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一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用與流程

文檔序號:12697641閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜,其特征在于:該指紋圖譜由8對SSR標(biāo)記組成,具體序列如下:

1140正向引物:CCCAAAAAGGATTTCAGCAA;

反向引物:AACCGGAGTGGTGTAAGTGC;

76正向引物:AAGCAGGTCAGAGCAGGTTC;

反向引物:ACCGAGAGCAGAGTCGAGAG;

43正向引物:CTCTTTGCACCCTCAACCTC;

反向引物:CAGCAGTCTCCTCTTGGCTC;

16正向引物:ATAGGATGATTGAACGAGCAG;

反向引物:ACCGTAAGGTGGGAAGAAA;

19正向引物:ATGCCGTTCCAAAGATAC;

反向引物:TCTGTAACGCTTGTGGACTA;

148-1正向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;

反向引物:CATTGCTCGGATCCTTCATT;

002正向引物:GGGCGAAACAATTTCAGGTA;

反向引物:ATGCCATCGTAAGGAACTCG;

192-1正向引物:ACGCGTATCCTCCCCTAAGT;

反向引物:AAGCGATATGGATTTGACGC;

所述菌種的帶型編號組合為:(1) (2+4) (3) (1+4) (2+3+4) (1+4) (1) (2)。

2.一種如權(quán)利要求1所述的香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,包括:

(1)將香菇菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基PDB中,23-25℃下避光搖瓶培養(yǎng),3-4d后收集菌絲;

(2)用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA,檢測總基因組DNA濃度和純度,調(diào)整樣品DNA的濃度一致;

(3)對上述提取的DNA進(jìn)行8對SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增;

(4)將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻,變性,點(diǎn)樣于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,銀染,顯色,拍照,分析結(jié)果。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括:

(1)將-20℃冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末,加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液,于65℃保溫45-60min,輕搖混勻;

(2)12000rpm、4℃離心20min,取上清液;

(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液,混勻10min,12000rpm、4℃離心10min,取上清液移入離心管中;

(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液,混勻10min,12000rpm、4℃離心10min,取上清液移入另一離心管中;

(5)在上述離心管中加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇,搖動(dòng)5min,8000rpm、4℃離心10min,去上清;

(6)將得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次,每次8000rpm,室溫離心5min;

(7)加入預(yù)冷的95vol%乙醇,上下顛倒,8000rpm室溫離心10min,棄乙醇,真空抽干或自然晾干;

(8)加入100μL 1×TE緩沖液,使沉淀溶解;

(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h,去除RNA;

(10)將得到的DNA提取物于-20℃貯藏備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(3)中的PCR擴(kuò)增體系為:總體積20μL,包括:10×PCR buffer 2μL,25mmol/L MgCl22μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μL Taq DNA酶0.2μL,10μmol/L SSR標(biāo)記正向引物和反向引物總體積各1.5μL,濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL,ddH2O 10.4μL;

PCR反應(yīng)條件:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(4)中的加樣緩沖液用量為2μL;PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物點(diǎn)樣量為3μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(4)中的變性的具體工藝為于95℃變性5min,結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3min。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(4)中的電泳的工藝參數(shù)為:變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6%,電泳緩沖液為1×TBE,電壓1000v,電流200mA,功率200W,電泳45min。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述步驟(4)中的銀染的具體工藝為:電泳完成后卸下并拆開玻璃板,膠板卸下后,用去離子水水洗5-8s,瀝干水分后,在銀染液中避光銀染8min,銀染后,用去離子水水洗5-8s,瀝干水分,放入顯影液中,至顯影后取出水洗后即可讀數(shù)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法,其特征在于:所述銀染液的組成為1.5g AgNO3和1500ml H2O;顯影液的組成為16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。

10.一種如權(quán)利要求1所述的香菇L135菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用,其特征在于:應(yīng)用于鑒定香菇L135菌種相對于其他香菇栽培品種的特異性。

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