本申請是中國專利申請cn201080042333.0的分案申請，原申請是國際申請?zhí)杙ct/ca2010/001488于2012年3月22日進(jìn)入中國國家階段的申請。本發(fā)明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(viruslikeparticle，vlp)的方法。
背景技術(shù)：
：目前宿主細(xì)胞(如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物)中的重組表達(dá)策略在培養(yǎng)基中以非常高的水平表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)。使用這些系統(tǒng)獲得了高水平表達(dá)、正確蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與其他組分(dna、囊泡、膜、色素等)分離，所表達(dá)蛋白質(zhì)的純化得以簡化。對于植物或酵母表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)胞壁阻止表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。對抗病毒感染的一種主要方法是通過免疫接種。應(yīng)對流行爆發(fā)或滿足季節(jié)性需求(例如，每年秋季發(fā)生的“流感季”或最近全球爆發(fā)的“豬流感”)的疫苗生產(chǎn)需要在獲知后短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)足量的疫苗。在面對全球流感大流行時(shí)，目前全球的流感疫苗產(chǎn)量可能不足。此外，主導(dǎo)(dominant)流感毒株每年變化，因此在一年中的低需求時(shí)間中儲備是不實(shí)際的。經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模地生產(chǎn)有效的流感疫苗有顯著價(jià)值。病毒樣顆粒(vlp)可用于制備流感疫苗。超結(jié)構(gòu)(suprastructure)(如vlp)模擬病毒衣殼結(jié)構(gòu)，但缺少基因組，從而不能復(fù)制或提供再次感染。vlp刺激強(qiáng)免疫應(yīng)答，為分離(可溶)的重組抗原提供了替代方法。vlp在特定病毒蛋白表達(dá)后進(jìn)行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質(zhì)不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價(jià)結(jié)構(gòu)抗原的呈遞引發(fā)具有均衡的體液和細(xì)胞成分的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答刺激。認(rèn)為優(yōu)于分離抗原產(chǎn)生之刺激的這種改進(jìn)對于包膜病毒尤其適用，因?yàn)榘lp以其天然膜結(jié)合狀態(tài)呈遞表面抗原(grgacic和anderson，2006年，methods40，60-65)。此外，已證明與重組血凝素(ha)(即單體ha，或組成花環(huán)的ha；3-8個(gè)三聚體的ha組裝物)相比，擁有納米顆粒組織結(jié)構(gòu)的流感vlp是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。(bright，r.a.，等，2007，vaccine25，3871-3878)。目前市場上的絕大部分流感疫苗由從蛋中培養(yǎng)之病毒粒獲得的病毒顆?；虿《究乖瓨?gòu)成。來源于蛋的疫苗的生產(chǎn)依賴于在具有胚胎的雞蛋中培養(yǎng)活病毒。在用去污劑化學(xué)滅活和破壞純化的病毒粒后獲得裂解流感疫苗。作為大流行性疫苗產(chǎn)品，重組流感抗原是病毒來源抗原的有效替代品。一旦可獲得新毒株的遺傳構(gòu)成信息，可以使用該信息生產(chǎn)重組抗原，并且其允許快速啟動生產(chǎn)過程。但是，與滅活的裂解流感疫苗相比，純化的重組ha亞基表現(xiàn)出更低的效力，并且需要更高的抗原含量來產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答(treanor等，2007，j.am.med.assoc.297，1577-1582)。已通過在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中共表達(dá)全部10種流感病毒蛋白獲得流感vlp(mena等，1996年，j.virol.70，5016-5024)。幾種病毒蛋白對于vlp的生產(chǎn)是可缺省的，而且在疫苗發(fā)展中已通過共表達(dá)2種主要抗原性包膜蛋白(ha和na)以及m1或者僅共表達(dá)ha和m1生產(chǎn)流感vlp(kang等，2009年，virusres.143，140-146)。chen等(2007年，j.virol.81，7111-7123)證實(shí)單獨(dú)的ha可以驅(qū)動vlp形成和出芽，在他們的系統(tǒng)中可以省去m1共表達(dá)。但是，由于發(fā)現(xiàn)ha與產(chǎn)生vlp的哺乳動物細(xì)胞表面的唾液酸化糖蛋白結(jié)合，所以共表達(dá)了病毒唾液酸酶以使vlp在出芽后從生產(chǎn)細(xì)胞中釋放。期望有更簡單的vlp生產(chǎn)系統(tǒng)(例如依賴于表達(dá)僅一種或幾種病毒蛋白質(zhì)而不需要表達(dá)非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng))以加快疫苗的開發(fā)。在植物系統(tǒng)中生產(chǎn)病毒抗原(包括vlp)提供了這樣的生產(chǎn)優(yōu)勢，既它們可以在溫室或田間培養(yǎng)，不需要無菌組織培養(yǎng)法和處理。pct公開wo2006/119516(williamson和rybicki)公開了在植物中表達(dá)流感病毒a/越南/1194/2004的全長和截短的人密碼子優(yōu)化h5ha。截短的構(gòu)建體缺少膜錨定結(jié)構(gòu)域。通過靶向er的構(gòu)建體獲得最高的ha蛋白積累。缺少膜靶向結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體沒有產(chǎn)生可檢測的ha。沒有報(bào)道vlp的生產(chǎn)情況。之前wo2009/009876和wo2009/076778的發(fā)明人已描述了包含脂質(zhì)包膜的流感havlp的生產(chǎn)(d'aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒，病毒保留脂質(zhì)層或膜可以是有利的。不同系統(tǒng)的脂質(zhì)構(gòu)成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質(zhì)或植物甾醇)，這可有助于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。mason等描述了表達(dá)hbv表面抗原(hbsag)的轉(zhuǎn)基因煙草中包膜vlp的組裝(1992年，proc.natl.acad.sci.usa89，11745-11749)。已證明植物生成的hbvvlp在腸胃外施用時(shí)在小鼠中顯示出誘導(dǎo)強(qiáng)b和t細(xì)胞免疫應(yīng)答((huang等，2005年，vaccine23，1851-1858)，但飼喂實(shí)驗(yàn)的口服免疫僅誘導(dǎo)了中度的免疫應(yīng)答(smith等，2003年，vaccine21，4011-4021)。greco(2007年，vaccine25，8228-8240)證明與hbsag融合的人免疫缺陷病毒(hiv)表位在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥(arabidopsis)中表達(dá)時(shí)累積為vlp，產(chǎn)生了二價(jià)vlp疫苗。在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植株中表達(dá)病毒衣殼蛋白(nvcp)導(dǎo)致無包膜vlp的組裝(mason等，1996年，proc.natl.acad.sci.usa93，5335-5340)。已在農(nóng)桿菌浸潤的本塞姆氏煙草(n.benthamiana)葉中產(chǎn)生了nvcpvlp(huang等2009年，biotechnol.bioeng.103，706-714)，并且在小鼠中證實(shí)了其口服施用后的免疫原性(santi等，2008年，vaccine26，1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751μgvlp形式的nvcp的2或3劑量生馬鈴薯在95％的免疫志愿者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答(tacket等2000年，j.infect.dis.182，302-305)。還由hbv核心抗原(hbcag；huang等，2009年，biotechnol.bioeng.103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(hpv)主要衣殼蛋白l1(varsani等，2003年，arch.virol.148，1771-1786)的表達(dá)獲得了無包膜vlp?？善谕趯lp用于疫苗制備之前從植物或植物物質(zhì)中存在的一些或全部蛋白質(zhì)、碳水化合物等中分離vlp。pct公開wo00/09725(turpen等)描述了一種從植物的細(xì)胞間隙提取蛋白質(zhì)的方法，包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質(zhì)的間質(zhì)液(interstitialfluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過孔的小蛋白質(zhì)(50kda或更小)，但不適于較大超級結(jié)構(gòu)蛋白(superstructureprotein)或蛋白復(fù)合物如vlp。1999年mccormick等(procnatlacadsciusa96：703-708)公開了使用與單鏈fv(scfv)表位融合的大米淀粉酶信號肽將表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向到細(xì)胞外部分(compartment)，隨后通過對葉和莖組織進(jìn)行真空過濾來回收scfv多肽。2008年moehnke等(biotechnollett30：1259-1264)描述了使用mccormick的真空過濾法通過質(zhì)外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。pct公開wo2003/025124(zhang等)公開了在植物中表達(dá)scfv免疫球蛋白，其通過鼠信號序列靶向質(zhì)外體空間?？紤]到vlp和生產(chǎn)它們的植物組織的復(fù)雜性，期望有這樣的vlp制備方法，其中vlp基本上不含植物蛋白質(zhì)或容易與其分離，但仍保留包膜病毒的結(jié)構(gòu)和免疫原特性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(vlp)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及制備包含流感抗原的vlp的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備植物來源的病毒樣顆粒的改進(jìn)方法。本發(fā)明提供了制備植物來源之vlp的方法(a)，包括獲取定位于質(zhì)外體(apoplast)中的包含植物來源之vlp的植物或植物物質(zhì)；產(chǎn)生原生質(zhì)體(protoplast)和質(zhì)外體級分，質(zhì)外體級分包含植物來源的vlp；回收質(zhì)外體級分。該方法還可包括從質(zhì)外體級分純化植物來源之vlp的步驟。植物來源之vlp可以是嵌合的植物來源vlp。植物來源的vlp可選自以下組：病毒包膜蛋白(viralenvelopeprotein)、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白(viralcoatprotein)。植物來源的vlp可以包含流感血凝素。質(zhì)外體和原生質(zhì)體級分可以通過用酶組合物處理植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生。酶組合物可以包括一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包括脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包括添加的脂肪酶或蛋白酶。植物或植物物質(zhì)可以通過種植、收集或者種植并收集植物來獲得。植物物質(zhì)可以包括一部分或整株植物、植物細(xì)胞、葉、莖、根或培養(yǎng)的植物細(xì)胞中的一種或多于一種。本發(fā)明提供了如上所述(方法a)制備植物來源之vlp的方法，其中編碼vlp的核酸以瞬時(shí)方式引入植物，所述vlp選自病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。或者，核酸穩(wěn)定地整合進(jìn)植物基因組。本發(fā)明提供如上所述(方法a)制備植物來源的vlp的方法，其還包括從質(zhì)外體級分純化植物來源的vlp的步驟。純化步驟可以包括通過深層過濾(depthfiltration)來過濾所述質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。不希望被理論所約束，從質(zhì)外體獲取的蛋白質(zhì)較為均一，因?yàn)榉g后修飾蛋白的中間形式或包含在多種細(xì)胞內(nèi)部分進(jìn)行之其他類型的加工的蛋白質(zhì)沒有被共提取。重組蛋白均一性水平更高通常使得包含該蛋白質(zhì)的制劑的質(zhì)量更高，并可生成具有更高的效力、更長的半衰期或更好的免疫力的有益特性的產(chǎn)品。例如，與含有復(fù)合糖基化的蛋白質(zhì)相比，含有高度甘露糖糖基化的血液蛋白在血液循環(huán)中被更快地被清除。產(chǎn)生于質(zhì)外體級分的糖基化蛋白表現(xiàn)出更復(fù)合類型的糖基化。因此，使用本文所述方法(其涉及細(xì)胞壁消化)制備的質(zhì)外體來源蛋白表現(xiàn)出，例如在循環(huán)中更長的半衰期。本發(fā)明還提供了制備包含植物來源之脂質(zhì)包膜的植物來源vlp的方法(b)，所述方法包括獲取包含位于質(zhì)外體之vlp的植物或植物物質(zhì)；用酶組合物處理植物或植物物質(zhì)以產(chǎn)生原生質(zhì)體級分和一種或多于一種質(zhì)外體蛋白組合物；將所述一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物與所述原生質(zhì)體級分分離，其中所述一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物包含vlp。所述酶組合物可以包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物來源的vlp可以是嵌合的植物來源vlp。植物來源的vlp可以選自病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。植物來源的vlp可以包含流感血凝素。本發(fā)明提供了如上所述(方法b)制備植物來源之vlp的方法，其中編碼vlp(選自病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組)的核酸以瞬時(shí)方式引入植物?；蛘?，核酸穩(wěn)定地整合進(jìn)植物基因組。本發(fā)明提供如上所述(方法b)的制備植物來源的vlp的方法，其還包括從質(zhì)外體級分中純化植物來源的vlp的步驟。所述純化步驟可以包括使用深層過濾來過濾質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂層析所述澄清的提取物。植物來源vlp可以包含一種或更多種流感ha多肽。流感ha多肽還可以是嵌合ha多肽。植物來源的vlp還可以包含凝血活性。植物或植物物質(zhì)可以通過培養(yǎng)、收集或者培養(yǎng)并收集植物來獲得。所述植物物質(zhì)可以包括部分或全部植物或者植物細(xì)胞、葉、莖、根或培養(yǎng)的細(xì)胞中的一種或多于一種。本發(fā)明還提供了制備植物來源的vlp的方法(c)，包括獲取包含植物來源的vlp的植物或植物物質(zhì)，用細(xì)胞壁降解酶組合物消化所述植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分，過濾所述消化級分以產(chǎn)生過濾級分，從所述過濾級分中回收植物來源的vlp。所述酶組合物可以包含一種或多于一種果膠酶，一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。此外，如期望，酶組合物不包含脂肪酶或蛋白酶，或該組合物不包含添加的脂肪酶或蛋白酶。植物來源的vlp可以是嵌合的植物來源vlp。植物來源的vlp可以選自病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組。植物來源的vlp可以包含流感血凝素。本發(fā)明提供了如上所述(方法c)制備植物來源之vlp的方法，其中編碼vlp(選自病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白的組)的核酸以瞬時(shí)方式引入植物?；蛘?，核酸穩(wěn)定地整合進(jìn)植物基因組。本發(fā)明提供如上所述(方法c)的制備植物來源的vlp的方法，其還包括將過濾級分中的vlp與細(xì)胞碎片和不溶物質(zhì)分離的步驟。分離步驟可以通過離心、深層過濾或者離心并深層過濾來進(jìn)行以產(chǎn)生澄清的級分。植物來源的vlp可以通過層析來進(jìn)一步純化，例如，澄清的提取物可以使用陽離子交換樹脂來純化。植物來源vlp可以包括包含一種或更多種流感ha多肽的vlp。流感ha多肽還可以是嵌合ha多肽。植物來源的vlp還可以包含凝血活性。植物或植物物質(zhì)可以通過培養(yǎng)、收集或者培養(yǎng)并收集植物來獲得。所述植物物質(zhì)可以包括部分或全部植物或者植物細(xì)胞、葉、莖、根或培養(yǎng)的細(xì)胞中的一種或多于一種。不希望被理論所約束，包含植物來源脂質(zhì)的植物制得的vlp可以誘導(dǎo)比用其他生產(chǎn)系統(tǒng)制得的vlp更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且這些植物制得的vlp誘導(dǎo)的該免疫反應(yīng)比活或減毒全病毒疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強(qiáng)。從宿主細(xì)胞獲得的蛋白提取物成分是復(fù)雜的，并且往往包含與待分離的目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)一起的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)成分。制備質(zhì)外體級分隨后進(jìn)行分離細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和成分的步驟是有利的，因?yàn)槟康牡鞍踪|(zhì)或超結(jié)構(gòu)可以在制造過程中被富集和提高效力。包括更少有效步驟的更簡單過程可以顯著增加產(chǎn)量并且降低成本。還發(fā)現(xiàn)用細(xì)胞壁降解酶消化細(xì)胞壁的過程提高vlp蛋白的產(chǎn)量，即使在原生質(zhì)體在提取過程中不保持完整的情況下也是如此。不希望被理論所約束，細(xì)胞壁消化步驟可松動細(xì)胞壁的多聚成分，并有助于使vlp釋放而非結(jié)合在細(xì)胞壁中。該方案還可以將細(xì)胞內(nèi)成分對vlp的污染降到最低。消化植物細(xì)胞壁的方法是已知的，并且消化細(xì)胞壁的酶混合物(enzymecocktailmixture)可以有所不同。本發(fā)明并不受所用的細(xì)胞壁消化方法限制。與使用勻漿、攪拌(blending)或研磨來制備植物來源之vlp的方法相比，本文所述方法使植物來源的vlp提取物受到更少的破壞和污染。本文所述方法提供植物組織的質(zhì)外體級分并且可以保持原生質(zhì)體及其成分的完整性。本文所述方法即使在原生質(zhì)體或原生質(zhì)體的一部分失去其完整性而不再完整的情況下也能有效純化vlp。與涉及標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)(例如，勻漿、攪拌或研磨)的vlp提取方法相比，這些方法提供更高的vlp產(chǎn)量。更高的產(chǎn)量可以部分歸因于破壞vlp和/或脂質(zhì)包膜之結(jié)構(gòu)完整性的剪切力的減少。從質(zhì)外體級分制備vlp可以是有利的，因?yàn)橘|(zhì)外體級分具有顯著降低的細(xì)胞質(zhì)蛋白或不含細(xì)胞質(zhì)蛋白。因此，在質(zhì)外體級分中將其他蛋白質(zhì)和物質(zhì)(包括ha單體、三聚體或ha片段)與vlp分離可以被容易地實(shí)施。但是，即使原生質(zhì)體制備物或部分原生質(zhì)體制備物是不完整的，vlp的產(chǎn)量增加也可以通過本文所述方法來實(shí)現(xiàn)。與通過標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)獲得的vlp相比，本發(fā)明的vlp的特征還在于顯示出更高的凝血活性。這種改進(jìn)的凝血活性可歸因于完整vlp產(chǎn)量更高(溶液中游離的ha單體或三聚體更少)、具有完整脂質(zhì)包膜的完整vlp產(chǎn)量更高，或其組合。與用全病毒制成的疫苗相比，用vlp制成的疫苗的優(yōu)勢在于它們是無感染性的。因此，不用考慮生物防護(hù)并且這在生產(chǎn)中也是不需要的。植物制備的vlp提供的另外一個(gè)優(yōu)勢是允許在溫室或田間培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)，從而顯著地更加經(jīng)濟(jì)并適于擴(kuò)大規(guī)模。此外，植物不包含參與向蛋白質(zhì)合成或添加唾液酸殘基的酶。vlp可以在沒有神經(jīng)氨酸酶(na)的情況下產(chǎn)生，并且不需要共表達(dá)na或用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)處理生產(chǎn)細(xì)胞或提取以確保植物中的vlp生產(chǎn)。本發(fā)明的該概述并不必然描述本發(fā)明的所有特征。附圖說明本發(fā)明的這些和其他特征將從以下描述中顯而易見，其中參照了以下附圖：圖1顯示了表達(dá)h5a/印度尼西亞/5/05血凝素的基于cpmvht的表達(dá)盒(構(gòu)建體685)。圖2顯示了a)表達(dá)h5/indo(構(gòu)建體編號685)的構(gòu)建體的部分(從paci(35s啟動子上游)到asci(緊鄰nos終止子的下游))核酸序列(seqidno.1)。來自a/印度尼西亞/5/2005的h5的編碼序列以下劃線表示。圖2b顯示了構(gòu)建體編號685編碼的h5a/印度尼西亞/5/05的氨基酸序列(seqidno.2)。圖3顯示了用體積排阻層析(sec)表征的包含血凝素(ha)的結(jié)構(gòu)。離心經(jīng)消化的植物提取物之后，重懸沉淀并通過sec分離。圖3a顯示了每個(gè)級分的總可溶性蛋白質(zhì)含量(實(shí)心三角形；左側(cè)y-軸，最大值％；用bradford法測定)。還顯示了所收集級分(實(shí)心柱；右側(cè)y-軸)的凝血活性。圖3b顯示了sec洗脫級分的sds-page分析結(jié)果。通過丙酮沉淀級分并在分析前用1/40體積的還原性樣品上樣緩沖液重懸。用0.1％的考馬斯r-250溶液對凝膠染色。純化的vlp用作跑膠對照。對應(yīng)于ha0單體的帶用箭頭表示。mw一分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)；c一純化的vlp(對照)；泳道7至10和14至16對應(yīng)于圖3a所示的sec分析洗脫的級分編號。圖4顯示了酶消化和通過comitroltm勻漿器機(jī)械勻漿所獲得的蛋白譜對比。用變性樣品上樣緩沖液處理樣品，通過洗脫級分的sds-page分析分離蛋白質(zhì)。用0.1％的考馬斯r-250溶液對凝膠染色。mw--分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)；泳道1-25μl酶混合物；泳道2-25μl植物組織酶消化物，泳道3一通過comitrol勻漿器獲得的5μl提取物。圖5顯示了ha表達(dá)盒的核酸序列(seqidno：9)，其包括苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動子和5’utr、a/印度尼西亞/5/2005(構(gòu)建體號660)的h5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’utr和終止子序列。圖6顯示了陽離子交換樹脂捕獲的直接來自質(zhì)外體級分的ha-vlp分離物的ha-vlp。樣品用非還原變性樣品上樣緩沖液處理，通過sds-page分離蛋白質(zhì)。用0.1％考馬斯r-250溶液對凝膠染色。泳道1：離心后的質(zhì)外體級分；泳道2-3：連續(xù)微過濾后的質(zhì)外體級分；泳道4：陽離子交換的上樣物；泳道5：陽離子交換的流出級分。泳道6；陽離子交換的洗脫物，濃縮10倍；泳道7：分子量標(biāo)準(zhǔn)(kda)。圖7顯示了h5/indovlp(a)、澄清之后沒有向消化緩沖液中添加nacl的h1/calvlp(b)和進(jìn)行了該添加的h1/calvlp(c)的納米顆粒跟蹤分析(nanoparticletrackinganalysis，nta)譜。nta實(shí)驗(yàn)是用nanosightlm20(nanosight，amesbury，uk)進(jìn)行的。該裝置配備了藍(lán)激光(405nm)、樣品室和viton氟橡膠o型圈。室溫下記錄視頻并用nta2.0軟件分析。樣品記錄60秒。手動選擇快門和增益(gain)以獲得最優(yōu)粒子分辨率。圖8顯示了用不同緩沖液酶消化產(chǎn)生的h3/布里斯班vlp提取物的western印跡結(jié)果。泳道1)純重組ha標(biāo)準(zhǔn)(5μg，immunetechnologycorp.it-003-0042p)，泳道2-5包含7μl如下緩沖液中進(jìn)行的離心酶提取物：泳道2)600mm甘露糖醇+125m檸檬酸鹽+75mmnapo4+25mmedta+0.04％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道3)600mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+50mmedta+0.04％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道4)200mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+25mmedta+0.03％亞硫酸氫鹽(ph6.2)，泳道5)200mm甘露糖醇+125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+50mmedta+0.03％亞硫酸氫鹽(ph6.2)。箭頭代表ha0的免疫檢測信號。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(vlp)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及制備包含流感血凝素(ha)的vlp的方法。以下描述是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明提供了獲取目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的方法。目的蛋白質(zhì)可以存在于質(zhì)外體或細(xì)胞外部分(compartment)中(對應(yīng)于除原生質(zhì)體/原生質(zhì)球(spheroplast)部分之外的植物細(xì)胞部分)。該方法包括去除、消化或者消化并去除包圍植物細(xì)胞的纖維素植物細(xì)胞壁。通過消化細(xì)胞壁，細(xì)胞壁的聚合成分松動，目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)可以更容易地釋放。通過使用該方法，目的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)超結(jié)構(gòu)被富集，這是由于包含的主要宿主細(xì)胞蛋白和成分的原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分與質(zhì)外體分離。如下所述，如果在過程中原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分失去完整性，如果原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分是不完整的，如果來自原生質(zhì)體/原生質(zhì)球部分的部分宿主細(xì)胞蛋白和成分存在于質(zhì)外體級分中，本文提供的方法在獲得目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)方面仍然有效。蛋白超結(jié)構(gòu)的實(shí)例是由2個(gè)或更多個(gè)多肽構(gòu)成的結(jié)構(gòu)；所述多肽可以是相同或不同的；如果是不同的，它們的存在比例可以為約1∶1至約10∶1或更高。蛋白超結(jié)構(gòu)還可以包含一種或更多種脂質(zhì)、磷脂、核酸、膜等。2個(gè)或更多個(gè)多肽可以通過共價(jià)鍵、二硫鍵、電荷相互作用、疏水吸引力、范德華力、氫鍵等連接。蛋白超結(jié)構(gòu)的例子是病毒樣顆粒(vlp)，其可以是包膜或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白或病毒外殼蛋白。本發(fā)明還提供了制備植物來源的病毒樣顆粒(vlp)的方法。該方法包括獲取包含定位于質(zhì)外體中的植物來源vlp的植物或植物物質(zhì)；由植物物質(zhì)產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分和質(zhì)外體級分，質(zhì)外體級分包含植物來源的vlp，以及回收質(zhì)外體級分。如期望的話，可從質(zhì)外體級分中純化植物來源的vlp。本發(fā)明還提供了制備包含植物來源的脂質(zhì)包膜的vlp的方法。該方法包括獲取包含vlp的植物或植物物質(zhì)，用酶組合物處理植物或植物物質(zhì)以產(chǎn)生一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物和原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分，將一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物與原生質(zhì)體級分分離。所述一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物包含含有植物來源的脂質(zhì)包膜的vlp。本發(fā)明還提供了制備植物來源的vlp的方法，其包括獲取包含植物來源的vlp的植物或植物物質(zhì)，用細(xì)胞壁降解酶組合物消化植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分，過濾消化級分以產(chǎn)生過濾級分，和從過濾級分回收植物來源的vlp。在這個(gè)方法中，原生質(zhì)體的完整性可以不是必需的。原生質(zhì)體是完全或部分去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。原生質(zhì)球可以部分去除細(xì)胞壁。原生質(zhì)體、原生質(zhì)球或原生質(zhì)體和原生質(zhì)球(原生質(zhì)體/原生質(zhì)球)均如本文所述使用，并且本文使用的這些術(shù)語是可以互換的?？梢酝ㄟ^機(jī)械方式(例如通過勻漿、攪拌)破碎和去除細(xì)胞壁，可全部或部分地酶消化細(xì)胞壁，或可以通過機(jī)械和酶聯(lián)合的方法去除細(xì)胞壁，例如勻漿之后用酶處理以消化細(xì)胞壁。原生質(zhì)體也可以從培養(yǎng)的植物細(xì)胞獲取，例如從液體培養(yǎng)的植物細(xì)胞或固體培養(yǎng)的植物細(xì)胞。給出植物組織培養(yǎng)物、培養(yǎng)的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體、原生質(zhì)球生產(chǎn)等的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括：introductiontoplanttissueculture，mkrazdan著，第二版(sciencepublishers，2003年；通過引用并入本文)，或例如參見下述url：molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htm。與原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)的生產(chǎn)和操作相關(guān)的方法和技術(shù)綜述于，例如，daveymr等，2005(biotechnologyadvances23：131-171；通過引用并入本文)。給出蛋白生物化學(xué)、分子生物學(xué)等的一般方法與原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括，例如ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork(1998年和2001年的增刊；通過引用并入本文)；sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyork，1989(通過引用并入本文)；kaufman等編.，handbookofmolecularandcellularmethodsinbiologyandmedicine，crcpress，bocaraton，1995(通過引用并入本文)；mcpherson編，directedmutagenesis：apracticalapproach，irlpress，oxford，1991(通過引用并入本文)。消化或降解細(xì)胞壁以釋放原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以包括纖維素酶(ec3.2.1.4)、果膠酶(ec3.2.1.15)、木聚糖酶(ec3.2.1.8)、幾丁質(zhì)酶(ec3.2.1.14)、半纖維素酶或其組合。合適的酶的非限制性實(shí)例包括多組分酶的混合物，其包含纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，例如macerozymetm(約含：纖維素酶：0.1u/mg，半纖維素酶：0.25u/mg，和果膠酶：0.5u/mg)。另一些商業(yè)化酶、酶混合物的例子和供應(yīng)商列于表1(參見：introductiontoplanttissueculture，mkrazdan第二版，sciencepublishers，2003年)。替代性的纖維素酶的名稱和種類包括內(nèi)-1，4-β-d-葡聚糖酶；β-1，4-葡聚糖酶；β-1，4-葡聚糖內(nèi)切水解酶；纖維素酶a；cellulosinap；葡聚糖內(nèi)切酶d，堿性纖維素酶；纖維素酶a3；纖維素糊精酶(celludextrinase)；9.5纖維素酶；微晶纖維素酶；pancellasess和1，4-(1，3；1，4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。替代性的果膠酶(多聚半乳糖醛酸酶)的名稱和種類包括果膠去聚合酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；果膠酶(pectolase)；果膠水解酶；果膠多聚半乳糖醛酸酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；多聚-α-1，4-半乳糖醛酸聚糖水解酶；半乳糖醛酸內(nèi)切酶；內(nèi)-d-半乳糖醛酸酶和多聚(1，4-α-d-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。替代性的木聚糖酶的名稱和種類包括半纖維素酶，內(nèi)-(1→4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-β-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-β-d-木聚糖酶；1，4-β-木聚糖木聚糖水解酶；β-木聚糖酶；β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶；β-d-木聚糖酶。替代性的幾丁質(zhì)酶的名稱和種類包括幾丁質(zhì)糊精酶；1，4-β-多聚-n-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚-β-氨基葡糖苷酶；β-1，4-多聚-n-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚[1，4-(n-乙酰-β-d-氨基葡糖苷酶)]聚糖水解酶。表1：用于原生質(zhì)體分離的市售酶的非限制性實(shí)例特定的酶或酶組合以及濃度和反應(yīng)條件的選擇可取決于用于獲取原生質(zhì)體和包含vlp的質(zhì)外體級分的植物組織的類型。使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的混合物(例如，果膠酶macerozymetm或multifect)的濃度范圍可以是0.01％至2.5％(v/v)，例如0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5％(v/v)或其間任意值。macerozymetm或multifect可以單獨(dú)使用，或與其他酶(例如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或其組合)聯(lián)合使用。使用纖維素酶的濃度范圍可以是0.1％至5％，例如0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0％(w/v)或其間任意值。酶溶液(或稱為細(xì)胞壁降解組合物，消化溶液)通常包含緩沖劑或緩沖體系、滲壓劑和一種或多于一種鹽、二價(jià)陽離子或其他添加劑。選擇緩沖劑或緩沖體系將ph維持在適于酶活性和蛋白或vlp穩(wěn)定性的范圍內(nèi)，以在例如在約ph5.0至約8.0或其間任意值的范圍內(nèi)純化。所選的ph可以根據(jù)待回收的vlp而異，例如ph可以是5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或其間任意ph。緩沖劑或緩沖體系的例子包括但不限于mes、磷酸鹽、檸檬酸鹽等。一種或更多種緩沖劑或緩沖體系可以與酶溶液(消化溶液)組合；一種或更多種緩沖劑存在的濃度可以是0mm至約200mm或其間任意值，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mm或其間任意值。根據(jù)適用程度，如期望的話可以添加滲壓劑成分。選擇滲壓劑及其濃度以提高酶溶液的滲透強(qiáng)度。滲壓劑的例子包括甘露糖醇、山梨醇或其他糖醇，聚合物長度不同的聚乙二醇(peg)等。滲壓劑的濃度范圍根據(jù)植物物種、使用的滲壓劑類型和所選植物組織類型(來源的物種或組織，例如葉或莖)而異——通常范圍為0m至約0.8m，例如0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75m或其間任意值，例如0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600nm甘露糖醇或其間任意值。滲壓劑的濃度也可用百分比(w/v)表示。對于某些植物或組織類型，采用稍高滲的制劑可以是有利的，這可以促進(jìn)植物細(xì)胞的質(zhì)膜與細(xì)胞壁分離。在消化過程中也可以省略滲壓劑。另一個(gè)為植物消化設(shè)置的參數(shù)是溫度。如期望的話，可以在消化過程中控制溫度。有用的溫度范圍應(yīng)在4℃至40℃之間或其間任意溫度，例如約4℃至約15℃或其間任意值，或約4℃至約22℃或其間任意溫度。根據(jù)選擇的溫度，可以調(diào)整其他消化實(shí)驗(yàn)參數(shù)以保持最佳的提取條件?？梢蕴砑雨栯x子、鹽或二者以提高質(zhì)膜穩(wěn)定性，例如濃度為0.5-50mm或其間任意值的二價(jià)陽離子(如ca2+或mg2+)，約0至約750mm或其間任意值(例如10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700或750mm)的鹽(如cacl2、nacl、cuso4、kno3等)?？梢蕴砑拥钠渌砑觿┌蟿?例如但不限于，約0至約200mm或其間任意值(例如5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200mm或其間任意值)的edta、egta)，防止氧化的還原劑(例如但不限于，0.005-0.4％或其間任意值(例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0，25、0.3、0.35、0.4％或其間任意值)的亞硫酸氫鈉或抗壞血酸)，特定的酶抑制劑(參見下文)以及(如期望的話)葉老化抑制劑，例如環(huán)己酰亞胺、激動素或一種或更多種聚胺。消化溶液還可以包含一種或更多種約0至約600mm的甘露糖醇、約0至約500mm的nacl、約0至約50mm的edta、約1％至約2％v/v的纖維素酶、約0至約1％v/v的果膠酶、約0.03至約0.04％的焦亞硫酸鈉、約0至約125mm的檸檬酸鹽或約0至75mm的napo4?？梢蕴幚碇参镂镔|(zhì)以提高酶或酶組合物對植物細(xì)胞壁的接近程度。例如，在用酶組合物處理之前可將葉的表皮去除或“剝離”?？梢詫⒅参镂镔|(zhì)切成小塊(手工地，或用粉碎或切削裝置如urschel切片機(jī))；切碎的植物物質(zhì)可以在部分真空下進(jìn)一步用酶組合物滲透(nishimura和beevers1978年，plantphysiol62：40-43；newell等，1998年，j.expbotany49：817-827)。在酶組合物處理之前或過程中可以對植物組織施加機(jī)械擾動(giridhar等，1989年.protoplasma151：151-157)。另外，可以使用培養(yǎng)的細(xì)胞(無論是液體培養(yǎng)物還是固體培養(yǎng)物)制備原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。期望使用缺少脂肪酶或蛋白酶或者含有滅活的脂肪酶或蛋白酶的酶組合物。在一些實(shí)施方案中，酶組合物中可以包含一種或更多種蛋白酶或脂肪酶抑制劑。脂肪酶抑制劑的例子包括rhc80267(sigmaaldrich)；蛋白酶抑制劑的例子包括e-64、na2edta、胃酶抑素(pepstatin)，抑肽酶(aprotinin)、pmsf，pefabloc、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，bestatin等?？墒褂没旌匣驍嚢杳附M合物中植物物質(zhì)的任何適合方法。例如，植物物質(zhì)可以在碟或盤上或通過旋轉(zhuǎn)搖蕩器輕輕地轉(zhuǎn)動或搖動，在旋轉(zhuǎn)或擺動的圓桶中翻滾。在將原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)從消化液中移出之前應(yīng)小心處理，以將對它們的損傷降低到最低。應(yīng)相應(yīng)地選擇消化容器。作為一個(gè)非限制性的例子，可以使用在500mm甘露糖醇、10mcacl2和5mmmes(ph5.6)中包含1.5％纖維素酶(onozukar-10)和0.375％的macerozymetm的酶組合物來從一些煙草(nicotiana)組織制備原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)。如本文所述，甘露糖醇的濃度也可以為約0至約500mm或其間任意值不等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在知曉本文公開的信息后，可以針對煙草或用于制備vlp的其他物種的年齡和株系決定合適的酶組合物。破碎細(xì)胞壁或部分消化細(xì)胞壁后，獲得原生質(zhì)體級分(包含原生質(zhì)體和/或原生質(zhì)球)和“質(zhì)外體級分”?；蛘撸梢垣@得“消化級分”。如下所述，對于本文所述的蛋白質(zhì)高產(chǎn)量制備，原生質(zhì)體級分的完整性可以不是必需的，因此，可使用質(zhì)外體級分或消化級分提取蛋白質(zhì)，例如但不限于vlp、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白、病毒外殼蛋白?！百|(zhì)外體級分”是指在滲壓劑和/或其他可用于協(xié)助保持原生質(zhì)體完整性的成分的存在下，使用細(xì)胞壁降解酶酶消化或部分酶消化植物物質(zhì)后獲得的級分。質(zhì)外體級分可以包含破碎的原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)產(chǎn)生的一些成分。例如，質(zhì)外體級分可以包含約0至約50％(v/v)或其間任意量的原生質(zhì)體級分的成分，或0、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50％(v/v)或其間任意量的原生質(zhì)體級分的成分。“消化級分”是指使用細(xì)胞壁降解酶酶消化或部分酶消化植物物質(zhì)后剩余的級分，但是，原生質(zhì)體的完整性不是必需的，消化級分可以包含完整的、破碎的或者完整的和破碎的原生質(zhì)體。用于產(chǎn)生消化級分的包含細(xì)胞壁降解酶的組合物可以包含滲壓劑，或者滲壓劑存在的量可以比用于獲得原生質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法中使用的量少，或組合物中不存在滲壓劑。消化級分包含質(zhì)外體級分和原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分，但原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分可以是或不是完整的。消化級分包含細(xì)胞內(nèi)成分和細(xì)胞外成分。如果使用滲壓劑來保持原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的完整性，則可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成分為原生質(zhì)體/原生質(zhì)球形式。如果消化溶液中沒有滲壓劑，則原生質(zhì)體/原生質(zhì)球可能被破壞并且消化級分中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外成分可能合并在一起。如本文所述，可以通過任何合適的技術(shù)從消化級分的成分中分離vlp。不希望被理論所約束，細(xì)胞壁消化步驟可松動細(xì)胞壁的多聚成分并協(xié)助釋放vlp，使它們不會被約束在細(xì)胞壁內(nèi)。該方案也可以最大限度地減少細(xì)胞內(nèi)成分對vlp的污染?？梢栽诿赶笥玫退匐x心然后過濾、深層過濾、沉降、沉淀(例如但不限于硫酸銨沉淀)或其組合來將vlp與細(xì)胞碎片分離，以獲得包含目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的分離級分。如果采用滲壓劑，則可以用任何合適的技術(shù)(例如但不限于離心、過濾、深層過濾、沉降、沉淀或其組合)將原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分或包含原生質(zhì)體的級分與質(zhì)外體級分分離，來獲得包含vlp和/或包含含有vlp之原生質(zhì)體/原生質(zhì)球的分離級分?？梢允褂萌魏魏线m的技術(shù)(例如但不限于離心、過濾、深層過濾、沉降、沉淀或其組合)將原生質(zhì)體(和原生質(zhì)球)級分或包含原生質(zhì)體的級分與質(zhì)外體級分分離，以獲得分離的級分。分離級分可以是例如上清液(如果是離心、沉降或沉淀的話)或?yàn)V液(如果是過濾的話)，并且富含vlp。分離級分可被進(jìn)一步處理，以通過例如另外的離心步驟、沉淀、層析步驟(例如體積排阻、離子交換層析)、切向流過濾或其組合來分離、純化、濃縮(或其組合)vlp。純化的vlp的存在可通過例如非變性page或sds-page、使用合適的檢測抗體的western分析、毛細(xì)管電泳或本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他方法證實(shí)。質(zhì)外體是質(zhì)膜外的植物細(xì)胞部分，并且包含細(xì)胞壁和植物的細(xì)胞間隙。雖然優(yōu)選在消化和進(jìn)一步處理過程中保持原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)的完整性，但對于富集vlp來說，保持原生質(zhì)體完整不是必需的。在合成過程中，vlp被排出到質(zhì)膜外。vlp的平均大小為約20nm至1μm或其間任意量，例如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm，或其間任意量，例如100nm，并且可包含脂質(zhì)膜。由于它們的大小，一旦合成，vlp可能被困于質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間，可能無法使用用于獲得植物蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械方法進(jìn)行分離或進(jìn)一步純化。為了將產(chǎn)量最大化，有利的可以是將細(xì)胞蛋白質(zhì)對vlp級分的污染最小化，保持vlp和(在一些實(shí)施方案中)結(jié)合的脂質(zhì)包膜或膜的完整性，將對原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)的機(jī)械損傷最小化的破壞細(xì)胞壁釋放vlp的方法，例如本文所述的酶法。但是，在處理過程中保持所有的原生質(zhì)體的完整性不是必需的。根據(jù)本發(fā)明的一些方面在植物中產(chǎn)生的vlp可以與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。vlp可以包含ha0前體形式，或者h(yuǎn)a1或ha2結(jié)構(gòu)域通過二硫橋保持在一起的形式。植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層的形式，并且還可以包含圍繞vlp的包膜。植物來源的脂質(zhì)可包括產(chǎn)生vlp之植物的質(zhì)膜脂質(zhì)成分，包括但不限于磷脂酰膽堿(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、鞘糖脂、植物甾醇或其組合。植物來源的脂質(zhì)可互換地稱為‘植物脂質(zhì)’。植物甾醇的例子在本領(lǐng)域已知，包括例如豆甾醇、谷甾醇、24-甲基膽固醇和膽固醇(mongrand等，2004年，j.biolchem279：36277-86)。對于vlp的組裝，期望病毒結(jié)構(gòu)蛋白(如ha)正確折疊并且形成ha三聚體。向?qū)ο笫┯脮r(shí)，相對于施用結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)單體，vlp(尤其是包含植物來源的脂質(zhì)包膜的vlp)可以提供更優(yōu)的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，可以將多肽的表達(dá)靶向植物的任意細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外空間、細(xì)胞器或組織。為了將表達(dá)的多肽定位到特定位置，編碼多肽的核酸可以與編碼信號肽的核酸序列相連。信號肽也可稱為轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號序列。引導(dǎo)表達(dá)的多肽定位于質(zhì)外體的信號肽或肽序列包括但不限于大米淀粉酶信號肽(mccormick1999年，procnatlacadsciusa96：703-708)、氨基酸序列如下的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(pdi)：maknvaifgllfsllllvpsqifaee；seqidno.10，植物發(fā)病相關(guān)蛋白(plantpathogenesisrelatedprotein，prp；szyperski等pnas95：2262-2262)例如煙草植物發(fā)病相關(guān)蛋白2(prp)、人單克隆抗體信號肽(sp)或任何天然血凝素信號肽。在一些例子中，例如多肽在沒有信號肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的情況下表達(dá)并分泌時(shí)，表達(dá)的多肽可以在特定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外空間(如質(zhì)外體)、細(xì)胞器或組織中累積。術(shù)語“病毒樣顆粒”或“vlp”(virus-likeparticle)是指自組裝并且包含病毒表面蛋白(例如流感ha蛋白或嵌合流感ha蛋白)的結(jié)構(gòu)。vlp和嵌合vlp通常在形態(tài)和抗原性上類似于感染中產(chǎn)生的病毒粒，但缺乏足以進(jìn)行復(fù)制的遺傳信息，從而不具備感染性?？梢栽谶m合的宿主細(xì)胞(包括植物宿主細(xì)胞)中生產(chǎn)vlp和嵌合vlp，如期望進(jìn)行進(jìn)一步純化。盡管本文中示例了流感vlp和嵌合流感vlp，本文所述方法可用于定位于或分泌到質(zhì)外體的任何植物來源的vlp?！扒逗系鞍住被颉扒逗隙嚯摹笔侵赴瑑煞N或多于兩種來源(例如但不限于融合為單個(gè)多肽的兩種或更多種流感類型或亞型)的氨基酸序列的蛋白或多肽。嵌合蛋白或多肽可以包含與多肽或蛋白的其余部分相同來源(即天然)或異源的信號肽。嵌合蛋白或嵌合多肽可作為嵌合核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生并保持完整，或如果需要的話，嵌合蛋白或嵌合多肽可以在合成后被切割。完整的嵌合蛋白或嵌合蛋白之經(jīng)切割部分可以結(jié)合形成多聚體蛋白。嵌合蛋白或嵌合多肽還可以包括含有經(jīng)二硫橋連接之亞基的蛋白質(zhì)或多肽(即多聚蛋白)。例如，包含兩種或多于兩種來源的氨基酸序列的嵌合多肽可被加工成亞基，并且所述亞基通過二硫橋相連來形成嵌合蛋白或嵌合多肽。多肽可以是流感血凝素(ha)，并且構(gòu)成多肽的兩種或多于兩種氨基酸序列中的每個(gè)均可獲得自不同的ha，從而產(chǎn)生嵌合ha或嵌合流感ha。嵌合ha還可以包含含有異源信號肽(其在合成后被切割)的氨基酸序列(嵌合ha前體蛋白)?？捎糜诒景l(fā)明的ha蛋白的例子可參見wo2009/009876；wo2009/076778；wo2010/003225(通過引用并入本文)。編碼嵌合多肽的核酸可稱為“嵌合核酸”或“嵌合核苷酸序列”。由嵌合ha構(gòu)成的病毒樣顆?？煞Q為“嵌合vlp”。嵌合vlp還在pct申請?zhí)杙ct/ca2010/000983(于2010年6月25日提交)和美國臨時(shí)申請?zhí)?1/220,161(于2009年6月24日提交；通過引用并入本文)中描述。vlp可從天然或嵌合ha的表達(dá)獲得。按照本發(fā)明提供方法制備的vlp的ha包括已被開發(fā)或鑒定的已知序列和變體ha序列。另外，如本文所述制備的vlp不包含神經(jīng)氨酸酶(na)或其他如m1(m蛋白)、m2、ns等的成分。但是，如果期望獲得包含ha和na的vlp，可以將na和m1與ha共表達(dá)。通常，術(shù)語“脂質(zhì)”指脂溶性(親脂)天然分子。按照本發(fā)明的某些方面在植物中產(chǎn)生的嵌合vlp可以與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層的形式，并且還可以包含圍繞vlp的包膜。植物來源的脂質(zhì)可包括生成vlp的植物的質(zhì)膜脂質(zhì)成分，包括磷脂，三、二和單酸甘油酯以及脂溶性甾醇或包含甾醇的代謝物。例子包括磷脂酰膽堿(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、鞘糖脂、植物甾醇或其組合?；蛘咧参飦碓吹闹|(zhì)可稱為“植物脂質(zhì)”。植物甾醇的例子包括菜油甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麥甾醇、daunosterol、谷甾醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-谷甾醇(mongrand等，2004年，j.biolchem279：36277-86)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的，細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)構(gòu)成可隨獲得細(xì)胞的細(xì)胞或有機(jī)體或物種的培養(yǎng)或生長條件而異。細(xì)胞膜通常包含脂雙層以及多種功能的蛋白質(zhì)。可以在脂雙層中發(fā)現(xiàn)特定脂質(zhì)的局部聚集，稱為‘脂質(zhì)筏‘。這些脂質(zhì)筏微結(jié)構(gòu)域可以富含鞘脂和甾醇。不希望被理論所約束，脂質(zhì)筏可以在胞吞和胞吐、病毒或其他感染物的進(jìn)出、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細(xì)胞或有機(jī)體的其他結(jié)構(gòu)成分(如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì))的相互作用中起重要作用。之前wo2009/009876；wo2009/076778和wo2010/003225(通過引用并入本文)已描述了包含脂質(zhì)包膜的vlp。對于流感病毒，本文所用術(shù)語“血凝素”或“ha”指流感病毒顆粒的結(jié)構(gòu)糖蛋白。本發(fā)明的ha可從任何亞型獲得。例如，ha可以是亞型h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16，或乙型或丙型流感。本發(fā)明的重組ha還可以包含基于任何血凝素序列的氨基酸序列。已很好地研究了流感血凝素的結(jié)構(gòu)，并證明在二級、三級和四級結(jié)構(gòu)上高度保守。甚至可以在氨基酸序列改變的情況下發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)保守性(參見例如，skehel和wiley，2000年annrevbiochem69：531-69；vaccaro等2005年；通過引用并入本文)。編碼ha的核苷酸序列是公知的并且可獲得，例如從生物防御和公眾健康數(shù)據(jù)庫(biodefenseandpublichealthdatabase)(現(xiàn)為流感研究數(shù)據(jù)庫；squires等，2008年nucleicacidsresearch36：d497-d503)例如url為：biohealthbase.org/gsearch/home.do？decorator＝influenza)或由國家生物技術(shù)信息中心維護(hù)的數(shù)據(jù)庫(ncbi；例如url為：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore&cmd＝search&term＝influenza)，兩者均通過引用并入本文。本發(fā)明還涉及制備、分離或者制備并分離vlp的方法，所述vlp包括感染人或宿主動物(例如靈長類動物、馬、豬、鳥、綿羊、鳥類水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動物、狗、貓科動物、貓、虎、豹、麝貓、貂、石貂、雪貂、家養(yǎng)寵物、牲畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等)的病毒的流感vlp。一些流感病毒可以感染多于一種宿主動物。流感病毒血凝素可以耐受氨基酸變化。這種變化提供了不斷被鑒定出的新毒株。新毒株之間感染力可不同。然而，隨后形成vlp的血凝素三聚體的形成被保留。本發(fā)明還包括制備任何植物來源的vlp(無論ha亞型或序列或者形成vlp的嵌合ha或者物種來源為何)的方法。血凝素的正確折疊對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、多聚體的形成、vlp的形成和ha的功能(凝血能力)以及其他流感血凝素特性可以是重要的。蛋白質(zhì)的折疊可被一個(gè)或更多個(gè)因素影響，包括但不限于蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)的相對豐度，細(xì)胞內(nèi)擁擠的程度，可以結(jié)合折疊、部分折疊或未折疊蛋白質(zhì)或與其短暫相關(guān)聯(lián)的輔因子的可利用性，一種或更多種伴侶蛋白的存在等。熱休克蛋白(hsp)或應(yīng)激蛋白是伴侶蛋白的例子，它可參與多種細(xì)胞過程，包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、防止錯(cuò)誤折疊、防止蛋白質(zhì)聚集、蛋白復(fù)合物的組裝和解組裝、蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)解聚。這種伴侶蛋白的例子包括但不限于hsp60、hsp65、hsp70、hsp90、hsp100、hsp20-30、hsp10、hsp100-200、hsp100、hsp90、lon、tf55、fkbp、親環(huán)素、clpp、grpe、泛素、鈣聯(lián)蛋白和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(參見例如，macario，a.j.l.，coldspringharborlaboratoryres.25：59-70.1995年；parsell，d.a.&lindquist，s.ann.rev.genet.27：437-496(1993)；美國專利號5,232,833)。伴侶蛋白(例如但不限于hsp40和hsp70)可用于保證嵌合ha的折疊(pct申請?zhí)杙ct/ca2010/000983，于2010年6月25日提交，美國臨時(shí)申請?zhí)?1/220,161，于2009年6月24日提交；wo2009/009876和wo2009/076778，以上均通過引用并入本文)。還可以使用蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(pdi；登錄號z11499)?；厥蘸?，可通過例如但不限于電子顯微鏡、光散射、體積排阻層析、hplc、western印跡分析或電泳來評估vlp的結(jié)構(gòu)、大小效力或活性。用于評價(jià)vlp的大小、濃度、活性和構(gòu)成的這些和其他評估方法是本領(lǐng)域公知的。對于制備型體積排阻層析，可通過本文所述方法獲得包含vlp的制備物，并且通過離心去除不溶性物質(zhì)。用peg沉淀也可以是有益的。回收的蛋白質(zhì)可通過常規(guī)方法(例如，bradford測定、bca)定量，提取物流經(jīng)體積排阻柱(例如使用sephacryltm、sephadextm或類似基質(zhì))，并且收集級分?？梢杂胋luedextran2000或合適蛋白質(zhì)作為校正標(biāo)準(zhǔn)。還可以將提取物通過陽離子交換柱并且收集活性成分。層析后，可根據(jù)期望通過蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡或兩者來進(jìn)一步分析級分，以確認(rèn)級分中vlp和蛋白質(zhì)補(bǔ)充物的存在?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法，使用凝血測定評估包含vlp之級分的凝血活性。不希望被理論所約束，ha結(jié)合不同動物來源的rbc的能力被ha對唾液酸α2，3或α2，3的親和力和rbc表面上這些唾液酸的存在所驅(qū)動。馬類和禽類的流感病毒ha凝集所有幾種物種(包括火雞、雞、鴨、豚鼠、人、綿羊、馬和牛)的紅細(xì)胞，；而人ha結(jié)合火雞、雞、鴨、豚鼠、人和綿羊的紅細(xì)胞(itot.等，1997年，virology，227：493-499；medeirosr等，2001年.virology289：74-85)。凝血抑制(hi或hai)測定也可用于證實(shí)疫苗或疫苗組合物(包含嵌合ha或可通過重組ha抑制紅細(xì)胞(rbc)凝集的嵌合vlp)所誘導(dǎo)的抗體的效力?？赏ㄟ^微滴定hai(aymard等1973年)評價(jià)血清樣品的凝血抑制性抗體效價(jià)?？梢允褂脦追N物種(例如馬、火雞、雞等)中任意一種的紅細(xì)胞。該測定給出vlp表面ha三聚體組裝的間接信息，以確認(rèn)ha上抗原性位點(diǎn)的正確呈遞。也可使用交叉反應(yīng)性hai效價(jià)證明對與疫苗亞型相關(guān)的其他病毒株的免疫應(yīng)答效力。例如，用包含含有第一流感類型或亞型之hdc的嵌合血凝素的疫苗組合物免疫的對象的血清可用在用第二株完整病毒或病毒顆粒進(jìn)行的hai測試中，并且測定hai效價(jià)。包含vlp的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物物質(zhì)或種子的轉(zhuǎn)化和再生方法已在本領(lǐng)域中建立并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。獲得轉(zhuǎn)化和再生植物的方法并非本發(fā)明的關(guān)鍵?！稗D(zhuǎn)化”是指表現(xiàn)為基因型、表型或兩者兼有的遺傳信息(核苷酸序列)在種間的轉(zhuǎn)移。遺傳信息從嵌合構(gòu)建體到宿主的種間轉(zhuǎn)移可以是可遺傳的(即整合到宿主的基因組中)，并且認(rèn)為遺傳信息的轉(zhuǎn)移是穩(wěn)定的，或者轉(zhuǎn)移可以是瞬時(shí)的而且該遺傳信息的轉(zhuǎn)移是不可遺傳的。術(shù)語“植物物質(zhì)”是指來源于植物的任何材料。植物物質(zhì)可以包括整個(gè)植物、組織、細(xì)胞或任何其部分。此外，植物物質(zhì)可以包括細(xì)胞內(nèi)植物成分、細(xì)胞外植物成分，植物的液體或固體提取物或其組合。另外，植物物質(zhì)可以包括來自植物的葉、莖、果實(shí)、根或其組合的植物、植物細(xì)胞、組織、液體提取物或其組合。植物物質(zhì)可以包括沒有經(jīng)受任何處理步驟的植物或其部分。植物部分可以包括植物物質(zhì)。植物或植物物質(zhì)可以通過任何方法收集或獲得，例如，可使用整個(gè)植株或者特別地移取以用于所述方法的葉或其他組織。表達(dá)和分泌vlp的轉(zhuǎn)基因植物也可以作為本文所述方法的原料使用。本發(fā)明的構(gòu)建體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、滲入等引入植物細(xì)胞。此類技術(shù)的綜述參見例如weissbach和weissbach，methodsforplantmolecularbiology，academypress，newyorkviii，421-463頁(1988年)；geierson和corey，plantmolecularbiology，第二版(1988)；miki和iyer，fundamentalsofgenetransferinplants，plantmetabolism，第二版.dt.dennis，dhturpin，ddlefebrve，dblayzell編，addison-wesley，langmansltd.london，pp.561-579(1997)。其他方法包括直接dna攝取、使用脂質(zhì)體、電穿孔例如用原生質(zhì)體、顯微注射、微彈(microprojectile)或晶須(whisker)和真空滲入。參見例如，bilang等(gene100：247-250(1991年)，scheid等(mol.gen.genet.228：104-112，1991年)，guerche等(plantscience52：111-116，1987年)，neuhause等(theor.applgenet.75：30-36，1987年)，klein等，nature327：70-73(1987年)；howell等(science208：1265，1980年)，horsch等(science227：1229-1231，1985年)，deblock等，plantphysiology91：694-701，1989年)，methodsforplantmolecularbiology(weissbach和weissbach，eds.，academicpressinc.，1988)，methodsinplantmolecularbiology(schuler和zielinski編，academicpressinc.，1989年)，liu和lomonossoff(j.virolmeth，105：343-348，2002年)，美國專利號4,945,050；5,036,006；5,100,792；6,403,865；5,625,136，均通過引用并入本文。可以使用瞬時(shí)表達(dá)法表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體(參見liu和lomonossoff，2002，journalofvirologicalmethods，105：343-348；通過引用并入本文)?；蛘撸梢允褂没谡婵盏乃矔r(shí)表達(dá)方法(描述于pct公開wo00/063400、wo00/037663(通過引用并入本文))。這些方法可以包括，例如但不限于農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入法，但是，還可使用如上所述的其他瞬時(shí)方法。對于農(nóng)桿菌接種或農(nóng)桿菌滲入，包含期望核酸的農(nóng)桿菌(agrobacteria)混合物進(jìn)入組織(例如葉、植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、花))或整個(gè)植株的細(xì)胞間隙。穿過表皮后，農(nóng)桿菌侵染并將t-dna拷貝傳遞進(jìn)細(xì)胞。t-dna被附加轉(zhuǎn)錄并且mrna被翻譯，使得所侵染細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，但t-dna在細(xì)胞核內(nèi)的傳代是瞬時(shí)的。通過本發(fā)明方法制備的流感vlp可與現(xiàn)有流感疫苗聯(lián)合使用，以補(bǔ)充該疫苗使其更為有效或者降低所需的施用劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，疫苗可針對一種或多于一種的流感病毒。合適疫苗的例子包括但不限于，從sanofi-pasteur、idbiomedical、merial、sinovac、chiron、roche、medimmune、glaxosmithkline、novartis、sanofi-aventis、serono、shirepharmaceuticals等購得的那些。如期望的話，本發(fā)明的vlp可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適佐劑相混合。此外，vlp可用于疫苗組合物中，該組合物包含用于治療上述目標(biāo)生物的有效劑量的vlp。另外，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的vlp可與其他蛋白成分共表達(dá)或與其他vlp或流感蛋白質(zhì)成分(例如神經(jīng)氨酸酶(na)、m1和m2)重組。它也可以與其他疫苗蛋白(例如瘧疾抗原、hiv抗原、呼吸道合胞體病毒(rsv)抗原等)制得的vlp共表達(dá)或重組。本文所述的序列總結(jié)如下。本發(fā)明將在下面實(shí)施例中進(jìn)一步說明。然而，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明目的，不應(yīng)以任何方式用于限制本發(fā)明的范圍。表達(dá)盒的組裝可用于生成vlp的構(gòu)建體描述于美國臨時(shí)申請?zhí)?1/220,161(于2009年6月24日提交)、wo2009/009876、wo2009/076778和wo2010/003225，它們均通過引用并入本文。構(gòu)建體還可以包括表2所列的那些。這些構(gòu)建體的組裝描述于wo2009/009876、wo2009/076778、wo2010/003225和us61/220,161。但還可以將包含已知ha的其他構(gòu)建體(包括但不限于表2提供的那些)與相似或不同調(diào)控元件和啟動子相組合使用來生成本文所述的vlp。表2：可用于生成血凝素的構(gòu)建體的非限制性實(shí)例。cpmv-ht表達(dá)盒包含35s啟動子以控制包含目的編碼序列的mrna的表達(dá)，該編碼序列的5’端來自豇豆花葉病毒(cpmv)rna2的核苷酸1-512，其中在115和161位有突變的atg，3’端為來自cpmvrna2(對應(yīng)于3’utr)的核苷酸3330-3481，其后為nos終止子。用質(zhì)粒pbd-c5-1lc(sainsbury等2008年；plantbiotechnologyjournal6：82-92和pct公開wo2007/135480)組裝基于cpmv-ht的血凝素表達(dá)盒。用darveau等(methodsinneuroscience26：77-85(1995))提供的基于pcr的連接方法進(jìn)行cpmvrna2的115和161位atg突變。用pbd-c5-1lc作為模板進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的pcr。第一擴(kuò)增的引物是pbinplus.2613c(seqidno：3)和mut-atg115.r(seqidno：4)。第二擴(kuò)增的引物是mut-atg161.c(seqidno：5)和lc-c5-1.110r(seqidno：6)。然后將兩個(gè)片段混合并作為第三擴(kuò)增的模板，其使用pbinplus.2613c(seqidno：3)和lc-c5-1.110r(seqidno：6)作為引物。用paci和apai消化所得片段并克隆到用同樣的酶消化的pbd-c5-1lc。生成的表達(dá)盒命名為828。cpmv-ht表達(dá)盒中的h5a/印度尼西亞/5/2005(構(gòu)建體號685)的組裝該表達(dá)盒的組裝描述于wo2009/009876、wo2009/076778和wo2010/003325，其通過引用并入本文。簡言之，如下將來自a/印度尼西亞/5/2005的h5編碼序列克隆到cpmv-ht中：用構(gòu)建體號660(d'aoust等，plantbiotechnologyjournal6：930-940(2008))作為模板，以apai-h5(a-indo).1c(seqidno：7)和h5(a-indo)-stui.1707r(seqidno：8)為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以將限制性位點(diǎn)apai(緊鄰起始atg的上游)和stui(緊鄰終止密碼子的下游)添加到血凝素編碼序列。構(gòu)建體660包括苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動子和5'utr、來自a/印度尼西亞/5/2005的h5血凝素編碼序列(構(gòu)建體號660)、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3'utr和終止子序列(seqidno：9；圖5)。用apai和stui限制性酶消化所得片段并克隆到預(yù)先用同樣的酶消化的構(gòu)建體號828中。所得表達(dá)盒命名為構(gòu)建體號685(圖1、2)。沉默抑制子。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)可參與限制植物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，共表達(dá)馬鈴薯y病毒的沉默抑制子(hcpro)可用于對抗轉(zhuǎn)基因mrna的特異性降解(brigneti等，1998年)。替代的沉默抑制子是本領(lǐng)域公知的，并且可如本文所述使用(chiba等，2006年，virology346：7-14；通過引用并入本文)，它們例如但不限于tev-p1/hc-pro(煙草蝕紋病毒(tobaccoetchvirus)-p1/hc-pro)、byv-p21、番茄叢矮病毒(tomatobushystuntvirus)的p19(tbsvp19)、番茄皺縮病毒(tomatocrinklevirus)的衣殼蛋白(tcv-cp)、黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus)的2b；cmv-2b)、馬鈴薯x病毒(potatovirusx)的p25(pvx-p25)、馬鈴薯m病毒(potatovirusm)的p11(pvm-p11)、馬鈴薯s病毒(potatoviruss)的p11(pvs-p11)、藍(lán)莓焦枯病毒(blueberryscorchvirus)的p16(bscv-p16)、柑橘腐根病毒(citrustristezavirus)的p23(ctv-p23)、葡萄卷葉相關(guān)病毒2(grapevineleafroll-associatedvirus-2)的p24(glrav-2p24)、葡萄a(bǔ)病毒(grapevinevirusa)的p10(gva-p10)、葡萄b病毒(grapevinevirusb)的p14(gvb-p14)、獨(dú)活潛伏病毒(heracleumlatentvirus)的p10(hlv-p10)或大蒜普通潛伏病毒(garliccommonlatentvirus)的p16(gclv-p16)。因此，沉默抑制子(例如但不限于hcpro、tev-p1/hc-pro、byv-p21、tbsvp19、tcv-cp、cmv-2b、pvx-p25、pvm-p11、pvs-p11、bscv-p16、ctv-p23、glrav-2p24、gbv-p14、hlv-p10、gclv-p16或gva-p10)可與編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列一起共表達(dá)以進(jìn)一步確保在植物中高水平地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。p19的構(gòu)建描述于wo2010/0003225(通過引用并入本文)。簡言之，通過darveau等(methodsinneuroscience26：77-85(1995))提供的基于pcr的連接法將番茄叢矮病毒(tbsv)p19蛋白的編碼序列連到苜蓿質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒。在第一輪pcr中，用構(gòu)建體660(描述于wo2010/0003225，通過引用并入本文)作為模板，用引物plasto-443c：gtattagtaattagaatttggtgtc(seqidno：11)和supp19-plasto.rccttgtatagctcgttccattttctctcaagatg(seqidno：12)擴(kuò)增質(zhì)體藍(lán)素啟動子區(qū)段。平行地，用引物supp19-1catggaacgagctatacaagg(seqidno：13)和supp19-saci.ragtcgagctcttactcgctttctttttcgaag(seqidno：14)，使用voinnet等(theplantjournal33：949-956(2003年))描述的構(gòu)建體35s：p19作為模板擴(kuò)增包含p19編碼序列的另一片段。然后混合擴(kuò)增產(chǎn)物并作為第二輪擴(kuò)增(組裝反應(yīng))的模板，其中使用引物plasto-443c和supp19-saci.r。用bamhi(在質(zhì)體藍(lán)素啟動子中)和saci(p19編碼序列末端)消化所得片段并克隆到預(yù)先用同樣的限制性酶消化的構(gòu)建體號660中，以得到構(gòu)建體號r472。通過電穿孔(mattanovich等，1989)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(agrobacteiumtumefaciens)(agl1；atcc，manassas，va20108，usa)。通過限制性圖譜確認(rèn)所有根癌農(nóng)桿菌菌株的完整性。包含r472的根癌農(nóng)桿菌菌株被命名為“agl1/r472”。按照hamilton等(2002)所述制備hcpro構(gòu)建體(35hcpro)。測序所有克隆以確認(rèn)構(gòu)建體的完整性。通過電穿孔(mattanovich等，1989)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(agl1；atcc，manassas，va20108，usa)。通過限制性圖譜確認(rèn)所有根癌農(nóng)桿菌株的完整性。植物生物質(zhì)的制備，接種，農(nóng)桿菌滲入和收集在填充有市售泥炭蘚培養(yǎng)基的平地(flat)中從種子培育本塞姆氏煙草(nicotianabenthamiana)植株。以16/8的光周期和白天25℃/夜晚20℃的溫度方案在溫室中培育植株。播種后三周，挑選出單個(gè)苗，移植到花盆里并在相同環(huán)境條件下的溫室中再培育三周。六周后，植株的平均重量為80g，平均高度為30cm。通過d'aoust等2008(plantbiotechnologyjournal6：930-940)描述的方法，用如下所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染(電穿孔)農(nóng)桿菌菌株agl1。在補(bǔ)充有10mm2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)、20μm乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧芐青霉素的yeb培養(yǎng)基(ph5.6)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，至od600為0.6至1.6。在使用前離心農(nóng)桿菌懸液并用滲入介質(zhì)(10mmmgcl2和10mmmesph5.6)重懸。通過d'aoust等(同上)描述的農(nóng)桿菌滲入法處理植株。簡言之，對于真空滲入，離心根癌農(nóng)桿菌懸液，在滲入介質(zhì)中重懸，在4℃儲存過夜。在滲入當(dāng)天，用2.5倍培養(yǎng)體積稀釋培養(yǎng)批次并在使用前溫?zé)?。將整個(gè)本塞姆氏煙草植株倒置在20-40托真空下的氣密不銹鋼罐的細(xì)菌懸液中2分鐘。除另外指出，所有的滲入均為與r472轉(zhuǎn)化細(xì)菌(agl1/r472株)以1∶1的比例共同滲入。真空滲入后，將植株被送回溫室孵育4-6天直到收集。葉的取樣和總蛋白質(zhì)提取(機(jī)械勻漿)孵育4、5、6、7和8天后，收集植株的地上部分并立即使用。在3倍體積的含有1％tritonx-100和0.004％焦亞硫酸鈉的冷50mmtrisph8.0，0.15mnacl中通過勻漿植物組織提取總可溶性蛋白。用polytrontm通過杵臼研磨，或在1體積冷50mmtrisph8，0.15mnacl中用comitroltm對植物組織進(jìn)行機(jī)械勻漿。comitroltm使用的緩沖液也包含0.04％焦亞硫酸鈉。勻漿后，在4℃下以5,000g離心地上植物材料的漿液5分鐘，保留粗提物(上清液)進(jìn)行分析。用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過bradford測定(bio-rad，hercules，ca)檢測澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量。通過細(xì)胞壁消化提取vlp從本塞姆氏煙草植株收集葉組織并切成～1cm2的片。在室溫(rt)下將葉片浸沒于500mm甘露糖醇中30分鐘。然后去除甘露糖醇溶液并換成酶混合物(原生質(zhì)體化溶液(500mm甘露糖醇，10mmcacl2和5mmmes/koh(ph5.6)中的來自綠色木霉的纖維素酶混合物(onozukar-10；3％v/v)和來自根霉屬的果膠酶混合物(macerozymetm；0.75％v/v；均購自yakultpharmaceuticals))。使用的比例為每100ml溶液20g葉片。將該制備物均勻分散到淺容器(～11×18cm)中并用旋轉(zhuǎn)搖床以40rpm和26℃孵育16小時(shí)?；蛘?，vlp提取可按如下方法進(jìn)行：用agl1/#685按照實(shí)施例1所述對植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天從本塞姆氏煙草植株收集葉并切成～1cm2的片。以1∶2.5(w/v)的新鮮生物質(zhì)∶消化緩沖液的比例，將multifect果膠酶fe、multifectcxcg和multifectcxb(genencor)(每個(gè)1.0％(v/v))添加到600mm甘露糖醇，75mm檸檬酸鹽，0.04％亞硫酸氫鈉緩沖液(ph6.0)中。在室溫下用軌道搖床消化生物質(zhì)15小時(shí)。孵育后，通過過濾(250或400μm目的尼龍濾器)去除葉碎片。如下收集懸液中的原生質(zhì)體：以200×g(15分鐘)離心，然后以5000×g(15分鐘)離心上清液以進(jìn)一步澄清上清液。或者，可進(jìn)行5000×g、15分鐘的單個(gè)離心步驟。然后以70,000×g離心70ml上清液30分鐘。所得沉淀用1.7mlpbs重懸并立即分析或凍存。蛋白質(zhì)分析h5的凝血測定基于nayak和reichl(2004)描述的方法。簡言之，在含有100μlpbs的v形底96孔微滴定板中對測試樣品(100μl)進(jìn)行系列兩倍稀釋，每孔留下100μl稀釋的樣品。向每孔加入100μl0.25％火雞紅細(xì)胞懸液(biolinkinc.，syracuse，ny)，在室溫孵育板2小時(shí)。將顯示完全凝血的最高稀釋度的倒數(shù)記錄為凝血活性。平行地，用pbs稀釋重組ha5標(biāo)準(zhǔn)(a/越南/1203/2004h5n1)(proteinsciencecorporation，meriden，ct)，并在每個(gè)板中作為對照。elisa用破碎(用1％tritonx-100處理，隨后在tissuelysertm(qiagen)機(jī)械攪拌1分鐘)的純化病毒樣顆粒制備ha5標(biāo)準(zhǔn)。在4℃用50mm碳酸鹽-碳酸氫鹽包被緩沖液(ph9.6)中的10μg/ml捕獲抗體(immunetechnologycorporation，#it-003-005i)包被u形底96孔微滴定板16-18小時(shí)。用含有0.1％tween-20的0.01mpbs(磷酸鹽緩沖鹽水)(ph7.4)進(jìn)行所有洗滌。孵育后，洗滌微滴定板三次并在37℃下用pbs中的1％酪蛋白封閉1小時(shí)。封閉步驟后，洗滌板三次。用模擬提取物(制備自用單獨(dú)的agl1/r472滲入的葉組織)稀釋ha5標(biāo)準(zhǔn)以獲得500至50ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在加入微孔板之前用1％tritonx-100處理待定量的樣品。在37℃下再孵育板1小時(shí)。洗滌后，加入1∶1000稀釋的針對ha5(cber/fda)的綿羊多克隆抗體，在37℃下孵育板1小時(shí)。洗滌后，加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的兔抗綿羊抗體，在37℃下孵育板1小時(shí)。最后一次洗滌后，在室溫下用surebluetmb過氧化物酶底物(kpl)孵育板20分鐘。加入1nhcl終止反應(yīng)，用multiskanascent讀板器(thermoscientific)測量a450值。實(shí)施例1：酶法提取植物組織釋放相對活性提高的高產(chǎn)量ha。將用本發(fā)明酶提取法獲得之ha的量和相對活性與普通機(jī)械提取法獲得之ha的數(shù)量和相對活性進(jìn)行比較。用agl1/685滲入本塞姆氏煙草植株，5-6天的孵育期后收集葉。如下制備葉勻漿：用polytron勻漿器將2g葉勻漿；用杵臼研磨4g葉；以及用comitroltm處理機(jī)(urschellaboratories)在提取緩沖液(50mmtris，150mmnaclph8.0，比例1∶1w/v)中對25kg葉進(jìn)行勻漿。酶提取如下進(jìn)行：用上述macerozyme果膠酶和onozukar-10纖維素酶消化20g收集的葉。消化后，通過過濾(250μm目的尼龍濾器)去除葉碎片。通過以下去除懸液中的原生質(zhì)體：200×g(15分鐘)離心，然后通過5000×g(15分鐘)離心進(jìn)一步澄清上清液。每個(gè)這些植物提取物中的ha的量和相對活性見表3。與用機(jī)械方法相比，酶提取法獲得的ha的量顯著較多。表3：機(jī)械和酶提取植物葉獲得的ha的相比的量和相對活性。所有的數(shù)據(jù)均被調(diào)整以計(jì)入每個(gè)提取方法添加的液體體積差異。為了本發(fā)明的比較性分析，選擇comitroltm提取法作為標(biāo)準(zhǔn)值。提取方法相對活性量＊comitroltm提取物100％100％polytron提取物50％150％臼提取物100％220％消化提取物440％570％＊通過elisa分析對量進(jìn)行評測實(shí)施例2：用酶消化植物組織所釋放的ha組成vlp用差速離心和體積排阻層析(sec)的組合證實(shí)通過本文所述的酶提取法獲得的ha組成vlp。如實(shí)施例1中所述用agl1/685對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。如實(shí)施例1中所述滲入6天后從植株收集葉并切成～1cm2的片，然后消化、粗濾并離心。然后以70,000×g離心澄清樣品以分離vlp。在上樣到sec柱之前，將包含vlp的離心沉淀小心重懸于1/50體積的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs；0.1m磷酸鈉，0.15mnaclph7.2)中。用平衡/洗脫緩沖液(50mmtris，150mmnacl，ph8)準(zhǔn)備32mlsephacryltms-500高分辨率珠(s-500hr：gehealthcare，uppsala，sweden，cat.no.17-0613-10)的sec柱。將1.5mlvlp樣品上樣到平衡好的柱并用45ml平衡/洗脫緩沖液洗脫來進(jìn)行sec層析。洗脫液收集于1.7ml的級分中，通過將10μl洗脫級分與200μl稀釋的bio-rad蛋白染色劑(bio-rad，hercules，ca)混合來評估每個(gè)級分的蛋白含量。每次分離之前均用bluedextran2000(gehealthcarebio-sciencecorp.，piscataway，nj，usa)進(jìn)行校準(zhǔn)。對于每次分離都比較bluedextran2000和宿主蛋白質(zhì)兩者的洗脫譜，以確保分離的一致性。sec洗脫級分的蛋白質(zhì)分析以牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，用bradford測定(bio-rad，hercules，ca)檢測澄清粗提物的總蛋白含量。用丙酮沉淀存在于sec洗脫級分中的蛋白質(zhì)(bollag等，1996)，用0.25體積或0.05體積的變性上樣緩沖液(0.1mtrisph6.8，0.05％溴酚藍(lán)，12.5％甘油，4％sds和5％β-巰基乙醇)重懸以分別進(jìn)行sds-page分析或免疫印跡分析。在還原條件下通過sds-page進(jìn)行分離，用考馬斯亮藍(lán)r-250對蛋白染色。h5的凝血測定基于nayak和reichl(2004)描述的方法。簡言之，在含有100μlpbs的v形底96孔微滴定板中對測試樣品(100μl)進(jìn)行系列雙倍稀釋，每孔留下100μl稀釋的樣品。向每孔加入100μl0.25％火雞紅細(xì)胞懸液(biolinkinc.，syracuse，ny)，在室溫孵育板2小時(shí)。將顯示完全凝血的最高稀釋度的倒數(shù)記錄為凝血活性。平行地，用pbs稀釋重組h5標(biāo)準(zhǔn)(a/越南/1203/2004h5n1)(proteinsciencecorporation，meriden，ct)，并在每個(gè)板中作為對照。圖3a顯示凝血活性集中在對應(yīng)于柱空隙體積的級分，證明凝血活性來源于高分子量結(jié)構(gòu)組織。sds-page分析(圖3b)表明那些相同的空隙體積級分(級分7-10)也存在最高的ha含量，其中對應(yīng)于ha0單體的條帶在約75kda處可檢測到。實(shí)施例3：植物組織的酶消化釋放具有更少污染物的ha-vlp如實(shí)施例1中所述以agl1/685對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。如實(shí)施例1中所述在滲入后第6天收集葉并切成～1cm2的片，然后消化、粗濾并離心。葉的受控酶消化去除(至少部分地)細(xì)胞壁，從而允許存在于細(xì)胞壁和質(zhì)膜間的間隙中的蛋白質(zhì)和成分釋放入提取基質(zhì)。由于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和成分仍未被破壞并包含在幾乎完整的原生質(zhì)體中，初始的離心步驟可以去除它們，從而提供包含細(xì)胞壁降解酶以及細(xì)胞外植物蛋白質(zhì)和成分(質(zhì)外體級分)的圖4所示的所得溶液。圖4顯示了上述的葉組織受控酶消化后所獲得的溶液的sds-page分析，其中泳道1顯示所用的酶混合物，泳道2顯示酶消化后所得的溶液。泳道3提供從comitroltm得到的粗提物的蛋白質(zhì)含量以供比較。生物質(zhì)：緩沖液的比例對于泳道2的提取物是1∶5(w/v)，對于泳道3是1∶1(w/v)。因此泳道2和3各自包含源自等量起始原料的蛋白。對于大約相同的緩沖液：植物比例，機(jī)械植物提取物包含濃度約3.5-4mg/ml的蛋白質(zhì)，而根據(jù)本發(fā)明方法獲得的酶植物提取物的蛋白質(zhì)濃度約為1mg/ml。發(fā)現(xiàn)泳道3中存在的主要污染物是rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶加氧酶)，它由兩種蛋白亞基形成：大鏈(l，約55kda)和小鏈(s，約13kda)。通常總共八條大鏈二聚體和八條小鏈彼此之間組裝成較大復(fù)合物rubisco540kda。盡管在源自機(jī)械提取法的植物提取物中發(fā)現(xiàn)大量的該植物蛋白污染物(如圖4箭頭所示)，它幾乎在本文所述酶消化法所獲得的植物提取物中不存在。因此，本方法允許在處理的早期去除該主要的植物蛋白污染物以及其他污染物。實(shí)施例4：植物組織的酶消化在可以直接用陽離子交換樹脂捕獲ha-vlp的條件下釋放ha-vlp。按照實(shí)施例1中所述用agl1/685對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片，用軌道搖床室溫消化15小時(shí)。消化緩沖液包含1.0％(v/v)multifect果膠酶fe，1.0％(v/v)multifectcxcg或和1.0％(v/v)multifectcxb(均購自genencor)，每個(gè)均在600mm甘露糖醇，75mm檸檬酸鹽，0.04％亞硫酸氫鈉緩沖液(ph6.0)中，使用1∶2.5(w/v)的生物質(zhì)∶消化緩沖液比例。消化后，將質(zhì)外體級分用400μm尼龍濾器過濾，以去除粗的未消化的植物組織(＜5％的起始生物質(zhì))。然后在室溫下以5000×g離心經(jīng)過濾提取物15分鐘，以去除原生質(zhì)體和細(xì)胞內(nèi)污染物(蛋白質(zhì)、dna、膜、囊泡、色素等)。然后在進(jìn)行層析之前，用0.65μm玻璃纖維濾器(sartopore2/sartoriusstedim)和0.45/0.2μm濾器深層過濾上清液(以澄清)。將澄清的質(zhì)外體級分上樣到用平衡/洗脫緩沖液(50mmnapo4，100mmnacl，0.005％tween80ph6.0)平衡好的陽離子交換柱(poroshsappliedbiosystems)。uv回歸到0后，用包含升高濃度的nacl(500mm)的平衡/洗脫緩沖液分步洗脫提取物。必要時(shí)，使用裝配有10kdamwco的amicontm裝置將層析級分濃縮10倍。蛋白分析按照之前實(shí)施例所述進(jìn)行。在上述條件下，大多數(shù)酶和植物蛋白質(zhì)不與陽離子交換樹脂結(jié)合而ha-vlp結(jié)合，從而在洗脫級分中提供ha-vlp的可觀富集(圖6)。此外，如圖6所示，在ph在7以下時(shí)泳道4和5的纖維素酶和果膠酶不與陽離子交換柱結(jié)合。因此，根據(jù)ha凝血活性，ha-vlp的回收在上樣至陽離子交換柱前為92％，在洗脫級分中為66％。在陽離子交換樹脂的洗脫級分中檢測到純化因子為194。實(shí)施例5：向消化緩沖液中添加nacl按照實(shí)施例1所述用攜帶表達(dá)目的血凝素的構(gòu)建體(h1/calwt，b/flo，h5/indo或h1/calx179a)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實(shí)施例4所述消化(除非以下特別注明)。按照實(shí)施例4所述進(jìn)行過濾、離心和澄清。向消化緩沖液中添加nacl以評估其對ha-vlp回收率的潛在作用。所猜測的優(yōu)點(diǎn)是可能能夠阻止ha非特異性地與澄清過程中去除的植物細(xì)胞或懸液顆粒相關(guān)聯(lián)，以及可對獲得和/或維持和/或提高h(yuǎn)a-vlp的膠體穩(wěn)定性有潛在作用。向消化緩沖液中加入500mmnacl使得在通過離心去除原生質(zhì)體和細(xì)胞碎片之后，每克生物質(zhì)的ha-vlp回收得率提高。但是，該提高只見于h1/calwt和b/flo株，而通過這種方法h5的回收得率并沒有顯著提高(表4)。表4：在消化步驟中添加nacl對ha-vlp回收得率的作用(通過凝血活性單位測量，dil：稀釋度的倒數(shù))1有nacl時(shí)的得率(dil/g)除以無nacl時(shí)的得率(dil/g)對h1/calwt和h1/calx-179a兩毒株，在消化過程中添加500mmnacl進(jìn)一步使消化過程中ha-vlp釋放增加，這繼而導(dǎo)致澄清后的回收得率提高(表5)，但對h5/indo株不是如此。表5：在澄清步驟之后向消化步驟添加nacl對ha-vlp回收得率的作用(通過凝血活性單位測量)1回收率表示為深層過濾后獲得的凝血活性占離心消化提取物的活性的百分比。在酶消化過程中添加和不添加nacl時(shí)，用納米顆粒追蹤分析法(nta)對h5/indo和h1/calwt的ha-vlp的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行了分析(分別見圖7a和7b)。在無nacl時(shí)進(jìn)行消化對于h5觀察到顆粒的單分散制備物，而h1/cal制備物顯示顆粒類型更大的陣列。如圖7c中良好的單分散顆粒分布所示，向消化緩沖液中添加nacl降低h1/calha-vlp的自結(jié)合。通過向消化緩沖液中添加500mmnacl，150nm的h1/calwt-vlp顆粒數(shù)增加(約5倍)。實(shí)施例6：色素的控制釋放按照實(shí)施例1所述用攜帶表達(dá)目的血凝素的構(gòu)建體(h5/indo)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片，并按照實(shí)施例4所述進(jìn)行消化，其中向消化緩沖液中添加500mmnacl或500mmnacl和25mmedta。按照實(shí)施例4所述進(jìn)行過濾、離心和澄清。酶消化步驟中釋放的綠色成分使純化的vlp制備物呈淺綠色。因此研究并調(diào)整細(xì)胞壁消化溶液的成分以獲得綠色減少的vlp純化制備物，從而獲得增加的純度。不希望被理論所約束，由于ca2+在將細(xì)胞壁的中間片層成分保持在一起中起關(guān)鍵作用，并且考慮到植物細(xì)胞壁通常具有高濃度的ca2+這一事實(shí)，添加ca2+-螯合劑edta可促進(jìn)細(xì)胞壁的酶促解聚，從而保留完整的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器(例如葉綠體)，并防止綠色素成分的釋放。見表6，如通過測量制備物吸光度(od672nm-od650nm)差異所評估的，向消化緩沖液中添加25mmedta使純化的h5-vlp制備物的綠色減少。當(dāng)綠色成分大量釋放或未被適當(dāng)去除時(shí)，vlp制備物表現(xiàn)出的δod＞0.040。表6：添加25mmedta至消化緩沖液對h5-vlp產(chǎn)物中的綠色的影響。實(shí)施例7：替代性的消化緩沖液成分按照實(shí)施例1所述用攜帶表達(dá)目的血凝素的構(gòu)建體(h5/indo)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實(shí)施例4所述進(jìn)行消化，其中將消化緩沖液改變?yōu)榘?％、0.25％、0.5％、0.75％或1％v/vmultifect果膠酶fe、multifectcx-cg纖維素酶和multifectcxb纖維素酶(如表7-9所示)。按照實(shí)施例4所述進(jìn)行過濾、離心和澄清。如下表7和8所示，證實(shí)果膠酶在消化緩沖液中不是必需的。在存在或不存在果膠酶的情況下，可以提取到相似水平的h5/indo或h1/calwtvlp。此外，發(fā)現(xiàn)與之前實(shí)施例相比，降低纖維素酶濃度與對提取質(zhì)量沒有顯著的影響(表9)。表7：消化本塞姆氏煙草葉后h5/indovlp的釋放。所有的條件均重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))＊multifectcxgc表8：消化本塞姆氏煙草葉后h1/calwtvlp的釋放。所有的條件均重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))＊multifectcxgc和multifectcxb每個(gè)1％表9：消化本塞姆氏煙草葉后h1/calwtvlp的釋放。所有的條件均進(jìn)行重復(fù)測試。(ha-vlp濃度通過凝血活性檢測，dil：稀釋度的倒數(shù))＊multifectcxgc實(shí)施例8：接近中性ph條件下的酶消化控制消化過程中的ph對于某些vlp的提取可以是關(guān)鍵的?？紤]到消化步驟中發(fā)生的細(xì)胞壁的解聚可以釋放酸性糖，這在適當(dāng)緩沖液溶液的存在下會使溶液酸化(即ph6至5)，并且已證實(shí)某些vlp(如包含h3/bris和b/floha的那些)對輕度酸性環(huán)境有很強(qiáng)的敏感性，所以研究了這種可能的酸化對vlp產(chǎn)率的影響。按照實(shí)施例1所述用攜帶表達(dá)目的血凝素的構(gòu)建體(b/flo、h5/indo、h3/bris)的農(nóng)桿菌株agl1對本塞姆氏煙草植株進(jìn)行農(nóng)桿菌滲入。在滲入后第6天收集葉，切成～1cm2的片并按照實(shí)施例4所述進(jìn)行消化，其中將消化條件改變?yōu)榘?00mmnacl；25或50mmedta；0.03或0.04％硫酸氫鈉；0、100、200或600mm甘露糖醇，75、125或150mm檸檬酸鹽；和/或75mmnapo4；消化緩沖液ph的調(diào)整如表10-14所示。按照實(shí)施例4所述進(jìn)行過濾、離心和澄清。測試不同的消化緩沖液成分是否在酶消化結(jié)束時(shí)達(dá)到約5.5的ph，包括增加的檸檬酸鹽濃度(緩沖能力在ph3.0至5.4之間)和添加磷酸鈉(緩沖能力在ph6.0以上)。表10顯示在消化后ph接近ph6.0時(shí)，來自b株的vlp能夠被更有效地提取。表10：消化緩沖液成分對b/flovlp提取率的影響。1所有緩沖液包含600mm甘露糖醇，焦亞硫酸鈉0.04％然后，檢測了為使最終ph值接近ph6.0而在更高ph起始消化的影響。如表11所示，在這種近中性條件下消化植物細(xì)胞壁是可以的，并未減少h5/indovlp的提取率。表11：消化緩沖液起始ph對h5/indovlp提取率的影響。1所有消化緩沖液包含600mm甘露糖醇，焦亞硫酸鈉0.04％，125mm檸檬酸鹽+75mmnapo4+500mmnacl+25mmedta還表明調(diào)整消化溶液的其他成分對vlp的提取率沒有不利影響。表12顯示了可以對消化溶液進(jìn)行調(diào)整以提高b/flovlp的提取率同時(shí)獲得5.4-5.7的消化后ph。這種調(diào)整包括提高檸檬酸鹽的濃度和添加po4緩沖液。發(fā)現(xiàn)提高edta濃度通常導(dǎo)致更加酸化的提取物和更低的vlp提取率。表12：不同消化緩沖液成分對b/flovlp提取率的影響。1所有緩沖液包含500mmnacl，焦亞硫酸鈉0.04％。進(jìn)一步調(diào)整緩沖液成分以提高h(yuǎn)3/布里斯班vlp的提取率(表13)表13：消化溶液中甘露糖醇和亞硫酸鈉濃度對h3/brisvlp提取率的影響。1所有緩沖液包含125mm檸檬酸鹽，75mmnapo4，500mmnacl，如表12和13所示，甘露糖醇濃度可降至200mm而不顯著影響vlp提取率。進(jìn)一步降低甘露糖醇濃度到100mm甚至完全不將甘露糖醇添加至消化溶液不會顯著影響獲得的ha-vlp水平(表14)。表14：甘露糖醇濃度不同的緩沖液消化生物質(zhì)所釋放的h5/indovlp1所有緩沖液包含75mm檸檬酸鹽ph6.0+焦亞硫酸鈉0.04％。2在不含甘露糖醇(實(shí)驗(yàn)1)和含100mm甘露糖醇(實(shí)驗(yàn)2)的情況下進(jìn)行2個(gè)相比于600mm甘露糖醇的實(shí)驗(yàn)以比較vlp的提取率。實(shí)施例9：酶消化對多種ha-vlp的適用性本文所述的植物生物質(zhì)酶消化法有可能被應(yīng)用到多種ha-vlp的提取中。除了提取之前實(shí)施例所示的包含h5/indo、h1/calwtvlp、h3/bris和b/flo的ha-vlp之外，本文所述方法還適用于季節(jié)性的h1/bris和h1/nc的ha-vlp的提取，如表15所示。表15：消化農(nóng)桿菌滲入的本塞姆氏煙草葉所釋放的季節(jié)性h1/bris和h1/ncvlp。(ha濃度通過凝血活性測量，dil：稀釋度的倒數(shù))所有引用文獻(xiàn)通過引用并入本文，就像指名每個(gè)獨(dú)立出版物專門并單獨(dú)地通過引用并入本文并在本文中給出全文那樣。本文引用的參考文獻(xiàn)不應(yīng)理解為或視為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。已通過示例方式描述了一個(gè)或多個(gè)目前優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案。本發(fā)明包括基本如上所述并且參照實(shí)施例和附圖的所有實(shí)施方案、改變和變化。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，大量的變化和改變可在不偏離本發(fā)明權(quán)利要求所限定范圍的情況下獲得。這些修改的例子包括用已知的等同方案替換本發(fā)明的任何方面以實(shí)質(zhì)相同的方式獲得同樣的結(jié)果。以下部分對應(yīng)于母案申請的原始權(quán)利要求書：1.制備植物來源的vlp的方法，其包括：a.獲取包含定位于質(zhì)外體的vlp的植物或植物物質(zhì)，b.產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分和質(zhì)外體級分；和，c.回收所述質(zhì)外體級分，所述質(zhì)外體級分包含所述植物來源的vlp。2.項(xiàng)1的方法，其中在所述產(chǎn)生步驟(步驟b)中，通過用細(xì)胞壁降解酶組合物處理所述植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生所述質(zhì)外體級分和原生質(zhì)體級分。3.項(xiàng)2的方法，其中所述細(xì)胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。4.項(xiàng)3的方法，其中所述細(xì)胞壁降解酶組合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。5.項(xiàng)1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物：病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質(zhì)。6.項(xiàng)5的方法，其中所述核酸以瞬時(shí)方式引入所述植物中。7.項(xiàng)5的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進(jìn)所述植物的基因組。8.項(xiàng)1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養(yǎng)所述植物并收集所述植物或植物物質(zhì)。9.項(xiàng)5的方法，其中所述核酸編碼流感血凝素。10.項(xiàng)1的方法，其中所述植物來源的vlp不包含神經(jīng)氨酸酶或m蛋白。11.項(xiàng)1的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)的植物細(xì)胞的組。12.項(xiàng)1的方法，其還包括步驟d)從所述質(zhì)外體級分中純化所述植物來源的vlp。13.項(xiàng)12的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。14.制備包含植物來源之脂質(zhì)包膜的植物來源vlp的方法，其包括：a.獲取包含定位于質(zhì)外體的vlp的植物或植物物質(zhì)，b.用酶組合物處理所述植物或植物物質(zhì)，以產(chǎn)生原生質(zhì)體/原生質(zhì)球級分和一種或多于一種包含所述vlp的質(zhì)外體蛋白復(fù)合物；以及c.將所述一種或多于一種質(zhì)外體蛋白復(fù)合物與所述原生質(zhì)體級分分離。15.項(xiàng)14的方法，其中所述酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。16.項(xiàng)14的方法，其中所述酶組合物不包含脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。17.項(xiàng)14的方法，其還包括步驟d)從所述質(zhì)外體級分中純化所述植物來源的vlp。18.項(xiàng)17的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質(zhì)外體級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。19.項(xiàng)14的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物：病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質(zhì)。20.項(xiàng)19的方法，其中所述核酸以瞬時(shí)方式引入所述植物中。21.項(xiàng)19的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進(jìn)所述植物的基因組。22.項(xiàng)14的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養(yǎng)所述植物并收集所述植物或植物物質(zhì)。23.項(xiàng)19的方法，其中所述vlp包含流感血凝素。24.項(xiàng)14的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)的植物細(xì)胞的組。25.項(xiàng)14的方法，其中所述vlp不包含神經(jīng)氨酸酶或m蛋白。26.制備植物來源的vlp的方法，其包括：a.獲取包含植物來源的vlp的植物或植物物質(zhì)；b.用細(xì)胞壁降解酶組合物消化所述植物物質(zhì)以產(chǎn)生消化級分；c.過濾所述消化級分以產(chǎn)生過濾級分，從所述過濾級分中回收所述植物來源的vlp。27.項(xiàng)26的方法，其中所述細(xì)胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。28.項(xiàng)27的方法，其中所述細(xì)胞壁降解酶組合物包含一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶，或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。29.項(xiàng)27的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼選自以下組的蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物：病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質(zhì)。30.項(xiàng)29的方法，其中所述核酸以瞬時(shí)方式引入所述植物中。31.項(xiàng)29的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進(jìn)所述植物的基因組。32.項(xiàng)29的方法，其中所述植物來源的vlp包含流感血凝素。33.項(xiàng)27的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)的植物細(xì)胞的組。34.項(xiàng)26的方法，其還包括步驟d)將所述過濾級分中的vlp與細(xì)胞碎片和不溶物質(zhì)分離開。35.項(xiàng)34的方法，其中所述分離步驟通過離心進(jìn)行。36.項(xiàng)34的方法，其中所述分離步驟通過深層過濾進(jìn)行。37.項(xiàng)27的方法，其還包括步驟d)從所述過濾級分中純化所述植物來源的vlp。38.項(xiàng)34的方法，其中所述純化步驟包括深層過濾所述過濾級分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。<110>medicagoinc.vezina,louis-philippedargis,michelecouture,manonpaquet,danyd'aoust,marc-andre<120>制備植物來源的vlp的方法<130>v82324wo<150>61/244,786<151>2009-09-22<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>3067<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的構(gòu)建體685<400>1ttaattaagaattcgagctccaccgcggaaacctcctcggattccattgcccagctatct60gtcactttattgagaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcg120ataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccc180cacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtgg240attgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaag300acccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggtattaaaatcttaataggt360tttgataaaagcgaacgtggggaaacccgaaccaaaccttcttctaaactctctctcatc420tctcttaaagcaaacttctctcttgtctttcttgcgtgagcgatcttcaacgttgtcaga480tcgtgcttcggcaccagtacaacgttttctttcactgaagcgaaatcaaagatctctttg540tggacacgtagtgcggcgccattaaataacgtgtacttgtcctattcttgtcggtgtggt600cttgggaaaagaaagcttgctggaggctgctgttcagccccatacattacttgttacgat660tctgctgactttcggcgggtgcaatatctctacttctgcttgacgaggtattgttgcctg720tacttctttcttcttcttcttgctgattggttctataagaaatctagtattttctttgaa780acagagttttcccgtggttttcgaacttggagaaagattgttaagcttctgtatattctg840cccaaatttgtcgggcccatggagaaaatagtgcttcttcttgcaatagtcagtcttgtt900aaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaattcaacagagcaggttgacaca960atcatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaac1020gggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttaagagattgtagtgtagct1080ggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtaccggaatggtcttac1140atagtggagaaggccaatccaaccaatgacctctgttacccagggagtttcaacgactat1200gaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcaaatcatcccc1260aaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggagttagctcagcatgtccatacctg1320ggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacataccca1380acaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaggatcttttggtactgtggggaatt1440caccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatatcaaaacccaaccacctatatt1500tccattgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaaaaatagctactagatccaaa1560gtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaacctaatgatgca1620atcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaag1680aaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgt1740caaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattccacaacatacaccctctcacc1800atcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcaacagggctcaga1860aatagccctcaaagagagagcagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggt1920tttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaat1980gagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtc2040accaataaggtcaactcaatcattgacaaaatgaacactcagtttgaggccgttggaagg2100gaatttaataacttagaaaggagaatagagaatttaaacaagaagatggaagacgggttt2160ctagatgtctggacttataatgccgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactcta2220gactttcatgactcaaatgttaagaacctctacgacaaggtccgactacagcttagggat2280aatgcaaaggagctgggtaacggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgt2340atggaaagtataagaaacggaacgtacaactatccgcagtattcagaagaagcaagatta2400aaaagagaggaaataagtggggtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtca2460atttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatgatggctggtctatcttta2520tggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaaaggcctattttcttt2580agtttgaatttactgttattcggtgtgcatttctatgtttggtgagcggttttctgtgct2640cagagtgtgtttattttatgtaatttaatttctttgtgagctcctgtttagcaggtcgtc2700ccttcagcaaggacacaaaaagattttaattttattaaaaaaaaaaaaaaaaaagaccgg2760gaattcgatatcaagcttatcgacctgcagatcgttcaaacatttggcaataaagtttct2820taagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacg2880ttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatga2940ttagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaact3000aggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagattctagagtctcaagcttcg3060gcgcgcc3067<210>2<211>568<212>prt<213>人工序列<220><223>由seqidno:1編碼的合成的氨基酸<400>2metglulysilevalleuleuleualailevalserleuvallysser151015aspglnilecysileglytyrhisalaasnasnserthrgluglnval202530aspthrilemetglulysasnvalthrvalthrhisalaglnaspile354045leuglulysthrhisasnglylysleucysaspleuaspglyvallys505560proleuileleuargaspcysservalalaglytrpleuleuglyasn65707580prometcysaspglupheileasnvalproglutrpsertyrileval859095glulysalaasnprothrasnaspleucystyrproglyserpheasn100105110asptyrglugluleulyshisleuleuserargileasnhispheglu115120125lysileglnileileprolyssersertrpserasphisglualaser130135140serglyvalserseralacysprotyrleuglyserproserphephe145150155160argasnvalvaltrpleuilelyslysasnserthrtyrprothrile165170175lyslyssertyrasnasnthrasnglngluaspleuleuvalleutrp180185190glyilehishisproasnaspalaalagluglnthrargleutyrgln195200205asnprothrthrtyrileserileglythrserthrleuasnglnarg210215220leuvalprolysilealathrargserlysvalasnglyglnsergly225230235240argmetgluphephetrpthrileleulysproasnaspalaileasn245250255phegluserasnglyasnpheilealaproglutyralatyrlysile260265270vallyslysglyaspseralailemetlyssergluleuglutyrgly275280285asncysasnthrlyscysglnthrprometglyalaileasnserser290295300metprophehisasnilehisproleuthrileglyglucysprolys305310315320tyrvallysserasnargleuvalleualathrglyleuargasnser325330335proglnarggluserargarglyslysargglyleupheglyalaile340345350alaglypheilegluglyglytrpglnglymetvalaspglytrptyr355360365glytyrhishisserasngluglnglyserglytyralaalaasplys370375380gluserthrglnlysalaileaspglyvalthrasnlysvalasnser385390395400ileileasplysmetasnthrglnpheglualavalglyarggluphe405410415asnasnleugluargargilegluasnleuasnlyslysmetgluasp420425430glypheleuaspvaltrpthrtyrasnalagluleuleuvalleumet435440445gluasngluargthrleuaspphehisaspserasnvallysasnleu450455460tyrasplysvalargleuglnleuargaspasnalalysgluleugly465470475480asnglycysphegluphetyrhislyscysaspasnglucysmetglu485490495serileargasnglythrtyrasntyrproglntyrserglugluala500505510argleulysargglugluileserglyvallysleugluserilegly515520525thrtyrglnileleuseriletyrserthrvalalaserserleuala530535540leualailemetmetalaglyleuserleutrpmetcysserasngly545550555560serleuglncysargilecysile565<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸pbinplus.2613c<400>3aggaagggaagaaagcgaaaggag24<210>4<211>56<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸mut-atg115.r<400>4gtgccgaagcacgatctgacaacgttgaagatcgctcacgcaagaaagacaagaga56<210>5<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸mut-atg161.c<400>5gttgtcagatcgtgcttcggcaccagtacaacgttttctttcactgaagcga52<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸lc-c5-1.110r<400>6tctcctggagtcacagacagggtgg25<210>7<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸apai-h5(a-indo).1c<400>7tgtcgggcccatggagaaaatagtgcttcttcttgcaat39<210>8<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸h5(a-indo)-stui.1707r<400>8aaataggcctttaaatgcaaattctgcattgtaacga37<210>9<211>3111<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸構(gòu)建體660<400>9agaggtaccccgggctggtatatttatatgttgtcaaataactcaaaaaccataaaagtt60taagttagcaagtgtgtacatttttacttgaacaaaaatattcacctactactgttataa120atcattattaaacattagagtaaagaaatatggatgataagaacaagagtagtgatattt180tgacaacaattttgttgcaacatttgagaaaattttgttgttctctcttttcattggtca240aaaacaatagagagagaaaaaggaagagggagaataaaaacataatgtgagtatgagaga300gaaagttgtacaaaagttgtaccaaaatagttgtacaaatatcattgaggaatttgacaa360aagctacacaaataagggttaattgctgtaaataaataaggatgacgcattagagagatg420taccattagagaatttttggcaagtcattaaaaagaaagaataaattatttttaaaatta480aaagttgagtcatttgattaaacatgtgattatttaatgaattgatgaaagagttggatt540aaagttgtattagtaattagaatttggtgtcaaatttaatttgacatttgatcttttcct600atatattgccccatagagtcagttaactcatttttatatttcatagatcaaataagagaa660ataacggtatattaatccctccaaaaaaaaaaaacggtatatttactaaaaaatctaagc720cacgtaggaggataacaggatccccgtaggaggataacatccaatccaaccaatcacaac780aatcctgatgagataacccactttaagcccacgcatctgtggcacatctacattatctaa840atcacacattcttccacacatctgagccacacaaaaaccaatccacatctttatcaccca900ttctataaaaaatcacactttgtgagtctacactttgattcccttcaaacacatacaaag960agaagagactaattaattaattaatcatcttgagagaaaatggagaaaatagtgcttctt1020cttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaat1080tcaacagagcaggttgacacaatcatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagac1140atactggaaaagacacacaacgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaatt1200ttaagagattgtagtgtagctggatggctcctcgggaacccaatgtgtgacgaattcatc1260aatgtaccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccaaccaatgacctctgttac1320ccagggagtttcaacgactatgaagaactgaaacacctattgagcagaataaaccatttt1380gagaaaattcaaatcatccccaaaagttcttggtccgatcatgaagcctcatcaggagtt1440agctcagcatgtccatacctgggaagtccctccttttttagaaatgtggtatggcttatc1500aaaaagaacagtacatacccaacaataaagaaaagctacaataataccaaccaagaggat1560cttttggtactgtggggaattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaggctatat1620caaaacccaaccacctatatttccattgggacatcaacactaaaccagagattggtacca1680aaaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggaca1740attttaaaacctaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaa1800tatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcagcaattatgaaaagtgaattggaatat1860ggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagtatgccattc1920cacaacatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagatta1980gtccttgcaacagggctcagaaatagccctcaaagagagagcagaagaaaaaagagagga2040ctatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttgg2100tatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccact2160caaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcaatcattgacaaaatgaacact2220cagtttgaggccgttggaagggaattt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