本發(fā)明屬于工業(yè)微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的涉及一種高純度奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的制備方法。
背景技術(shù)：
：糖肽抗生素是由微生物產(chǎn)生，或由微生物產(chǎn)生并進(jìn)行部分修飾的一大類物質(zhì)。在上世紀(jì)九十年代發(fā)現(xiàn)的糖肽中，包括稱作a82846a（也稱作ereomomycin）、a82846b（也稱作氯東方霉素chloroorienticina）、a82846c（也稱作東方霉素orienticinc）及東方霉素a。已經(jīng)對天然存在的糖肽進(jìn)行了多種修飾，其中一種是對糖肽中的反應(yīng)性胺的還原烷基化的修飾。奧利萬星(oritavancin)，是在第一代糖肽抗生素萬古霉素的基礎(chǔ)上開發(fā)的第二代糖肽抗生素，其作用機(jī)制是通過阻斷肽聚糖生物合成時轉(zhuǎn)糖苷作用抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成。故該類化合物對細(xì)菌細(xì)胞具有高度的特異性，能迅速殺滅細(xì)菌而對人體正常細(xì)胞影響較小，因而療效好，安全性高。2014年8月，fda批準(zhǔn)奧利萬星用于由敏感革蘭氏陽性菌導(dǎo)致的急性細(xì)菌性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染成人患者的治療。奧利萬星是一種單劑量治療方案的抗生素，具有良好的市場前景。a82846b，是合成奧利萬星的關(guān)鍵中間體，可由東方諾卡菌(nocardiaorientalis)發(fā)酵產(chǎn)生。除a82846b外，東方諾卡菌發(fā)酵時還會產(chǎn)生兩種主要成分a82846a和a82846c，它們的結(jié)構(gòu)式如下：。由式可知，三種物質(zhì)結(jié)構(gòu)非常接近，分離純化工作比較困難。目前，關(guān)于奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b提取分離的文獻(xiàn)報道較少。歐洲專利ep0280570a2及美國專利us4845194公開了三種物質(zhì)的分離方法，其中a82846b的分離方法為：將發(fā)酵液通過陽離子（nh4+）交換樹脂進(jìn)行初步富集，然后通過制備性高效液相色譜柱分離，最后經(jīng)過hp20ss樹脂精制。專利中主要進(jìn)行了此3步純化，后面的兩個步驟的收率僅為29%，總收率更低。cn87106483a也公開了一種a82846的回收方法，包括將其吸附于陽離子交換樹脂上，如dowexxf5-43278，dowex-50或大網(wǎng)狀樹脂ir-120；再用合適的溶劑，如稀nh4oh溶液，將活性物質(zhì)從樹脂上洗脫下來，濃縮后將其吸附在一個大網(wǎng)狀樹脂上，如diaionhp-20和大網(wǎng)狀樹脂xad-4上，然后用合適的溶劑洗脫，得到a82846，并公開了，采用同樣的方法步驟分離得到個別組分a82846a,a82846b,a82846c。該方法多次從樹脂上洗脫分離，操作方法繁瑣，有機(jī)溶劑用量大，需要處理大量廢液。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)普遍存在如下缺點(diǎn)：1）總收率低，對工業(yè)生產(chǎn)效率產(chǎn)生影響；2）需要多步樹脂分離等工藝，增加了操作步驟和生產(chǎn)成本，且需要更多的有機(jī)溶劑，對操作人員的身體健康構(gòu)成威脅，且對環(huán)境造成污染，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；3）現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法均涉及采用采用陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，發(fā)明人通過大量多次試驗研究發(fā)現(xiàn)，陽離子樹脂的吸附效率非常低，出現(xiàn)吸附不上去，漏吸附現(xiàn)象，導(dǎo)致收率降低；并且，色素?zé)o法除去。因此，本領(lǐng)域急需找到一種高純度的奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的制備方法，降低生產(chǎn)成本，簡化操作步驟，降低環(huán)境污染，提高收率，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種高純度奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的制備方法，包括以下步驟：一種高純度奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的制備方法，包括以下步驟：1）將發(fā)酵液ph為調(diào)節(jié)至10~11，然后固液分離得到濾液；2）將濾液ph調(diào)節(jié)至9.0-9.5后導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行富集；3）將步驟2）的樹脂凈化，然后用解吸液進(jìn)行解吸并收集組分，得到a82846b解吸混合液；4）將a82846b解吸混合液進(jìn)行濃縮后，進(jìn)行反相填料層析分離，用極性溶劑與鹽水的混合液進(jìn)行解吸；5）將層析分離得到的解吸液濃縮；6）將濃縮液攪拌結(jié)晶，過濾并干燥，得到高純度的奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b產(chǎn)品。其中，步驟6）中，先向濃縮液中加入nacl，然后攪拌，低溫結(jié)晶；優(yōu)選所述nacl用量為20-30%（m/v），所述的低溫為2-8℃；更優(yōu)選所述nacl用量為24-26%（m/v），所述的低溫優(yōu)選為4-6℃。步驟1）中優(yōu)選，將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至10-10.5，步驟2）中將濾液ph調(diào)節(jié)至9.2~9.5；其中ph調(diào)節(jié)劑為本領(lǐng)域常規(guī)的酸堿調(diào)節(jié)劑，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、氨水等。所述的固液分離方法優(yōu)選為離心、板框壓濾、或減壓抽濾。步驟2）中所述的大孔吸附樹脂獨(dú)立的選自弱極性或非極性樹脂；優(yōu)選為lx18、xad1600、hp20、或hz816，其吸附量為5-10g/l，優(yōu)選6-8g/l。步驟3）中所述的樹脂凈化是采用ph為7-9的純化水凈化樹脂柱，優(yōu)選用量為2-4bv。步驟3）中所述的解吸液為0.5%-1.5%（v/v）醋酸水溶液，優(yōu)選解析液為1%醋酸水溶液，其用量為2-5bv。步驟4）中所述的濃縮方式為納濾，濃縮至濃度為20-50mg/ml。步驟4）中所述的反相填料為采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制備的聚合物微球、odsc18或fraclite800；所述的解吸液，以解析液總體積計算，鹽水為0.5%-1%（w/v）nh4h2po4；極性溶劑為甲醇或乙腈，其濃度為2-10%（v/v），優(yōu)選甲醇或乙腈濃度為2-5%（v/v），解吸液用量為3-5bv。上述方法中，步驟6）過濾后得到的固體干燥方法優(yōu)選為真空干燥，溫度控制在30-45℃，干燥時間為4~16h。上述方法中，進(jìn)一步優(yōu)選，還包括，將得到奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b進(jìn)行脫鹽處理，以方便用于制備奧利萬星；所述的脫鹽方法包括，將上述方法中純化得到的奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b采用甲醇、乙醇或異丙醇溶液進(jìn)行結(jié)晶，脫去a82846b的鹽，以用于后續(xù)制備奧利萬星；其中所述甲醇、乙醇或異丙醇溶液優(yōu)選濃度不低于75%的甲醇、乙醇或異丙醇溶液，更優(yōu)選80%，83%，85%，90%，95%或99%的乙醇；或者，在步驟6）之前，將步驟4）層析分離得到的解吸液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行脫鹽處理，用樹脂凈化，用10-40%（v/v）的甲醇或乙腈水溶液進(jìn)行解吸，將得到的脫鹽解析液濃縮；其中，所述大孔吸附樹脂選自lx18、xad1600、hp20和hz816；所述的樹脂凈化是采用ph為7-9的純化水凈化樹脂柱。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明提供了一種成本低廉的純化奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的新方法；2、本發(fā)明提供的方法具有純化條件溫和、產(chǎn)品收率高、產(chǎn)品純度高；工藝步驟簡化，溶劑用量大大減少，對環(huán)境污染小等特點(diǎn)，在較大程度上簡化了工藝操作，并減輕對設(shè)備的要求，降低了生產(chǎn)成本；3、本發(fā)明提供的方法能夠得到較穩(wěn)定的目標(biāo)產(chǎn)物，有利于終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；4、本發(fā)明提供的方法提取的目標(biāo)產(chǎn)物——關(guān)鍵中間體a82846b，完全可以滿足向新型糖肽類化合物奧利萬星合成的要求，便于進(jìn)行規(guī)?；铣蓨W利萬星；5、本發(fā)明提供的技術(shù)方案在上大孔吸附樹脂前先進(jìn)行ph調(diào)節(jié)并采用弱極性或非極性樹脂特別是lx18、xad1600、hp20、或hz816替代現(xiàn)有技術(shù)中陽離子交換樹脂，克服了大孔吸附樹脂吸附效率低，漏吸附導(dǎo)致產(chǎn)品收率降低的缺陷；6、采用本發(fā)明的技術(shù)方案較大程度的除去了產(chǎn)品中的色素，進(jìn)而使得產(chǎn)品質(zhì)量得到提高。7、本發(fā)明技術(shù)方案采用甲醇、乙醇或異丙醇溶液對純化后的a82846b精粉進(jìn)行結(jié)晶處理，可以顯著除去a82846b精粉的鹽，從而滿足后續(xù)奧利萬星的制備需求。附圖說明圖1為實施例1中a82846b發(fā)酵液濾液的hplc圖譜，其中主成分保留時間為18.561，峰面積為13379391，峰面積%為31.843%；圖2為實施例1中a82846b一次解吸混合液的hplc圖譜，其中主成分保留時間為17.829，峰面積為35327795，峰面積%為60.021%；圖3為實施例1中a82846b二次解吸混合液的hplc圖譜，其中主成分保留時間為19.674，峰面積為14678766，峰面積%為94.851%；圖4為實施例1中a82846b濕晶體的hplc圖譜，其中主成分保留時間為21.639，峰面積為15056710，峰面積%為94.857%；圖5為實施例1中a82846b干精粉的hplc圖譜，其中主成分保留時間為21.453，峰面積為4382450，峰面積%為94.794%。具體實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不意味著對本發(fā)明有任何限制。實施例1奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐40l，發(fā)酵單位為650ug/ml（26g），將發(fā)酵液用naoh溶液調(diào)節(jié)ph至10.5，攪拌2h后進(jìn)行管式離心，得到36.8l離心液（hplc的圖譜見圖1），單位為630ug/ml（23g）。將離心液調(diào)節(jié)ph至9.3，然后將其導(dǎo)入hp20吸附樹脂（規(guī)格為ф25*75），裝量為3000ml，流速為1bv/h。樹脂用ph為8的水凈化9l后，再用8l1%醋酸水溶液進(jìn)行解吸，流速2500ml/h，收集解吸組分，并將濃度較高的組分混合，組成一次解吸混合液（hplc的圖譜見圖2），然后將解吸混合液進(jìn)行納濾濃縮，濃縮至單位為39102ug/ml（21.9g）。將濃縮液導(dǎo)入已平衡好的c18柱（規(guī)格為ф25*75），用乙腈:0.5%nh4h2po4=2:98（v/v）進(jìn)行洗脫，流速1500ml/h，將純度為90%以上的組分混合，得到體積為8.5l二次解吸混合液（hplc的圖譜見圖3），單位為1361ug/ml（11.56g）。將二次解吸混合液導(dǎo)入hp20吸附樹脂柱（規(guī)格為ф25*75），加入9l純化水進(jìn)行脫鹽處理，用20%乙腈進(jìn)行解吸，將得到的脫鹽液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液150ml，單位為73423ug/ml（10.98g）。向濃縮液中加入35g氯化鈉，攪拌至完全溶解，1h后，轉(zhuǎn)入4℃冰箱，過夜結(jié)晶后抽濾，得到31.10g濕晶體（hplc的圖譜見圖4），將濕晶體進(jìn)行真空干燥后，得到中間體a82846b干粉11.66g（hplc的圖譜見圖5和其數(shù)據(jù)見表5），其含量為85%，純度為94.79%，總收率為35.88%。中間體a82846b的hplc檢測方法：反相hplc分析采用的色譜柱為sb-c8柱（4.6mm×150mm×3.5um），柱溫為30℃；流動相為a相0.1%的三氟乙酸（tfa）：乙腈=95：5（v/v），b相0.1%的三氟乙酸（tfa）：乙腈=85：15（v/v），采用梯度洗脫，其梯度洗脫見下表所示，流速為1.0ml/min；檢測器為vwd或dad，測定波長為240nm；樣品用水溶解并制成500ug/ml的溶液，進(jìn)樣量為20ul，運(yùn)行30min。表1：梯度洗脫條件。實施例2奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐33l，發(fā)酵單位為340ug/ml（11.22g），將發(fā)酵液用naoh溶液調(diào)節(jié)ph=10.3，攪拌2h后進(jìn)行板框壓濾，得到35l壓濾液，單位為310ug/ml（10.85g）。將壓濾液調(diào)節(jié)ph=9.2，然后將其導(dǎo)入lx18吸附樹脂。樹脂用ph為8的水凈化9l后，再用8l0.5%醋酸水溶液進(jìn)行解吸，并將濃度較高的組分混合，組成一次解吸混合液，然后將解吸混合液進(jìn)行納濾，濃縮至單位為35000ug/ml。將濃縮液導(dǎo)入已平衡好的c18柱，用洗脫液（乙腈:0.5%nh4h2po4=3:97（v/v））進(jìn)行洗脫，收集純度為90%以上的組分，得到二次解吸混合液。將二次解吸混合液進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至80ml，單位為81250ug/ml，純度為92.80%。向濃縮液中加入20g氯化鈉，攪拌溶解1h后，轉(zhuǎn)入4℃冰箱，過夜結(jié)晶后抽濾，得到17.40g濕晶體，將濕晶體加入85%乙醇進(jìn)行攪拌打漿，抽濾得到12.50g打漿濕品，將濕品進(jìn)行真空干燥后，研磨得到中間體a82846b干粉6.20g，其含量為82%，純度為93.45%，總收率為45.32%。實施例3奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐28.1l，發(fā)酵單位為420ug/ml（11.80g），將發(fā)酵液用naoh溶液調(diào)節(jié)ph=10.6，攪拌2h后進(jìn)行離心，得到25.5l離心液，單位為432ug/ml（11.10g）。將離心液調(diào)節(jié)ph=9.5，取部分按體積等分為4份（每份5.5l，每份含產(chǎn)品2.35g，純度為25.69%），分別導(dǎo)入已再生平衡好的4款樹脂柱（hp20，lx18，xad1600，hz816），然后用1l純化水凈化樹脂柱，用1.5%醋酸水溶液洗脫。收集濃度較高的組分，組成解吸混合液，送檢，檢測各項純度結(jié)果如表2：表2：各種樹脂初純效果樹脂名稱樹脂載樣量上樣量解吸混合液含產(chǎn)品量產(chǎn)品純度收率hp209g/l2.35g2.20g25.0%93.6%lx189g/l2.35g2.09g24.3%88.9%xad16009g/l2.35g2.24g24.2%95.1%hz8169g/l2.35g1.97g30%83.8%實施例4奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐40l，發(fā)酵單位為496ug/ml（19.84g），將發(fā)酵液靜置3天后抽濾，得到38l抽濾液。抽濾液調(diào)節(jié)ph=9.3，將其導(dǎo)入xad1600吸附樹脂。樹脂用水凈化9l后，再用8l1%醋酸水溶液進(jìn)行解吸，并將濃度較高的組分混合，組成一次解吸混合液，然后將解吸混合液進(jìn)行納濾，濃縮至560ml，單位為33673ug/ml（18.85g）。將濃縮液導(dǎo)入已平衡好的c18柱，用乙腈3%進(jìn)行洗脫，收集純度為90%以上的組分，得到二次解吸混合液。將二次解吸混合液進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至150ml，單位為73250ug/ml，純度為93.80%。將濃縮液均分成4份（每份37.5ml，每份含產(chǎn)品2.75g）放入4只燒杯中，燒杯編號1-4，一邊攪拌一邊向各燒杯中分別加入15%，20%，25%，30%的氯化鈉，攪拌溶解2h后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中過夜結(jié)晶。抽濾，得到濕晶體a，檢測各項純度如表3：表3：不同濃度的氯化鈉對濃縮液的結(jié)晶效果序號氯化鈉濃度濕晶體a純度結(jié)晶母液濃度結(jié)晶收率115%95.03%37650ug/ml48.60%220%94.59%16201ug/ml77.88%325%94.48%11290ug/ml84.58%430%94.23%10215ug/ml86.05%實施例5將奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐38l，發(fā)酵單位為467ug/ml（17.75g），按照實施例1的方法進(jìn)行操作，得到濕晶體a重量為21g，其含量為29.5%（8.23g）。將濕晶體置于40℃烘箱中2h后得烘干品b，重量為18.2g，純度為94.72%，含量為45%。將烘干品b按重量等分為3份（每份約6g），標(biāo)記1-3號，向其中加入50ml不同濃度的乙醇，乙醇濃度分別為95%，90%，85%。攪拌處理1h后，抽濾，得到的固體于40℃烘箱中放置2h后得烘干品c，送檢，檢測各項純度如表4：表4：不同濃度的乙醇對晶體的含量提高效果序號乙醇濃度烘干品c純度烘干品c含量母液濃度收率195%95.03%78%820ug/ml98.48%290%94.59%83%1351ug/ml97.49%385%94.48%89%1817ug/ml96.60%從上上述實施例1和實施例5中，可看出，在純化步驟該實施例顯示，通過采用乙醇對晶型進(jìn)行純化，可以除去產(chǎn)品中的大部分鹽的，即，顯著提高了奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b的含量。對比實施例1：采用現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行純化a82846b（使用陽離子樹脂）奧利萬星關(guān)鍵中間體a82846b發(fā)酵放罐32l，發(fā)酵單位為453ug/ml（14.49g），將發(fā)酵液用naoh溶液調(diào)節(jié)ph=10.5，攪拌2h后進(jìn)行離心，得到28.5l離心液，單位為442ug/ml（12.59g）。將離心液調(diào)節(jié)ph=6.5，取部分按體積等分為3份（每份6l，每份含產(chǎn)品2.65g，純度為27.39%），分別導(dǎo)入已處理平衡好的3款陽離子交換樹脂柱（732、d113、d001），然后用1l純化水凈化樹脂柱，用ph為10-11的堿水溶液洗脫。收集上柱廢液、凈化廢液和洗脫液送檢，結(jié)果如表5：表5：陽離子交換樹脂初純效果漏吸率：是指上柱廢液及凈化廢液中含產(chǎn)品量占上樣量的百分比值。當(dāng)前第1頁12