(jìn)行衍生化亦能發(fā)現(xiàn)更好的活性化合物。隨著二氫楊梅素生物活性研究和衍生化越來越受到重視，高純度的二氫楊梅素需求增加，而市售分析純二氫楊梅素價格昂貴。因二氫楊梅素有2個手性碳，其全合成方法較復(fù)雜。從天然植物中提取純化二氫楊梅素是比較簡單而經(jīng)濟(jì)的方法。國內(nèi)外有部分研究報道利用有機(jī)溶劑提取法和大孔吸附樹脂提取法從藤茶提取物中提取得到二氫楊梅素。而關(guān)于二氫楊梅素純化方面的研究則較少。有報道用重結(jié)晶法和層析分離法制備高純度二氫楊梅素。層析技術(shù)分為吸附樹脂和高效液相制備技術(shù)等。高效液相色譜及高效逆流色譜分離法單次分離的樣品量少，而重結(jié)晶法存在試劑消耗大且收率低的缺點，因此這兩種方法均不合適工業(yè)化生產(chǎn)。目前，尚未有大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)高純度二氫楊梅素的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：以往技術(shù)中二氫楊梅素提純方法往往經(jīng)過6-7次的重結(jié)晶，才能得出含量98％以上的產(chǎn)品，損耗高、得率低。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題旨在提供一種新型的二氫楊梅素的提純方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。具體地，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：(1)溶解和脫色除雜步驟：將二氫楊梅素粗品與水混合，加熱至97-100℃，加入吸附劑進(jìn)行脫色除雜得到濾液；(2)冷卻重結(jié)晶步驟：濾液冷凍至0-4℃，析出晶體，再過濾，得到一次純化晶體濾餅；(3)二次純化步驟：將所述一次純化晶體濾餅與水混合，加熱至97-100℃，冷卻至15-25℃，過濾，烘干得到二氫楊梅素晶體。優(yōu)選的，在步驟(1)中，二氫楊梅素粗品與水的質(zhì)量比為1:(20-30)。優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述加入吸附劑是在二氫楊梅素粗品與水混合進(jìn)行溶解后加入，所述吸附劑為活性炭，所述二氫楊梅素粗品與所述活性炭的質(zhì)量比為1:(0.05-0.1)。優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述加入吸附劑進(jìn)行脫色除雜得到濾液操作過程為：加入吸附劑后進(jìn)行攪拌，然后趁熱過濾得到濾液。優(yōu)選的，在步驟(2)中，所述濾液在0-4℃下靜置8-12h以析出晶體。優(yōu)選的，在步驟(3)中，所述濾餅與水的質(zhì)量比為1:(5-10)。優(yōu)選的，在步驟(1)中，加熱至100℃。優(yōu)選的，在步驟(2)中，冷凍至0℃。優(yōu)選的，在步驟(3)中，在加熱之后冷卻之前進(jìn)行攪拌；所述加熱優(yōu)選加熱至100℃。優(yōu)選的，在步驟(3)中，冷卻至20℃。二氫楊梅素易溶于熱水，熱乙醇及丙酮，溶于乙醇、甲醇，極微溶于醋酸乙酯，在冷水中微溶，不溶于氯仿、石油醚，熔點為245-247℃。本發(fā)明采用二氫楊梅素在熱水中溶解度較大，在冷水中微溶，根據(jù)二氫楊梅素在不同溫度的水中的溶解度的差異來純化二氫楊梅素，用熱水溶解、冷水結(jié)晶，使之不斷提高純度。在利用重結(jié)晶純化二氫楊梅素時，加入一定量活性炭可除掉大部分色素和雜質(zhì)。二次純化時將其部分溶解于較熱的純水中攪拌，二氫楊梅素晶體外面的雜質(zhì)直接溶解于水中，體系里面晶體一部分溶解，同時另一部分析晶，成為一個晶體溶解—結(jié)晶—溶解—結(jié)晶的循環(huán)過程，在此過程中，一般含有雜質(zhì)的晶體會優(yōu)先溶解，因此在二次純化過程中晶體會越來越純化。本發(fā)明所采用的提純方法不用任何有機(jī)溶劑，工藝綠色環(huán)保，僅僅進(jìn)行溶解脫色除雜，重結(jié)晶，然后進(jìn)行二次純化就可以得到含量98％以上的產(chǎn)品，收率高，工藝相對簡單，操作比較方便，適應(yīng)于企業(yè)的放大生產(chǎn)。附圖說明圖1是二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)式；圖2是二氫楊梅素的生產(chǎn)工藝流程示意圖；圖3-1是實施例1中二氫楊梅素一次純化的hplc檢測分析圖；圖3-2是實施例1中二氫楊梅素二次純化的hplc檢測分析圖；圖3-3是實施例2中二氫楊梅素一次純化的hplc檢測分析圖；圖3-4是實施例2中二氫楊梅素二次純化的hplc檢測分析圖；圖3-5是實施例3中二氫楊梅素一次純化的hplc檢測分析圖；圖3-6是實施例3中二氫楊梅素二次純化的hplc檢測分析圖。具體實施方式本發(fā)明提供的純化方法包括將二氫楊梅素粗品與水混合溶解，然后加熱，使二氫楊梅素粗品充分溶解，接著加入活性炭使其吸附色素和雜質(zhì)，趁熱過濾，濾液在0-4℃下保存，靜置8-12h使晶體析出，過濾，濾餅稱重，取樣用hplc檢測測定一次純化得到的二氫楊梅素的純度；然后再用水將所得濾餅溶解，加熱，冷卻至20℃，過濾、烘干，稱重，取樣用hplc檢測測定二次純化后二氫楊梅素的純度。二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)式見圖1。圖2是二氫楊梅素提純的工藝流程圖，先將二氫楊梅素粗品與純水混合進(jìn)行純水溶解，然后進(jìn)行煮沸，充分溶解后加入活性炭脫色除雜，趁熱過濾，接著對濾液進(jìn)行冷卻析晶，過濾，得到一次純化晶體濾餅；然后將所述一次純化晶體濾餅加入水溶解，加熱攪拌，然后冷卻、過濾，接著進(jìn)行烘干，稱重得到二次純化二氫楊梅素晶體。下面通過實施例來具體說明本發(fā)明的二氫楊梅素的分離純化方法，本發(fā)明實施例中所用的儀器與原料如下：表1實施例所使用的儀器表2實施例所用的原料和試劑原料或試劑純度廠家二氫楊梅素粗品50％西安天豐生物科技有限公司乙腈色譜純南京化學(xué)試劑股份有限公司二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品99％泰安市嘉葉生物科技有限公司純水——常規(guī)方法自制具體實施例中所用的檢測方法為hplc檢測方法，具體操作如下：1.對照品的制備準(zhǔn)確稱取二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品5mg，用乙腈配制成濃度梯度為0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)后進(jìn)樣，得到的濃度-峰面積線性回歸方程為:y＝1.002×104x+1.085×104。2.試樣的制備準(zhǔn)確稱取自制二氫楊梅素樣品5mg，以乙腈為溶劑配成濃度為0.5mg/ml的樣品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)后備用。3.色譜條件色譜柱為依利特sinochromods-bp(4.6mm×200mm，5μm)；uv檢測波長為293nm；流動相為a純水，b乙腈，為改善峰形，采用梯度洗脫0～10min10％～100質(zhì)量％b，10～15min100～10質(zhì)量％b；進(jìn)樣量5μl；柱溫為室溫。實施例1二氫楊梅素的提純(1)溶解和脫色除雜步驟：在三口燒瓶中加入二氫楊梅素粗品50g，水1000ml進(jìn)行混合，加熱至100℃，溶解后加入活性炭2.5g進(jìn)行脫色除雜，攪拌0.5h，趁熱過濾，得到濾液；(2)冷卻重結(jié)晶步驟：濾液冷凍至0℃，靜置8h析出晶體，再過濾，得一次純化晶體濾餅，將所述一次純化晶體濾餅稱重，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-1所示；(3)二次純化步驟：在三口燒瓶中加入所述濾餅和250ml水混合，加熱至100℃，攪拌1h，冷卻至20℃，靜置2h，過濾，烘干得到二氫楊梅素晶體，稱重，二氫楊梅素的質(zhì)量為19.0g，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-2所示。實施例2二氫楊梅素的提純(1)溶解和脫色除雜步驟：在三口燒瓶中加入二氫楊梅素粗品50g，水1500ml進(jìn)行混合，加熱至97℃，溶解后加入活性炭2.5g進(jìn)行脫色除雜，攪拌0.5h，趁熱過濾，得到濾液；(2)冷卻重結(jié)晶步驟：濾液冷凍至4℃，靜置12h析出晶體，再過濾，得一次純化晶體濾餅，將所述一次純化晶體濾餅稱重，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-3所示；(3)二次純化步驟：在三口燒瓶中加入所述濾餅和500ml水混合，加熱至97℃，攪拌1h，冷卻至15℃，靜置2h，過濾，烘干得到二氫楊梅素晶體，稱重，二氫楊梅素的質(zhì)量為21.5g，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-4所示。實施例3二氫楊梅素的提純(1)溶解和脫色除雜步驟：在三口燒瓶中加入二氫楊梅素粗品50g，水1250ml進(jìn)行混合，加熱至100℃，溶解后加入活性炭5g進(jìn)行脫色除雜，攪拌0.5h，趁熱過濾，得到濾液；(2)冷卻重結(jié)晶步驟：濾液冷凍至4℃，靜置10h析出晶體，再過濾，得一次純化晶體濾餅，將所述一次純化晶體濾餅稱重，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-5所示；(3)二次純化步驟：在三口燒瓶中加入所述濾餅和500ml水混合，加熱至100℃，攪拌1h，冷卻至25℃，靜置2h，過濾，烘干得到二氫楊梅素晶體，稱重，二氫楊梅素的質(zhì)量為19.5g，取樣進(jìn)行hplc分析，如圖3-6所示。對比例1二氫楊梅素的提純采用與實施例1相同的步驟進(jìn)行提純，與實施例1不同之處僅在于在步驟(1)未加入活性炭進(jìn)行脫色除雜，最后，得到二次純化二氫楊梅素稱重，質(zhì)量為19.2g，并且對得到的一次純化二氫楊梅素晶體和二次純化二氫楊梅素晶體，分別取樣按照與實施例1相同的方法進(jìn)行hplc分析。對比例2二氫楊梅素的提純采用與實施例2相同的步驟進(jìn)行提純，與實施例2不同之處僅在于，未對濾液進(jìn)行冷凍至0-4℃，而是讓濾液冷卻至室溫，最后，得到二次純化二氫楊梅素稱重，質(zhì)量為10.2g，并且對得到的一次純化二氫楊梅素晶體和二次純化二氫楊梅素晶體，分別取樣按照與實施例2相同的方法進(jìn)行hplc分析。表3各實施例和各對比例的一次純化和二次純化的二氫楊梅素的純度及質(zhì)量一次純化(純度)二次純化(純度)二氫楊梅素質(zhì)量(g)實施例192.6％99.6％19.0實施例288.3％98.4％21.5實施例391.9％99.6％19.5對比例183.2％96.12％19.2對比例293％99.52％10.2由表3可以看出，實施例1至實施例3的一次純化和二次純化的純度較高，一次純化的純度在88％以上，二次純化的純度在98％以上，且得到的二氫楊梅素的質(zhì)量在19.0g及以上，而在對比例1中，雖然所得到的二氫楊梅素的質(zhì)量為19.2g，但是在一次純化中，所得到的二氫楊梅素的純度僅為83.2％，在二次純化中，純度為96.12％，對于對比例2，雖然一次純化和二次純化的純度較高，分別為93％和99.52％，但是所得到的二氫楊梅素的質(zhì)量僅為10.2g，收率較低，因此，本發(fā)明的實施例所給出的分離純化方法不僅能夠得到高純度的二氫楊梅素，還能得到高收率的二氫楊梅素，工藝簡單，操作比較方便，大大提高了經(jīng)濟(jì)效益，適應(yīng)于企業(yè)的放大生產(chǎn)。以上所述，僅是本發(fā)明實施的較佳實施例，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12