本發(fā)明涉及一種提高同源重組率的方法，特別涉及一種將foki-dcas9蛋白應(yīng)用于基因編輯系統(tǒng)中以實(shí)現(xiàn)提高同源重組效率的方法。

背景技術(shù)：

隨著生命科學(xué)研究進(jìn)入基因組時(shí)代，越來(lái)越多物種的基因組完成測(cè)序，解讀與改造基因組的功能就顯得非常緊迫，近幾年，生物學(xué)家們巧妙地利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能領(lǐng)域的研究成果，將特異識(shí)別與結(jié)合dna的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合，創(chuàng)造出能夠按照人們意愿特異切割dna的序列特異核酸酶(sequence-specificnucleases，ssns)，并藉此實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組特定位點(diǎn)的靶向修飾，及基因組編輯(genomeediting)。ssns主要包括3種類型：鋅指核酸酶(zincfingernuclease,zfn)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,talen)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(clusteredreg-ularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associated9,crispr/cas9system)。上述幾類ssns的共同特征是能夠作為核酸內(nèi)切酶切割特定的dna序列，創(chuàng)造dna雙鏈斷裂(double-strandbreaks，dsbs)。

在真核生物中，dsbs的修復(fù)機(jī)制是高度保守的，主要包括兩種途徑：非同源末端鏈接(non-homologousendjoining，nhej)和同源重組(homologousrecombination，hr)。通過(guò)nhej方式，斷裂的染色體會(huì)重新連接，但往往不是精確的，斷裂位置會(huì)產(chǎn)生少量核苷酸的插入或刪除，從而產(chǎn)生基因敲除突變體；通過(guò)hr方式，在引入同源序列的情況下，以同源序列為模板進(jìn)行合成修復(fù)，從而產(chǎn)生精確的定點(diǎn)替換或者插入突變體。在這兩種途徑中，nhej方式占絕對(duì)主導(dǎo)，可以發(fā)生在幾乎所有類型的細(xì)胞以及不同的細(xì)胞周期中(g1、s和g2期)；然而，hr發(fā)生頻率很低，主要發(fā)生在s和g2期。hr根據(jù)其發(fā)生方式不同可以分為兩類：?jiǎn)捂溚嘶?single-strandannealing，ssa)和合成依賴式退火(synthesis-dependentstrandannealing，sdsa)。dsbs產(chǎn)生后，在這兩種途徑下dna斷裂末端都會(huì)發(fā)生5’至3’方向的dna切除，形成3’單鏈末端。ssa途徑類似nhej途徑，dsbs兩端各有一段同源序列，同源序列區(qū)域直接退火形成互補(bǔ)雙鏈，再經(jīng)過(guò)末端加工和連接修復(fù)dsbs，在基因組串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，ssa是主要的dsbs修復(fù)方式。sdsa途徑是依賴dna合成的修復(fù)過(guò)程，基因組編輯過(guò)程中同源重組通常是指這種方式。dsb經(jīng)過(guò)5’至3’方向的dna切除產(chǎn)生的一個(gè)3’單鏈末端入侵同源供體dna模板，形成d-loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再利用同源供體dna的互補(bǔ)鏈作為模板進(jìn)行dna合成修復(fù)，當(dāng)延伸至可以與dsb另一個(gè)單鏈末端互補(bǔ)配對(duì)的位置時(shí)，脫離d-loop結(jié)構(gòu)，兩個(gè)單鏈dsb末端退火形成雙鏈，完成修復(fù)過(guò)程。sdsa途徑最終結(jié)果就是完成從同源dna至dsb遺傳信息的轉(zhuǎn)化過(guò)程。sdsa途徑發(fā)生頻率非常低，相同條件下只有ssa方式的10％-20％。由此可見，提高h(yuǎn)r效率是基因組編輯研究最重要也是最迫切的任務(wù)之一。

在crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)不同的sgrna以指導(dǎo)cas9內(nèi)切酶完成對(duì)dna的定點(diǎn)切割，通過(guò)同源重組修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因中不同類型的修飾，包括基因的刪除、添加和替換等。因此明確dna修復(fù)機(jī)制特別是hr修復(fù)過(guò)程的研究將有助于人們采用適當(dāng)方法提高基因組編輯中定點(diǎn)插入或替換的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種提高同源重組效率的方法，首次提供了foki-dcas9融合蛋白可以提高同源重組效率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種提高同源重組效率的方法，包括向宿主細(xì)胞中引入foki-dcas9融合蛋白。

進(jìn)一步地，所述foki-dcas9融合蛋白在宿主細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。

更進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述植物為玉米、水稻、大豆、擬南芥、棉花、油菜、高粱、小麥、大麥、粟、甘蔗或燕麥。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述foki-dcas9融合蛋白的氨基酸序列具有seqidno:4和seqidno:5所示的氨基酸序列。

優(yōu)選地，所述foki-dcas9融合蛋白的核苷酸序列具有seqidno:1第643-5523位所示的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種基因組編輯系統(tǒng)，包含foki-dcas9融合蛋白。

進(jìn)一步地，所述foki-dcas9融合蛋白的氨基酸序列具有seqidno:4和seqidno:5所示的氨基酸序列。

更進(jìn)一步地，所述foki-dcas9融合蛋白的核苷酸序列具有seqidno:1第643-5523位所示的核苷酸序列。

可選地，所述基因組編輯系統(tǒng)還包括編碼序列操縱系統(tǒng)的多核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述序列操縱系統(tǒng)為crispr/cas系統(tǒng)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種實(shí)現(xiàn)基因組編輯的方法，包括在生物體中表達(dá)所述基因組編輯系統(tǒng)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生基因組編輯的植物的方法，包括向植物基因組中引入編碼所述基因組編輯系統(tǒng)的核苷酸序列。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生基因組編輯植物種子的方法，包括將所述方法產(chǎn)生的基因組編輯的植物自交，從而獲得具有基因組編輯植物種子。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培育基因組編輯植物的方法，包括：

種植至少一粒所述方法產(chǎn)生的所述基因組編輯植物種子；

使所述種子長(zhǎng)成植株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種所述基因組編輯系統(tǒng)在提高同源重組效率和/或提高基因組編輯效率中的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種foki-dcas9融合蛋白在提高同源重組效率中的用途。

進(jìn)一步地，所述foki-dcas9融合蛋白的氨基酸序列具有seqidno:4和seqidno:5所示的氨基酸序列。

更進(jìn)一步地，所述foki-dcas9融合蛋白的核苷酸序列具有seqidno:1第643-5523位所示的核苷酸序列。

本發(fā)明所述的foki是包括dna識(shí)別結(jié)構(gòu)域和催化(內(nèi)切核酸酶)結(jié)構(gòu)域的ii型限制性內(nèi)切核酸酶。本文所述的融合蛋白可包括所有foki或僅僅催化內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域，例如，基因庫(kù)登錄號(hào)aaa24927.1的氨基酸388-583或408-583，例如，如li等，nucleicacidsres.39(1):359–372(2011)；cathomen和joung,mol.ther.16:1200–1207(2008)中描述的，或如miller等natbiotechnol25:778–785(2007)；szczepek等，natbiotechnol25:786–793(2007)；或bitinaite等，proc.natl.acad.sci.usa.95:10570–10575(1998)中描述的foki的突變形式。

本發(fā)明中所述的cas9，ⅱ型crispr/cas系統(tǒng)中一種重要的蛋白質(zhì)成分，可以從生物體如鏈球菌屬物種(streptococcussp.)，優(yōu)選釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes.)中分離得到。當(dāng)cas9與稱為crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)的兩個(gè)rna復(fù)合時(shí)，形成活性核酸內(nèi)切酶，從而切斷入侵噬菌體或質(zhì)粒中的外源遺傳元件，以保護(hù)宿主細(xì)胞。crrna從宿主基因組中的crispr元件轉(zhuǎn)錄，其中該crispr元件之前自外源入侵物捕獲。研究表明通過(guò)融合crrna和tracrrna的必要部分產(chǎn)生的單鏈嵌合rna可以取代cas9/rna復(fù)合體中的兩個(gè)rna以形成功能性核酸內(nèi)切酶。cas9蛋白質(zhì)的變體可以是cas9的突變體形式，其中催化性天冬氨酸殘基改變?yōu)槿魏纹渌被?。?yōu)選地，所述其它氨基酸可以是丙氨酸。

本發(fā)明中所述foki-dcas9融合蛋白，其中foki序列任選地通過(guò)間插接頭，例如2-30個(gè)氨基酸，例如4-12氨基酸的接頭，例如gly4ser與dcas9(優(yōu)選地與dcas9的氨基末端，而且還任選地與羧基末端)融合。在一些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包括dcas9與foki結(jié)構(gòu)域之間的接頭?？捎糜谶@些融合蛋白的接頭(或串聯(lián)結(jié)構(gòu)中的融合蛋白之間)可包括不干擾融合蛋白的功能的任何序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接頭是短的，例如2-20個(gè)氨基酸，并且通常是柔性的(即包含具有高度自由的氨基酸諸如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸)。在一些實(shí)施方案中，所述接頭包含一個(gè)或多個(gè)由gggs或ggggs組成的單元，例如，2、3、4或更多個(gè)gggs或ggggs單元的重復(fù)，還可使用其它接頭序列。

本發(fā)明所用2a肽(t2a)是一種可“自我剪切的短小肽鏈”，最初在手足口病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmda)中發(fā)現(xiàn)，平均長(zhǎng)度為18-22個(gè)氨基酸，2a肽可在蛋白翻譯時(shí)通過(guò)核糖體跳躍從自身最后2個(gè)氨基酸c末端斷裂(defelipeetal.,2003)。甘氨酸和脯氨酸之間的肽鏈結(jié)合群在2a為電視受損的，能引發(fā)核糖體跳躍而從第2個(gè)密碼子開始翻譯，從而使1個(gè)轉(zhuǎn)錄單元里2個(gè)蛋白獨(dú)立表達(dá)。這中2a介導(dǎo)的剪切廣泛存在與所有的真核動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)中。利用2a較高的剪切效率及促使上下游基因平衡表達(dá)的能力，可以改進(jìn)異源多聚蛋白(如細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子、免疫球蛋白等)的表達(dá)效率。

本發(fā)明中所述的向?qū)na或引導(dǎo)rna(guiderna，grna)，也稱為小向?qū)na(smallguiderna，sgrna)，作用于動(dòng)質(zhì)體(kinetoplastid)體內(nèi)一種稱為rna編輯(rnaediting)的后轉(zhuǎn)錄修飾過(guò)程中，也是一種小型非編碼rna?？膳cpre-mrna配對(duì)，并在其中插入一些尿嘧啶(u)，產(chǎn)生具有作用的mrna。向?qū)na編輯的rna分子，長(zhǎng)度大約是60-80個(gè)核苷酸，是由單獨(dú)的基因轉(zhuǎn)錄的，在grna的5’末端有一段錨定區(qū)，以特殊的g-u配對(duì)方式與非編輯的pre-mrna序列互補(bǔ)，錨定序列促進(jìn)grna與pre-mrna中的編輯區(qū)互補(bǔ)，特意結(jié)合；在grna分子的中間部位有一個(gè)編輯區(qū)負(fù)責(zé)在被編輯的pre-mrna分子中插入u的位置，其與被編輯mrna精確互補(bǔ)；在grna分子的3’末端，有一段轉(zhuǎn)錄后加入的由大約15個(gè)非編碼的polyu序列，功能為把grna鏈接到pre-mrna的編輯區(qū)的5’上游富含嘌呤堿基的核苷酸序列上。在編輯時(shí)，形成一個(gè)編輯體(editosome)，以grna內(nèi)部的序列作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物的校正，同時(shí)產(chǎn)生編輯的mrna。

有三種類型crispr/cas系統(tǒng)，其中涉及cas9蛋白質(zhì)和crrna、tracrrna的ⅱ型crispr/cas系統(tǒng)是代表性的。cas9蛋白質(zhì)通過(guò)人工修飾的向?qū)na的導(dǎo)向作用可以打靶dna序列的5’-n20-ngg-3’(n代表任何脫氧核苷酸堿基)，n20是與grna的5’序列相同的20個(gè)堿基，ngg是pam區(qū)(原型間隔子鄰近基序，protospacer-adjacentmotif)。cas9剪切的位點(diǎn)就是pam附近的區(qū)域。相對(duì)于鋅指和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物dna結(jié)合蛋白提供了優(yōu)勢(shì)-因?yàn)樵诤塑账峤Y(jié)合crispr-cas蛋白中的位點(diǎn)特異性由rna分子調(diào)控而不是dna結(jié)合蛋白調(diào)控。

本發(fā)明中所述重組，當(dāng)用于例如細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過(guò)引入異源核酸或蛋白質(zhì)、或改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或該細(xì)胞源自此修飾的細(xì)胞。

本發(fā)明中向?qū)na可以以編碼該向?qū)na的rna或dna的形式轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或生物體中。向?qū)na可以是分離的rna、并入病毒載體的rna的形式、或者在載體中編碼。優(yōu)選地，載體可以是病毒載體、質(zhì)粒載體、或農(nóng)桿菌載體。

編碼向?qū)na的dna可以是包含編碼向?qū)na序列的載體。例如，可以通過(guò)用分離的向?qū)na或包含編碼向?qū)na的序列和啟動(dòng)子的質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染細(xì)胞或生物體，將向?qū)na轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或生物體。

本發(fā)明中所述切割或剪切是指核苷酸分子共價(jià)骨架的斷裂。向?qū)na可以制備為特異于任何待切割的靶，通過(guò)向?qū)na的靶特異性部分切割任何靶dna。

本發(fā)明中所述非同源末端連接(non-homologousendjoining,nhej)指完全不需要任何模版的幫助，修復(fù)蛋白可以直接將dna斷裂的末端彼此拉近，再借由dna連接酶的幫助將斷裂的末端重新接合的修復(fù)機(jī)制。

本發(fā)明中所述同源重組(homologousrecombination，hr)是指發(fā)生在非姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的dna分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的reca、recbcd、recf、reco、recr等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的rad51、mre11-rad50等等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或holliday結(jié)構(gòu)的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會(huì)體階段、聯(lián)會(huì)體形成和holliday結(jié)構(gòu)的拆分。同源重組反應(yīng)依賴于dna分子之間的同源性，100％同源性的dna分子之間的重組常見于非姐妹染色體之間的同源重組，稱為homologousrecombination，而小于100％同源性的dna分子之間或分子之內(nèi)的重組，則被稱為hemologusrecombination。后者可被負(fù)責(zé)堿基錯(cuò)配對(duì)的蛋白如原核細(xì)胞內(nèi)的muts或真核生物細(xì)胞內(nèi)的msh2-3等蛋白質(zhì)“編輯”。同源重組可以雙向交換dna分子，也可以單向轉(zhuǎn)移dna分子，后者又被稱為基因轉(zhuǎn)換(geneconversion)。

本發(fā)明中，單鏈退火(ssa)模型是由lin等于1984年提出的。在ssa模型中，重組在dna雙鏈斷裂處開始，在單鏈特異性核酸外切酶的作用下，斷裂點(diǎn)兩側(cè)逐漸形成dna單鏈區(qū)域，這一過(guò)程持續(xù)到兩個(gè)斷點(diǎn)處出現(xiàn)互補(bǔ)dna單鏈。互補(bǔ)dna單鏈退火，非互補(bǔ)末端被切除，單鏈缺口修復(fù)連接，完成dna重組。ssa模型沒(méi)有其它模型所需的雙鏈dna的識(shí)別配對(duì)過(guò)程，不形成holliday結(jié)構(gòu)作為重組的中間過(guò)渡形式。因此，重組產(chǎn)生dna雙鏈交換，并丟失非退火區(qū)域單鏈dna順序。

本發(fā)明中，所述串聯(lián)是指將二個(gè)或二個(gè)以上向?qū)na(sgrna)排成一串，每個(gè)sgrna的首端和前一個(gè)sgrna的尾端由csy4切割識(shí)別序列連接。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。

如本申請(qǐng)，包括權(quán)利要求中使用的，除非上下文中清楚地另有說(shuō)明，否則單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)，例如“一”、“一個(gè)”和“該”，包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如“植物”、“該植物”或“一個(gè)植物”也指示多個(gè)植物。并且根據(jù)上下文，使用術(shù)語(yǔ)“植物”還可指示該植物在遺傳上相似或相同的后代。類似地，術(shù)語(yǔ)“核酸”可以指核酸分子的許多拷貝。類似地，術(shù)語(yǔ)“探針”可以指代相同或相似的探針?lè)肿印?/p>

數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并明確地包括所限定的范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)和非整數(shù)分?jǐn)?shù)。除非另外指出，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，它們是指具有任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，根據(jù)上下文含義，可指代dna或rna、或其類似物。其中dna包括但不限于cdna、基因組dna、合成dna(例如人工合成)和含核酸類似物的dna(或rna)。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行已知或未知的任何功能。核酸可為雙鏈或單鏈(既有義鏈或反義單鏈)。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)移rna、核糖體rna、核酶、cdna、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離dna、任何序列的分離rna、核酸探針和引物、以及核酸類似物。

本發(fā)明中“野生型”表示生物、菌株、基因的典型形式或者當(dāng)它在自然界存在時(shí)區(qū)別于突變體或變體形式的特征。

本發(fā)明中“突變體”或“變體”是指發(fā)生突變的個(gè)體，其具有與野生型不同的序列，可能會(huì)導(dǎo)致其中序列的至少部分功能已丟失的序列，例如，在啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域中序列的變化將至少部分地影響生物體中編碼序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“突變”是指可由諸如缺失、添加、取代或重排引起的核酸序列中序列的任何變化。突變還可影響該序列參與的一個(gè)或多個(gè)步驟。例如，dna序列中的變化可導(dǎo)致有活性的、有部分活性的或無(wú)活性的改變的mrna和/或蛋白的合成。

本發(fā)明中“非天然存在的”表明人工的參與。當(dāng)指核酸分子或多肽時(shí)，表示該核酸分子或多肽至少基本上從它們?cè)谧匀唤缰谢蛉绨l(fā)現(xiàn)于自然界中的與其結(jié)合的至少另一種組分游離出來(lái)。

本發(fā)明中“表達(dá)”指感興趣的序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生對(duì)應(yīng)mrna并且該mrna翻譯產(chǎn)生對(duì)應(yīng)產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白。調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)整感興趣的序列表達(dá)，所述調(diào)節(jié)元件包括5’調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子。

本發(fā)明中“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地使用，是指具有任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含修飾的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中斷。這些術(shù)語(yǔ)還涵蓋已經(jīng)被修飾的氨基酸聚合物；這些修飾例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；?、磷酸化、或任何其他操作，如與標(biāo)記組分的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d和l旋光異構(gòu)體、以及氨基酸類似物和肽模擬物。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的dna分子。質(zhì)粒和粘粒是示例性載體。此外，術(shù)語(yǔ)“載體”和“媒介”可互換使用以指將dna片段從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞的核酸分子，因此細(xì)胞不必要屬于相同的生物(例如將dna片段從農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞)。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指含有所需要的編碼序列和在特定宿主生物中表達(dá)有效連接的編碼序列所需要的適宜核酸序列的重組dna分子。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指來(lái)自任何來(lái)源、能夠整合入基因組或自主復(fù)制的任何因子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、bac(細(xì)菌人工染色體)、自主復(fù)制型序列、噬菌體、或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈dna或rna核苷酸序列，包括其中一種或多種dna序列使用眾所周知的重組dna技術(shù)以功能性可操作方式連接的dna分子。

在本發(fā)明中，“定位結(jié)構(gòu)域”可任選地添加為蛋白部分的部分，定位結(jié)構(gòu)域可將蛋白部分或編程的蛋白部分或組裝的復(fù)合物定位至活細(xì)胞中特定細(xì)胞或亞細(xì)胞定位。定位結(jié)構(gòu)域可通過(guò)將蛋白部分的氨基酸序列融合到摻入包括以下結(jié)構(gòu)域的氨基酸來(lái)構(gòu)建：核定位信號(hào)(nls)；線粒體前導(dǎo)序列(mls)；葉綠體前導(dǎo)序列；和/或被設(shè)計(jì)以將蛋白運(yùn)輸或引導(dǎo)或定位至含有核酸的細(xì)胞器、細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞的任何細(xì)分部分的任何序列。在一些實(shí)施方案中，生物體是真核生物，且定位結(jié)構(gòu)域包括允許蛋白進(jìn)入細(xì)胞核和基因組dna內(nèi)的核定位結(jié)構(gòu)域(nls)。所述nls的序列可包括帶正電荷序列的任何功能nls。在另一些實(shí)施方案中，定位結(jié)構(gòu)域可包括使蛋白部分或編程的核蛋白進(jìn)入細(xì)胞器的前導(dǎo)序列，使細(xì)胞器dna被修飾成為可能。

本發(fā)明中，真核生物有3類rna聚合酶，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄3類不同的啟動(dòng)子。由rna聚合酶i負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的rrna基因，啟動(dòng)子(i型)比較單一，由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的兩部分序列構(gòu)成：第一部分是核心啟動(dòng)子(corepromoter)，由-45—+20位核苷酸組成，單獨(dú)存在時(shí)就足以起始轉(zhuǎn)錄；另一部分由-170—-107位序列組成，稱為上游調(diào)控元件，能有效地增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。

由rna聚合酶ⅲ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的是5srrna、trna和某些核內(nèi)小分子rna(snrna)，其啟動(dòng)子(ⅲ型)組成較復(fù)雜，又可被分為兩個(gè)亞類：一類屬于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)啟動(dòng)子，一類屬于結(jié)構(gòu)基因外啟動(dòng)子。內(nèi)啟動(dòng)子的有效啟動(dòng)依賴于基因內(nèi)部包含的兩個(gè)不連續(xù)的dna片段，這兩個(gè)dna片段包括一些不同的連續(xù)dna序列a、b或c區(qū)，兩個(gè)區(qū)之間被隔開。根據(jù)兩個(gè)區(qū)的不同組合，可以分為i類和ii類兩種：i類包括a和c區(qū)，目前發(fā)現(xiàn)其僅存在于5srrna的基因中；ii類包括a和b區(qū)，存在于trna的基因、7slrna的基因、腺病毒vai與vaii的rna中。a、b或a、c內(nèi)部dna序列是轉(zhuǎn)錄因子tfⅲa和tfⅲc轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)結(jié)合部位。在多數(shù)情況下，5’端還會(huì)有其它調(diào)節(jié)或關(guān)鍵元件，這些元件對(duì)rna的高效轉(zhuǎn)錄是必需的。這些序列的存在與否之間影響著轉(zhuǎn)錄效率。這些序列呈現(xiàn)復(fù)雜的多樣性，不過(guò)大多數(shù)啟動(dòng)子5’端-30到-20處存在著tata盒樣序列，與外啟動(dòng)子相似。外啟動(dòng)子缺乏相應(yīng)的內(nèi)部序列，僅在5’端有順式作用元件，在基因的末端有一組由4個(gè)或更多胸腺嘧啶組成的終止信號(hào)，如脊椎動(dòng)物u6核小rna和7skrna啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子都高度相似或完全相同，其位置和堿基序列高度保守，其結(jié)構(gòu)與polii啟動(dòng)子也有一定的相似性。它們的5’端順式作用元件包括幾個(gè)控制元件，在其上游約-30處存在一個(gè)tata樣序列，近-60處有一個(gè)snrnapse(snrna近似序列)和一個(gè)或多個(gè)被稱為oct的修飾序列5’-atgcaaat-3’。tata樣序列是poliii對(duì)snrna基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄特異的。tata樣元件和pse元件共同決定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇和轉(zhuǎn)錄效率。tata樣元件和pse元件之間的距離決定了rna聚合酶轉(zhuǎn)錄的特異性，但似乎tata樣元件更重要，因?yàn)樵趐se缺失的u6rna和7skrna基因轉(zhuǎn)錄中，只有轉(zhuǎn)錄效率的下降。而且，pse元件可能和b盒(boxb)相關(guān)，b盒在一定程度上可以替代pse元件。這些序列對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄具有決定性的作用，而且它們與起始位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，往往超過(guò)150bp，而對(duì)poliii內(nèi)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，一般在80bp以內(nèi)；與poliii外啟動(dòng)子相比，polii啟動(dòng)子5’端各順式作用元件的作用剛好相反，如果tata樣元件缺失，pse則可以履行tata樣元件功能，決定轉(zhuǎn)錄的起始部位。在pse上游，外啟動(dòng)子還有一個(gè)遠(yuǎn)端控制序列，其結(jié)構(gòu)與polii增強(qiáng)子oct骨架相似，但較其復(fù)雜。而在-223處還有一個(gè)cacc序列與oct骨架相連。這些遠(yuǎn)端控制序列的存在可大大提高u6rna和7skrna的表達(dá)效率。

由rna聚合酶ii負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的ii型基因包括所有蛋白質(zhì)編碼基因和部分snrna基因，后者的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與iii型基因啟動(dòng)子中的第三亞類相似，編碼蛋白質(zhì)的ii型基因啟動(dòng)子在結(jié)構(gòu)上有共同的保守序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)沒(méi)有廣泛的序列同源性，但第一個(gè)堿基為腺嘌呤，而兩側(cè)是嘧啶堿基。這個(gè)區(qū)域被稱為起始子(initiator，inr)，序列可表示為py2capy5。inr元件位于-3—+5。僅由inr元件組成的啟動(dòng)子是具有可被rna聚合酶ii識(shí)別的最簡(jiǎn)單啟動(dòng)子形式。多數(shù)ii型啟動(dòng)子有一個(gè)被稱為tata盒的共有序列，通常處于-30區(qū)，相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置比較固定。tata盒存在于所有真核生物中，tata盒是一個(gè)保守的七堿基對(duì)，也有一些ii型啟動(dòng)子不含有tata盒，這樣的啟動(dòng)子稱為無(wú)tata盒啟動(dòng)子。

本發(fā)明中所述“有效連接”或“可操作地連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示：?jiǎn)?dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供dna轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即t-dna邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中，調(diào)節(jié)元件可操作地連接至crispr系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件，從而驅(qū)動(dòng)該crispr系統(tǒng)的所述一個(gè)或多個(gè)元件的表達(dá)。一般而言，crispr(規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù))，也稱為spidr(spacer間隔開的同向重復(fù))，構(gòu)成通常對(duì)于特定細(xì)菌物種而言特異性的dna基因座的家族。該crispr座位包含在大腸桿菌中被識(shí)別的間隔開的短序列重復(fù)(ssr)的一個(gè)不同類、以及相關(guān)基因。類似的間隔開的ssr已經(jīng)鑒定于地中海富鹽菌、化膿鏈球菌、魚腥草屬和結(jié)核分枝桿菌中。這些crispr座位典型地不同于其它ssr的重復(fù)結(jié)構(gòu)，這些重復(fù)已被稱為規(guī)律間隔的短重復(fù)(srsr)。一般而言，這些重復(fù)是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定長(zhǎng)度的獨(dú)特間插序列規(guī)律地間隔開。雖然重復(fù)序列在菌株之間是高度保守的，許多間隔開的重復(fù)和這些間隔區(qū)的序列一般在菌株與菌株之間不同，已經(jīng)在40種以上的原核生物中鑒定出crispr座位。

本發(fā)明中，“靶序列”或“靶點(diǎn)序列”或“靶位點(diǎn)序列”或“靶多核苷酸”是待被作用的任何期望的預(yù)定的核酸序列，包括但不限于編碼或非編碼序列、基因、外顯子或內(nèi)含子、調(diào)節(jié)序列、基因間序列、合成序列和細(xì)胞內(nèi)寄生物序列。在一些實(shí)施方案中，靶序列存在于靶細(xì)胞、組織、器官或生物體內(nèi)。

術(shù)語(yǔ)“引物”是一段分離的核酸分子，其通過(guò)核酸雜交，退火結(jié)合到互補(bǔ)的目標(biāo)dna鏈上，在引物和目標(biāo)dna鏈之間形成雜合體，然后在聚合酶(例如dna聚合酶)的作用下，沿目標(biāo)dna鏈延伸。本發(fā)明的引物對(duì)涉及其在目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增中的應(yīng)用，例如，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或其他常規(guī)的核酸擴(kuò)增方法。

引物的長(zhǎng)度一般是11個(gè)多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個(gè)多核苷酸或更多，更優(yōu)選的是24個(gè)多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個(gè)多核苷酸或更多。這種引物在高度嚴(yán)格雜交條件下與目標(biāo)序列特異性地雜交。盡管不同于目標(biāo)dna序列且對(duì)目標(biāo)dna序列保持雜交能力的引物是可以通過(guò)常規(guī)方法設(shè)計(jì)出來(lái)的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的引物與目標(biāo)序列的連續(xù)核酸具有完全的dna序列同一性。

本發(fā)明的引物在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)dna序列雜交。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。如本發(fā)明使用的，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如本發(fā)明使用的，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合(目標(biāo)序列)”是指在嚴(yán)格雜交條件下引物僅與包含目標(biāo)序列的樣品中的目標(biāo)序列發(fā)生雜交。

本發(fā)明中，“試劑盒”可包括本發(fā)明描述的基因組修飾系統(tǒng)與以下的任一種或全部：測(cè)定試劑、緩沖液、探針和/或引物、和無(wú)菌鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的乳劑和懸液基底。此外，試劑盒可包括含有用于實(shí)踐本發(fā)明描述的方法的用法說(shuō)明(例如，操作方案)的說(shuō)明性材料。

轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的方案依定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞類型而異，即單子葉植物或雙子葉植物。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨后插入植物基因組中的適合方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將dna攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的dna導(dǎo)入。已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可按照常規(guī)的方式生長(zhǎng)成植物。這些植物被培育，用相同的轉(zhuǎn)化株或不同的轉(zhuǎn)化株授粉，得到的雜交體表達(dá)所需的被鑒定的表現(xiàn)型特征?？膳嘤蚨啻员ＷC穩(wěn)定地保持和遺傳所需表現(xiàn)型特征的表達(dá)，然后收獲可保證得到所需表現(xiàn)型特征表達(dá)的種子。

本發(fā)明提供了一種提高同源重組效率的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明首次將foki-dcas9融合蛋白應(yīng)用于提高同源重組效率，利用foki二聚體的內(nèi)切酶活性，使得同源重組靶位點(diǎn)被切開的概率提高，以提高同源重組效率。

2、本發(fā)明為基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效同源重組編輯提供了一種新的選擇，提高同源重組效率的同時(shí)，也減少了轉(zhuǎn)化受體的使用量。

下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提高同源重組效率方法中重組克隆剪刀載體dbn01-t構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明提高同源重組效率方法中重組表達(dá)載體dbn-get326構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明提高同源重組效率方法中重組表達(dá)載體dbn-get344載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明提高同源重組效率方法中重組表達(dá)載體dbn-get345載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明提高同源重組效率方法中水稻抗性愈傷gus染色標(biāo)準(zhǔn)圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提高同源重組效率方法的技術(shù)方案。

第一實(shí)施例、剪刀載體構(gòu)建

1.構(gòu)建基礎(chǔ)載體和重組克隆剪刀載體

將pcambia2300(cambia機(jī)構(gòu)可以提供)載體進(jìn)行改造，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通過(guò)點(diǎn)突變?nèi)サ魀cambia2300載體上的bsai位點(diǎn)，同時(shí)將卡那霉素表達(dá)盒去掉，得到pdbn骨架載體。向所述pdbn骨架載體引入pat表達(dá)盒，得到表達(dá)載體dbn-pat用于下述載體構(gòu)建。

將合成的csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列連入克隆載體pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步驟按promega公司產(chǎn)品pgem-t載體說(shuō)明書進(jìn)行，得到重組克隆剪刀載體dbn01-t，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點(diǎn)；lacz為lacz起始密碼子；sp6為sp6rna聚合酶啟動(dòng)子；t7為t7rna聚合酶啟動(dòng)子；csy4-t2a-foki-dcas9為csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列(csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列如seqidno:1所示；csy4氨基酸序列如seqidno:2所示，t2a多肽序列如seqidno:3所示；foki的氨基酸序列如seqidno:4所示；dcas9氨基酸序列如seqidno:5所示)；mcs為多克隆位點(diǎn))。

然后將重組克隆剪刀載體dbn01-t用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞(transgen，beijing，china，cat：cd501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒dna(重組克隆剪刀載體dbn01-t)，42℃水浴90秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有iptg(異丙基硫代-β-d-半乳糖苷)和x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/l)的lb固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，瓊脂15g/l，用naoh調(diào)ph至7.5)上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，氨芐青霉素100mg/l，用naoh調(diào)ph至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液i(25mmtris-hcl，10mmedta(乙二胺四乙酸)，50mm葡萄糖，ph8.0)懸??；加入200μl新配制的溶液ii(0.2mnaoh，1％sds(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii(3m醋酸鉀，5m醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(v/v)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含rnase(20μg/ml)的te(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化rna；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)snabi和spei酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆剪刀載體dbn01-t中插入的所述foki-dcas9核苷酸序列為序列表中seqidno:1所示的核苷酸序列，即csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列正確插入。

2.構(gòu)建重組表達(dá)剪刀載體

用限制性內(nèi)切酶snabi和spei分別酶切重組克隆剪刀載體dbn01-t和表達(dá)載體dbn-pat，將切下的csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列插入表達(dá)載體dbn-pat，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體dbn-get326，其構(gòu)建流程如圖2所示(rb：右邊界；pr35s：花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子(seqidno:6)；csy4-t2a-foki-dcas9：csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列(csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列如seqidno:1所示；csy4氨基酸序列如seqidno:2所示；t2a多肽序列如seqidno:3所示；foki的氨基酸序列如seqidno:4所示；dcas9氨基酸序列如seqidno:5所示)；t35s：花椰菜花葉病毒35s終止子(seqidno:7)；pat：草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(seqidno:8)；lb：左邊界)。

將重組表達(dá)載體dbn-get326用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌t1感受態(tài)細(xì)胞、10μl質(zhì)粒dna(重組表達(dá)載體dbn-get326)，42℃水浴90秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))；然后在含50mg/l卡那霉素(kanamycin)的lb固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，瓊脂15g/l，用naoh調(diào)ph至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，卡那霉素50mg/l，用naoh調(diào)ph至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶snabi和spei酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體dbn-get326在snabi和spei位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中seqidno:1所示核苷酸序列，即csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列。

第二實(shí)施例、水稻guus驗(yàn)證載體的構(gòu)建

1、guus靶點(diǎn)的選擇

將guus之間的靶序列信息輸入到zifit網(wǎng)站

(http://zifit.partners.org/zifit/choicemenu.aspx)中，選擇一對(duì)可用的靶點(diǎn)，即靶點(diǎn)1序列(如seqidno:9所示)和靶點(diǎn)2序列(如seqidno:10所示)。

2、水稻無(wú)靶點(diǎn)載體的構(gòu)建

本實(shí)施例中，無(wú)靶點(diǎn)載體設(shè)計(jì)為prosu6+sgrna+t35s結(jié)構(gòu)。向第一實(shí)施例中所述pdbn骨架載體引入pmi表達(dá)盒、guus表達(dá)盒，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成水稻無(wú)靶點(diǎn)載體dbn-get344，其載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示(lb：左邊界；prosu6：水稻u6啟動(dòng)子(seqidno:14)；csy4-r：csy4切割識(shí)別序列(如seqidno:11所示)；sgrna：sgrna序列(如seqidno:15所示)；t35s：花椰菜花葉病毒35s終止子(seqidno:7)；pr35s：花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子(seqidno:6)；guus：含有靶點(diǎn)1序列和靶點(diǎn)2序列的gus基因(如seqidno:16所示)；tnos：胭脂堿合成酶基因的終止子(seqidno:17)；prubi：玉米泛素(ubiquitin)基因啟動(dòng)子(seqidno:18)；pmi：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(seqidno:19)；rb：右邊界)。

按照第一實(shí)施例2中的方法，將無(wú)靶點(diǎn)載體dbn-get344用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；堿法提取的質(zhì)粒經(jīng)asci和avrii酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明無(wú)靶點(diǎn)載體dbn-get344構(gòu)建正確。

3、水稻靶點(diǎn)載體的構(gòu)建

本實(shí)施例中，靶點(diǎn)載體設(shè)計(jì)為prosu6+靶點(diǎn)+sgrna+t35s結(jié)構(gòu)。兩個(gè)靶點(diǎn)+sgrna之間連接有csy4切割識(shí)別序列。通過(guò)限制性內(nèi)切酶bsai將各個(gè)片段無(wú)縫連接在一起。csy4切割識(shí)別序列如seqidno:11所示。本實(shí)施例中使用的2個(gè)靶點(diǎn)為：

靶點(diǎn)1序列，如seqidno:9所示；

靶點(diǎn)2序列，如seqidno:10所示。

引入靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的引物如下：

正向引物：acatcaggtctccaaacggaggcattggtgcttcttggttttagagctagaaata，如seqidno:12所示；

反向引物：taggatggtctcgaaaacgtcgaggatgcctgggttgcctgcctatacggcagtgaacgcac，如seqidno:13所示；

其中，上述引物5’端的粗體小寫字母為保護(hù)堿基，斜體小寫字母為酶切位點(diǎn)bsai，帶下劃線的小寫字母為酶切位點(diǎn)bsai的粘性末端。

以合成的sgrna+cys4識(shí)別序列為模板(擴(kuò)增體系中<250ng)，將靶點(diǎn)1序列和靶點(diǎn)2序列通過(guò)上述正向引物和反向引物帶入模板，用pfu酶(neb)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr體系如下：

pcr反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)入下列循環(huán)：98℃變性10s，56-60℃退火30s，72℃延伸30s/kb，共30-32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5-10min；于4℃保存。

pcr擴(kuò)增后得到含有靶位點(diǎn)序列+sgrna+csy4切割識(shí)別序列的產(chǎn)物，使用過(guò)柱純化試劑盒(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)對(duì)上述pcr產(chǎn)物過(guò)柱純化，具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書；bsai酶切pcr產(chǎn)物和表達(dá)載體dbn-get344，切膠回收對(duì)應(yīng)酶切產(chǎn)物后，將酶切后的表達(dá)載體dbn-get344產(chǎn)物和pcr產(chǎn)物按照1:10的比例用t4連接酶于溫度16℃下連接30min，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成水稻靶點(diǎn)載體dbn-get345，其載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示(lb：左邊界；prosu6：水稻u6啟動(dòng)子(seqidno:14)；csy4-r：csy4切割識(shí)別序列(如seqidno:11所示)；靶點(diǎn)1：靶1序列(seqidno:9)；靶點(diǎn)2：靶點(diǎn)2序列(seqidno:10)；sgrna：sgrna序列(如seqidno:15所示)；t35s：花椰菜花葉病毒35s終止子(seqidno:7)；pr35s：花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子(seqidno:6)；guus：含有靶點(diǎn)1序列和靶點(diǎn)2序列的gus基因(如seqidno:16所示)；tnos：胭脂堿合成酶基因的終止子(seqidno:17)；prubi：玉米泛素(ubiquitin)基因啟動(dòng)子(seqidno:18)；pmi：磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(seqidno:19)；rb：右邊界)。

按照第一實(shí)施例2中的方法，將靶點(diǎn)載體dbn-get345用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；堿法提取的質(zhì)粒經(jīng)kpni和asci酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明靶點(diǎn)載體dbn-get345中2個(gè)靶點(diǎn)(靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2)正確插入。

第三實(shí)施例、剪刀載體和guus驗(yàn)證載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體dbn-get326、dbn-get344和dbn-get345用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌lba4404中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌lba4404、3μl質(zhì)粒dna(重組表達(dá)載體)；置于液氮中5分鐘，37℃溫水浴5分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌lba4404接種于lb試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/l的利福平(rifampicin)和50mg/l的卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體dbn-get326、dbn-get344和dbn-get345結(jié)構(gòu)完全正確。

按照以下組合將菌液等體積混合：dbn-get326和dbn-get345菌液(靶點(diǎn)處理)、dbn-get326和dbn-get344菌液(無(wú)靶點(diǎn)處理)、dbn-get344菌液(對(duì)照處理)，室溫靜置3h，獲得對(duì)應(yīng)處理的農(nóng)桿菌懸浮液。

第四實(shí)施例、獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻愈傷

對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，把水稻種子(日本晴，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、麥芽糖30g/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、植物凝膠3g/l，ph5.8)上，從水稻成熟胚誘導(dǎo)出愈傷組織(步驟1：愈傷誘導(dǎo)步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用上述3種處理的農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⒛康臉?gòu)建體傳遞至愈傷組織上的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟2：侵染步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(od660＝0.3，侵染培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、葡萄糖10g/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、ph5.4))中以啟動(dòng)接種。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟3：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、葡萄糖10g/l、乙酰丁香酮(as)40mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、植物凝膠3g/l，ph5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個(gè)“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、蔗糖30g/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、植物凝膠3g/l，ph5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素(頭孢霉素150-250mg/l)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4：恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的愈傷組織在含選擇劑(甘露糖和/或草銨膦)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5：選擇步驟)。優(yōu)選地，所述靶點(diǎn)處理的愈傷組織和所述無(wú)靶點(diǎn)處理的愈傷組織在有甘露糖和草銨膦的篩選固體培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、蔗糖5g/l、甘露糖12.5g/l、草胺磷4mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、植物凝膠3g/l，ph5.8)上培養(yǎng)，所述對(duì)照處理的愈傷組織在有甘露糖的篩選固體培養(yǎng)基(n6鹽3.1g/l、n6維他命、干酪素300mg/l、蔗糖5g/l、甘露糖12.5g/l、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)2mg/l、植物凝膠3g/l，ph5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。將上述篩選得到的抗性愈傷組織進(jìn)行g(shù)us染色分析。

第五實(shí)施例、水稻愈傷的gus染色測(cè)定

分別取穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得的靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織、無(wú)靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織和對(duì)照處理的抗性愈傷組織作為樣品，參照jefferson等(jeffersonr.a.,burgesss.m.,hirshd.beta-glucuronidasefromescherichiacoliasagenefusionmarker.proc.natl.acad.sci.,1986,83:8447-8454)的方法，通過(guò)在gus染色液中37℃密封染色1-2天，從組織化學(xué)上檢驗(yàn)gus的表達(dá)方式，即guus突變?yōu)間us酶后會(huì)將x-gluc原位分解產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，從而可以說(shuō)明foki-dcas9有助于使guus恢復(fù)gus染色。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)做10個(gè)抗性愈傷組織，取平均值。具體方法如下：

步驟1、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡糖苷酸(x-gluc)按照40mg/ml的濃度溶解到二甲基亞砜(dmso)中，用錫箔紙密封后置于-80℃冰箱中保存；

步驟2、配制gus染色液：100mmnah2po4、10mmna2edta、0.5mmk4[fe(cn)6]·3h2o、0.5mmk3[fe(cn)6]、體積比為1％的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，用ph計(jì)調(diào)ph至7.0，加水定容至1l；

步驟3、在步驟2配制好的gus染色液中加入步驟1密封保存的x-gluc，使x-gluc終濃度為0.5mg/ml，用于gus染色；

步驟4、分別取靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織、無(wú)靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織和對(duì)照處理的抗性愈傷組織各30個(gè)，每3?？剐杂鷤M織放入1支2ml離心管中，加入步驟3獲得的gus染色液并沒(méi)過(guò)樣品，于37℃恒溫箱中放置24-48h后，目測(cè)染色情況。

gus染色結(jié)果如表1所示，在上述gus染色驗(yàn)證同源重組效率的實(shí)驗(yàn)中，將gus染色的程度分為四個(gè)等級(jí)，即+++、++、+、-，依次表示大部分細(xì)胞深藍(lán)色、僅不到一半細(xì)胞藍(lán)色、少數(shù)細(xì)胞藍(lán)色、無(wú)藍(lán)色)，gus染色標(biāo)準(zhǔn)如圖5所示，gus染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，約有24％所述靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織發(fā)生了gus回復(fù)突變(染色程度為+的占14.00％)，說(shuō)明靶點(diǎn)與foki-dcas9融合蛋白共轉(zhuǎn)化時(shí)可以促進(jìn)同源重組的發(fā)生；僅有3.00％的所述對(duì)照處理的抗性愈傷組織的少數(shù)細(xì)胞被gus染成藍(lán)色(染色程度為+)；值得注意的是，在沒(méi)有靶點(diǎn)存在的情況下，約有17.20％所述無(wú)靶點(diǎn)處理的抗性愈傷組織發(fā)生了gus回復(fù)突變(染色程度為+)，比所述對(duì)照處理的抗性愈傷組織的同源重組效率提高4.7倍，說(shuō)明當(dāng)不存在切割(無(wú)靶點(diǎn))時(shí)，foki-dcas9融合蛋白能單獨(dú)促進(jìn)同源重組的產(chǎn)生，并且通過(guò)過(guò)量表達(dá)能顯著提高同源重組效率。

綜上所述，本發(fā)明了首次提供了foki-dcas9融合蛋白能夠促進(jìn)同源重組的發(fā)生，并且顯著提高細(xì)胞內(nèi)同源重組效率，同時(shí)也大大的減少了對(duì)轉(zhuǎn)化受體的需求，為高效同源重組編輯提供了一種新的選擇。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。

sequencelisting

<110>北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司

<120>提高同源重組效率的方法

<130>dbnbc120

<160>19

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>5523

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>csy4-t2a-foki-dcas9核苷酸序列

<400>1

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ctgatgagcgtgctgttcggcaagctgcaccaggcactggtggcccagggcggcgacagg120

atcggcgtgagcttcccggacctggacgagagcaggagcaggctgggcgagaggctgaga180

atccacgccagcgccgacgacctgagggcactgctggccaggccgtggctggagggcctg240

agggaccacctgcaattcggcgagccggccgtggtgccgcacccgaccccgtacaggcag300

gtgagcagggtgcaggccaagagcaacccggagaggctgaggaggaggctgatgaggagg360

cacgacctgagcgaggaggaggccaggaagagaatcccggacaccgtggcaagggccctg420

gacctgccgttcgtgaccctgaggagccagagcaccggccagcacttcaggctgttcatc480

aggcacggcccgctacaggtgaccgccgaggagggcggcttcacctgctacggcctgagc540

aagggcggcttcgtgccgtggttcgagggcaggggcagcctgctgacctgcggcgacgtg600

gaggagaacccgggcccgatgccgaagaagaagaggaaggtgtcctcccagctcgtgaag660

tccgagctcgaggagaagaagtccgagctccgccacaagctcaagtacgtgccgcacgag720

tacatcgagctcatcgagatcgcccgcaactccacccaggaccgcatcctcgagatgaag780

gtgatggagttcttcatgaaggtgtacggctaccgcggcaagcacctcggcggctcccgc840

aagccggacggcgccatctacaccgtgggctccccgatcgactacggcgtgatcgtggac900

accaaggcctactccggcggctacaacctcccgatcggccaggccgacgagatgcagcgc960

tacgtggaggagaaccagacccgcaacaagcacatcaacccgaacgagtggtggaaggtg1020

tacccgtcctccgtgaccgagttcaagttcctcttcgtgtccggccacttcaagggcaac1080

tacaaggcccagctcacccgcctcaaccacatcaccaactgcaacggcgccgtgctctcc1140

gtggaggagctcctcatcggcggcgagatgatcaaggccggcaccctcaccctcgaggag1200

gtgcgccgcaagttcaacaacggcgagatcaacttcggcggcggcggcagcatggactac1260

aaggaccacgacggggattacaaagaccacgacatagactacaaggatgacgatgacaaa1320

atggcaccgaagaaaaaaaggaaggtcggaatccatggcgttccagctgccgataagaaa1380

tattccatcggactcgccattggcacgaatagcgtcggatgggctgttattactgatgag1440

tacaaagttccgtctaagaagttcaaggtgctgggcaacacagaccgccacagcataaag1500

aaaaatctcatcggtgcactccttttcgatagtggggagactgcagaagcgacaagattg1560

aaaaggactgcgagaaggcgctatacacggcgtaagaatagaatctgctaccttcaggag1620

attttctctaacgaaatggctaaggtcgatgacagtttctttcatagacttgaggaatcg1680

ttcttggttgaggaggataagaaacatgagaggcacccgatatttggaaacatcgtggat1740

gaggtcgcatatcatgaaaagtaccccacaatctaccacctgagaaagaaactcgttgat1800

tccaccgacaaagcggatttgagactcatctacctcgctcttgcccatatgataaagttc1860

cgcggacactttctgatcgagggcgacctcaaccctgataatagcgacgtcgataagctc1920

ttcatccagttggttcaaacctacaatcagctctttgaggaaaacccaattaatgctagt1980

ggagtggatgcaaaagcgatactgtcggccagactctccaagagcagaaggttggagaac2040

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gataggtttaacgcttcccttggcacataccatgacctccttaagatcattaaggacaaa3180

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