本發(fā)明涉及凝血酶抗體以及其抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及包含所述凝血酶抗體cdr區(qū)的嵌合抗體、人源化抗體，本發(fā)明還涉及包含所述凝血酶抗體及其抗原結(jié)合片段的藥物組合物，以及其作為抗凝藥物的用途。
背景技術(shù)：
：血液凝固是防止受損血管出血(止血)的重要過程。然而，阻塞血液流經(jīng)血管(血栓形成)或脫落后沉積在體內(nèi)其它部位的血管(血栓栓塞)的血凝塊對健康是嚴(yán)重的威脅。血栓癥(如急性心肌梗塞(ami)、靜脈血栓塞等)是一類嚴(yán)重危及人類健康及生命的心血管疾病。世界衛(wèi)生組織2008年統(tǒng)計，到目前，心血管發(fā)病及死亡率已經(jīng)躍居第一位。世界每年心血管病死亡人數(shù)約1733萬人，占死亡總數(shù)30％，中國心血管患者2.9億人，每年死亡約350萬人，占總死亡原因41％。2010年全球疾病負(fù)擔(dān)研究(gbd)統(tǒng)計，中風(fēng)是我國居民第一大死因。所以近年來，研究有效的治療心血管疾病的藥物及方法引起了人們越來越多的關(guān)注。目前，一些抗凝血療法可以治療病理學(xué)血液凝固，例如使用傳統(tǒng)藥物肝素、小分子肝素或華法林，或者使用直接凝血酶抑制劑達(dá)比加群酯(dabigatran)等。這些療法的普遍缺陷是增加出血風(fēng)險。許多抗凝藥物起效劑量(阻止血栓形成)和安全劑量(最高無出血風(fēng)險)之間的窗口不夠大，考慮到個體病人的反應(yīng)差異，該窗口將進(jìn)一步縮小。以凝血酶為靶點，用凝血酶拮抗劑來抑制血栓的生成即是臨床治療血栓的方法之一。凝血反應(yīng)是一個復(fù)雜的信號級聯(lián)過程，凝血酶(thrombin)在其中占有核心地位。凝血酶將循環(huán)系統(tǒng)的纖維蛋白原分解為纖維蛋白單體(可聚合形成纖維蛋白，血液凝塊的纖維基質(zhì))，對細(xì)胞也有很多直接調(diào)控。作為一種絲氨酸蛋白酶，它觸發(fā)血小板發(fā)生形變，釋放血小板活化劑adp、血清素和血栓烷a2，以及趨化因子和生長因子。除此以外，還促進(jìn)粘附分子p-選擇素和cd40配體遷移到血小板表面，進(jìn)而激活整合素aiib/b3。后者結(jié)合纖維蛋白原和血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vwf)，進(jìn)而介導(dǎo)血小板的聚集。凝血酶還刺激血小板表面的促凝血活性，反過來促進(jìn)凝血酶的表達(dá)。在內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)中，凝血酶促進(jìn)vwf的釋放，細(xì)胞質(zhì)膜的p-選擇素的出現(xiàn)和趨化因子的產(chǎn)生。這些反應(yīng)被認(rèn)為觸發(fā)體內(nèi)血小板和白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表面的結(jié)合。內(nèi)皮細(xì)胞隨即改變形狀，內(nèi)皮細(xì)胞層通透性增加。這些反應(yīng)被預(yù)計將促進(jìn)血漿蛋白的局部滲出，促進(jìn)水腫。在非內(nèi)皮組織中，凝血酶通過作用于平滑肌細(xì)胞引起血管收縮。在成纖維細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，凝血酶調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生并促進(jìn)有絲分裂，在t淋巴細(xì)胞中它觸發(fā)鈣信號和其他的反應(yīng)。這些細(xì)胞反應(yīng)表明凝血酶將組織損傷與止血過程、炎癥反應(yīng)、甚至加強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)體調(diào)控關(guān)聯(lián)在了一起。這些細(xì)胞反應(yīng)也提出了一種可能性：除了組織受損外，內(nèi)皮細(xì)胞和其他類型細(xì)胞的凝血酶可能在白細(xì)胞外滲，血管重塑和/或血管生成中也扮演了一定的角色。因此，凝血酶成為了一個極具潛力的，新的抗凝血抗栓靶標(biāo)。目前還沒有抗凝血酶抗體藥物上市或進(jìn)入臨床，相關(guān)的抗體專利有wo2013123591、wo2013088164、wo2014153195、wo2014202992和wo2014202993。本發(fā)明提供一種親和力高，對血栓生成具有顯著抑制活性的新型凝血酶抗體。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含1個或多個選自以下的cdr區(qū)序列或與其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：抗體重鏈可變區(qū)hcdr區(qū)序列：seqidno:7，seqidno:8和seqidno:9；和抗體輕鏈可變區(qū)lcdr區(qū)序列：seqidno:10，seqidno:11和seqidno:12。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述凝血酶抗體包含分別如seqidno:7，seqidno:8和seqidno:9所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，或與seqidno:7，seqidno:8和seqidno:9具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段包含分別如seqidno:10，seqidno:11和seqidno:12所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，或與seqidno:10，seqidno:11和seqidno:12具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段為兔源抗體或其功能片段。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)進(jìn)一步包含兔源κ鏈或兔源κ鏈變體的輕鏈fr區(qū)、或進(jìn)一步包含兔源λ鏈或兔源λ鏈變體的輕鏈fr區(qū)；和/或其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)進(jìn)一步包含兔源igg或其變體的重鏈fr區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段包含seqidno:5的重鏈可變區(qū)序列和seqidno:6的輕鏈可變區(qū)序列。在本文中所述的凝血酶抗體為兔源抗體。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含兔源κ鏈或其變體的輕鏈恒定區(qū)、或者兔源λ鏈或其變體的輕鏈恒定區(qū)；和/或其中所述的凝血酶抗體進(jìn)一步包含兔源igg或其變體的重鏈恒定區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段為嵌合抗體或其功能片段。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段為人源化抗體或其功能片段。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的人源化抗體或其功能片段的重鏈fr區(qū)序列來源于人種系重鏈ighv3-66*01和hjh4.1的組合序列及其突變序列；其中所述的人源化抗體或其功能片段包含人種系重鏈ighv3-66*01的fr1、fr2、fr3區(qū)和hjh4.1的fr4區(qū)及其突變序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體或其功能片段包含seqidno:13所示的重鏈可變區(qū)，或與seqidno:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)；優(yōu)選與seqidno:13的氨基酸序列具有0-10的氨基酸變化。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的人源化抗體或其功能片段的重鏈fr區(qū)序列有0-10個氨基酸的回復(fù)突變，優(yōu)選所述回復(fù)突變選自v47i,s48g,r70k,l75v,a93v和y91f的氨基酸回復(fù)突變。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體或其功能片段包含seqidno:16所示的重鏈可變區(qū)，或與seqidno:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的人源化抗體或其功能片段的輕鏈fr區(qū)序列來源于人種系輕鏈模板iglv4-60*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列；其中所述的人源化抗體或其功能片段包含人種系輕鏈iglv4-60*01的fr1、fr2、fr3區(qū)和hjk4.1的fr4區(qū)及其突變序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體或其功能片段包含seqidno:14所示的輕鏈可變區(qū)序列，或與seqidno:14具有至少95％序列同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)序列；所述的與seqidno:14的氨基酸序列具有0-10個氨基酸變化。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的人源化抗體或其功能片段的輕鏈fr區(qū)序列有0-10個氨基酸的回復(fù)突變，優(yōu)選所述回復(fù)突變選自k49e,p2l,h36y,y91h,q1e和d89t的氨基酸回復(fù)突變。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體或其功能片段包含seqidno:14、seqidno:15或seqidno:17所示的輕鏈可變區(qū)，或與seqidno:14、seqidno:15或seqidno:17具有至少95％序列同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體或其功能片段包含(a)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的序列選自seqidno:13、seqidno:16以及與seqidno:13或seqidno:16具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或/和(b)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)的序列選自seqidno:14、seqidno:15或seqidno:17以及與seqidno:14、seqidno:15或seqidno:17具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自以下組的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：1)seqidno:13的重鏈可變區(qū)和seqidno:14的輕鏈可變區(qū)；2)seqidno:13的重鏈可變區(qū)和seqidno:15的輕鏈可變區(qū)；3)seqidno:16的重鏈可變區(qū)和seqidno:15的輕鏈可變區(qū)；4)seqidno:16的重鏈可變區(qū)和seqidno:14的輕鏈可變區(qū)；5)seqidno:13的重鏈可變區(qū)和seqidno:17的輕鏈可變區(qū)；和6)seqidno:16的重鏈可變區(qū)和seqidno:17的輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述凝血酶抗體進(jìn)一步包含選自人源igg1、igg2、igg3、igg4和其變體的重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選包含人源igg4或其變體的重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選例如本發(fā)明seqidno:18所示的重鏈恒定區(qū)。所述嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進(jìn)一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恒定區(qū)，優(yōu)選例如本發(fā)明seqidno:19所示的恒定區(qū)。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述抗原結(jié)合片段是選自fab、fab'、f(ab')2、單鏈抗體(scfv)、二聚化的v區(qū)(雙抗體)、二硫鍵穩(wěn)定化的v區(qū)(dsfv)和包含cdr的肽的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的如上所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種編碼如上所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段的dna分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種如上所述的dna分子的表達(dá)載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種如上所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，優(yōu)選為真核細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種如上所述的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段或如上所述的藥物組合物，在制備用于治療凝血酶介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述的疾病或病癥優(yōu)選為血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)；更優(yōu)選為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風(fēng)和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；最優(yōu)選靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風(fēng)和動脈粥樣硬化。可以使用本發(fā)明的抗體診斷的示例性疾病包括血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)，其包括以下的任何一種或多種：靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風(fēng)和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈?。弧Ｔ谝环矫嬷?，本發(fā)明提供治療或預(yù)防個體中的高膽固醇血癥和/或至少一種以下癥狀的方法：靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風(fēng)和動脈粥樣硬化，所述方法包括向所述個體施用有效量的抗凝血酶抗體。本發(fā)明還提供有效量的拮抗胞外或循環(huán)凝血酶的抗凝血酶抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防個體的血栓形成和/或至少一種以下癥狀：肺栓塞、血栓形成引起的中風(fēng)和動脈粥樣硬化。在一方面中，本發(fā)明用于檢測或測定人凝血酶的試劑，所述試劑包含上述抗體或其抗原結(jié)合片段。附圖說明圖1：抗凝血酶抗體ch-1512對人凝血酶酶活性的影響；數(shù)據(jù)結(jié)果顯示凝血酶抗體ch-1512與凝血酶結(jié)合后并不影響其對底物s2228的酶解活性；圖2：抗凝血酶抗體h1512-12對人凝血酶酶活性的影響；數(shù)據(jù)結(jié)果顯示凝血酶抗體h1512-12與凝血酶結(jié)合后并不影響其對底物s2228的酶解活性；圖3：不同濃度凝血酶抗體對正常人血漿aptt值的影響；數(shù)據(jù)結(jié)果顯示隨著抗體h1512-12濃度的增加，正常人血漿的aptt值也有所延長；h1512-12在最高濃度3200nm時，aptt值的增加也達(dá)到33.6秒的峰值；圖4：本發(fā)明抗體在大鼠體內(nèi)的藥效測試，抗體h1512-12靜脈注射對氯化鐵誘導(dǎo)腹主靜脈血栓形成的影響；數(shù)據(jù)結(jié)果顯示尾靜脈注射h1512-12，在6mg/kg及12mg/kg的劑量下，能顯著的抑制血栓的生成；h1512-12-6mg/kg組與h1512-12-12mg/kg組的平均血栓重量，分別降低至2.91毫克和0.18毫克，與同型抗體組(igg-6mg/kg)的平均血栓重量10.75毫克相比較，具有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著差異(***p<0.001)；圖5：食蟹猴動靜脈吻合模型手術(shù)后血栓重量，顯示在6mg/kg的劑量下，h1512-12能顯著的抑制獼猴血栓的生成,與同型抗體組(igg-6mg/kg)的平均血栓重量相比較，具有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著差異(***p<0.001)。具體實施方式一.術(shù)語為了更容易理解本發(fā)明，以下具體定義了某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。本發(fā)明所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如j.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。本發(fā)明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的氨基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據(jù)此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相應(yīng)的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類ig根據(jù)其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如igg可分為igg1、igg2、igg3、igg4。輕鏈通過恒定區(qū)的不同分為κ鏈或λ鏈。五類ig中每類ig都可以有κ鏈或λ鏈。在本發(fā)明中，本發(fā)明所述的抗體輕鏈可進(jìn)一步包含輕鏈恒定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)包含人源或兔源的κ、λ鏈或其變體。在本發(fā)明中，本發(fā)明所述的抗體重鏈可進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，所述的重鏈恒定區(qū)包含人源或兔源的igg1、igg2、igg3、igg4或其變體?？贵w重鏈和輕鏈靠近n端的約110個氨基酸的序列變化很大，為可變區(qū)(fv區(qū))；靠近c端的其余氨基酸序列相對穩(wěn)定，為恒定區(qū)?？勺儏^(qū)包括3個高變區(qū)(hvr)和4個序列相對保守的骨架區(qū)(fr)。3個高變區(qū)決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(qū)(cdr)。每條輕鏈可變區(qū)(lcvr)和重鏈可變區(qū)(hcvr)由3個cdr區(qū)4個fr區(qū)組成，從氨基端到羧基端依次排列的順序為：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。輕鏈的3個cdr區(qū)指lcdr1、lcdr2、和lcdr3；重鏈的3個cdr區(qū)指hcdr1、hcdr2和hcdr3。本發(fā)明所述的抗體或抗原結(jié)合片段的lcvr區(qū)和hcvr區(qū)的cdr氨基酸殘基在數(shù)量和位置符合已知的kabat編號規(guī)則(lcdr1-3，hcde2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規(guī)則(hcdr1)。本發(fā)明的抗體包括兔源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，優(yōu)選人源化抗體。術(shù)語″兔類動物″是指分類學(xué)兔形目(lagomorpha)的成員，包括兔科(leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(ochotonidae)(鼠兔)。在最優(yōu)選實施方案中，兔類動物是兔。本文中使用的術(shù)語“兔”是指屬于兔科(leporidae)的動物。術(shù)語“兔源抗體”在本發(fā)明中為根據(jù)本領(lǐng)域知識和技能制備的對人凝血酶的單克隆抗體。制備時用凝血酶抗原注射試驗對象，然后分離表達(dá)具有所需序列或功能特性的抗體的單克隆抗體。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述的兔源凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段，可進(jìn)一步包含兔源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區(qū)，或進(jìn)一步包含兔源igg或其變體的重鏈恒定區(qū)。術(shù)語“嵌合抗體(chimericantibody)”，是將兔源性抗體的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而成的抗體。建立嵌合抗體，可以用噬菌體展示技術(shù)獲得兔抗可變區(qū)基因，再將兔可變區(qū)基因與人恒定區(qū)基因連接成嵌合基因后插入表達(dá)載體中，最后在真核系統(tǒng)或原核系統(tǒng)中表達(dá)嵌合抗體分子。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述的凝血酶嵌合抗體的抗體輕鏈進(jìn)一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區(qū)。所述的凝血酶嵌合抗體的抗體重鏈進(jìn)一步包含人源igg1、igg2、igg3、igg4或其變體的重鏈恒定區(qū)，優(yōu)選包含人源igg1、igg2或igg4重鏈恒定區(qū)，或者使用氨基酸突變(如yte突變)后延長抗體在血清中的半衰期的igg1、igg2或igg4變體。術(shù)語“人源化抗體(humanizedantibody)”，也稱為cdr移植抗體(cdr-graftedantibody)，是指將兔的cdr序列移植到人的抗體可變區(qū)框架，即不同類型的人種系抗體構(gòu)架序列中產(chǎn)生的抗體。可以克服嵌合抗體由于攜帶大量兔蛋白成分，從而誘導(dǎo)的異源性反應(yīng)。此類構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共dna數(shù)據(jù)庫或公開的參考文獻(xiàn)獲得。如人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列可以在“vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(在因特網(wǎng)www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在kabat，e.a.等人，1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區(qū)框架序列進(jìn)行最少反向突變或回復(fù)突變，以保持活性。本發(fā)明的人源化抗體也包括進(jìn)一步由噬菌體展示對cdr進(jìn)行親和力成熟后的人源化抗體。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述的凝血酶人源化抗體中兔的cdr序列選自seqidno:7,8,9,10,11或12；人的抗體可變區(qū)框架經(jīng)過設(shè)計選擇，其中所述抗體重鏈可變區(qū)上的重鏈fr區(qū)序列，來源于人種系重鏈ighv3-66*01和hjh4.1的組合序列；其中所述抗體輕鏈可變區(qū)上的輕鏈fr區(qū)序列，來源于人種系重鏈iglv4-60*01和hjk4.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區(qū)可進(jìn)行最少反向突變，以保持活性。cdr的移植可由于與抗原接觸的構(gòu)架殘基而導(dǎo)致產(chǎn)生的凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細(xì)胞高度突變的結(jié)果。因此，可能仍然需要將此類供體構(gòu)架氨基酸移植至人源化抗體的構(gòu)架。來自非人凝血酶抗體或其抗原結(jié)合片段的參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基可通過檢查兔單克隆抗體可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)來鑒定。cdr供體構(gòu)架中與種系不同的的各殘基可被認(rèn)為是相關(guān)的。如果不能確定最接近的種系，那么可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分?jǐn)?shù)的兔序列的共有序列相比較。稀有構(gòu)架殘基被認(rèn)為可能是體細(xì)胞高度突變的結(jié)果，從而在結(jié)合中起著重要作用。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”或“功能片段”是指保持抗體特異性結(jié)合抗原(例如，凝血酶)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”中包含的結(jié)合片段的實例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)f(ab')2片段，包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段，(iii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體的單臂的vh和vl結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(v)單結(jié)構(gòu)域或dab片段(ward等人,(1989)nature341：544-546)，其由vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(cdr)或(vii)可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的cdr的組合。此外，雖然fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產(chǎn)生為其中vl和vh區(qū)配對形成單價分子的單個蛋白質(zhì)鏈(稱為單鏈fv(scfv)；參見，例如，bird等人(1988)science242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sciusa85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”中。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得此類抗原結(jié)合片段，并且以與對于完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段?？赏ㄟ^重組dna技術(shù)或通過酶促或化學(xué)斷裂完整免疫球蛋白來產(chǎn)生抗原結(jié)合部分?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。術(shù)語“單鏈抗體”、“單鏈fv”或“scfv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；vh)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；vl)的分子。此類scfv分子可具有一般結(jié)構(gòu)：nh2-vl-接頭-vh-cooh或nh2-vh-接頭-vl-cooh。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的ggggs氨基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重復(fù)的變體(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。術(shù)語“cdr”是指抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)主要促成抗原結(jié)合的6個高變區(qū)之一。所述6個cdr的最常用的定義之一由kabate.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.nihpublication91-3242)提供。如本文中使用的，cdr的kabat定義只應(yīng)用于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr1、cdr2和cdr3(cdrl1、cdrl2、cdrl3或l1、l2、l3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2和cdr3(cdrh2、cdrh3或h2、h3)。本文中使用的術(shù)語“抗體構(gòu)架”，是指可變結(jié)構(gòu)域vl或vh的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)(cdr)的支架。從本質(zhì)上講，其是不具有cdr的可變結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的部位(例如，凝血酶分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構(gòu)象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸。參見，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。術(shù)語“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指抗體對預(yù)先確定的抗原上的表位的結(jié)合。通常，抗體以大約小于10-7m，例如大約小于10-8m、10-9m或10-10m或更小的親和力(kd)結(jié)合。術(shù)語“kd”或“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，本發(fā)明的抗體以小于大約10-7m，例如小于大約10-8m、10-9m或10-10m或更小的解離平衡常數(shù)(kd)結(jié)合凝血酶，例如，如使用表面等離子體共振(spr)技術(shù)在biacore儀中測定的。本文中使用的術(shù)語“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈dna。當(dāng)將核酸與另一個核酸序列置于功能關(guān)系中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子或增強(qiáng)子有效地連接至所述編碼序列。術(shù)語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質(zhì)粒”，其是指可將另外的dna區(qū)段連接至其中的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的dna區(qū)段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組，從而隨宿主基因組一起復(fù)制(例如，非附加型哺乳動物載體)。現(xiàn)有技術(shù)中熟知生產(chǎn)和純化抗體和抗原結(jié)合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術(shù)指南，5-8章和15章。例如，兔可以用人凝血酶或其片段免疫，所得到的抗體能被復(fù)性、純化，并且可以用常規(guī)的方法進(jìn)行氨基酸測序?？乖Y(jié)合片段同樣可以用常規(guī)方法制備。發(fā)明所述的抗體或抗原結(jié)合片段用基因工程方法在非人源的cdr區(qū)加上一個或多個人源fr區(qū)。人fr種系序列可以通過比對imgt人類抗體可變區(qū)種系基因數(shù)據(jù)庫和moe軟件，從immunogenetics(imgt)的網(wǎng)站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜志，2001isbn012441351上獲得。術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指已向其中引入了表達(dá)載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可包括細(xì)菌、微生物、植物或動物細(xì)胞。易于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(escherichiacoli)或沙門氏菌(salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；鏈球菌(streptococcus)和流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)。適當(dāng)?shù)奈⑸锇ㄡ劸平湍?saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(pichiapastoris)。適當(dāng)?shù)膭游锼拗骷?xì)胞系包括cho(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系)和ns0細(xì)胞。本發(fā)明工程化的抗體或抗原結(jié)合片段可用常規(guī)方法制備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cdna序列，可以克隆并重組至gs表達(dá)載體。重組的免疫球蛋白表達(dá)載體可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞。作為一種更推薦的現(xiàn)有技術(shù)，哺乳動物類表達(dá)系統(tǒng)會導(dǎo)致抗體的糖基化，特別是在fc區(qū)的高度保守n端位點。通過表達(dá)與人凝血酶特異性結(jié)合的抗體得到穩(wěn)定的克隆。陽性的克隆在生物反應(yīng)器的無血清培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)以生產(chǎn)抗體。分泌了抗體的培養(yǎng)液可以用常規(guī)技術(shù)純化。比如，用含調(diào)整過的緩沖液的a或gsepharoseff柱進(jìn)行純化。洗去非特異性結(jié)合的組分。再用ph梯度法洗脫結(jié)合的抗體，用sds-page檢測抗原結(jié)合片段，收集。抗體可用常規(guī)方法進(jìn)行過濾濃縮?？扇艿幕旌衔锖投嗑垠w，也可以用常規(guī)方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產(chǎn)物需立即冷凍，如-70℃，或者凍干?！敖o予”和“處理”當(dāng)應(yīng)用于動物、人、實驗受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體的接觸?！敖o予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學(xué)、診斷、研究和實驗方法。細(xì)胞的處理包括試劑與細(xì)胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細(xì)胞接觸?！敖o予”和“處理”還意指通過試劑、診斷、結(jié)合組合物或通過另一種細(xì)胞體外和離體處理例如細(xì)胞。“處理”當(dāng)應(yīng)用于人、獸醫(yī)學(xué)或研究受試者時，是指治療處理、預(yù)防或預(yù)防性措施，研究和診斷應(yīng)用?！爸委煛币庵附o予患者內(nèi)用或外用治療劑，例如包含本發(fā)明的任一種結(jié)合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病癥狀，而已知所述治療劑對這些癥狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病癥狀的量給予治療劑，以誘導(dǎo)這類癥狀退化或抑制這類癥狀發(fā)展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病癥狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據(jù)多種因素變化，例如患者的疾病狀態(tài)、年齡和體重，以及藥物在患者產(chǎn)生需要療效的能力。通過醫(yī)生或其它專業(yè)衛(wèi)生保健人士通常用于評價該癥狀的嚴(yán)重性或進(jìn)展?fàn)顩r的任何臨床檢測方法，可評價疾病癥狀是否已被減輕。盡管本發(fā)明的實施方案(例如治療方法或制品)在緩解每個目標(biāo)疾病癥狀方面可能無效，但是根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計學(xué)檢驗方法如studentt檢驗、卡方檢驗、依據(jù)mann和whitney的u檢驗、kruskal-wallis檢驗(h檢驗)、jonckheere-terpstra檢驗和wilcoxon檢驗確定，其在統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)目的患者中應(yīng)當(dāng)減輕目標(biāo)疾病癥狀。“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特征(例如電荷、側(cè)鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸置換蛋白中的氨基酸，使得可頻繁進(jìn)行改變而不改變蛋白的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，一般而言，多肽的非必需區(qū)域中的單個氨基酸置換基本上不改變生物學(xué)活性(參見例如watson等(1987)molecularbiologyofthegene,thebenjamin/cummingspub.co.,第224頁，(第4版))。另外，結(jié)構(gòu)或功能類似的氨基酸的置換不大可能破環(huán)生物學(xué)活性?！坝行Я俊卑阋愿纳苹蝾A(yù)防醫(yī)學(xué)疾病的癥狀或病癥的量。有效量還意指足以允許或促進(jìn)診斷的量。用于特定患者或獸醫(yī)學(xué)受試者的有效量可依據(jù)以下因素而變化：例如，待治療的病癥、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴(yán)重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案?！巴庠葱浴敝父鶕?jù)情況在生物、細(xì)胞或人體外產(chǎn)生的物質(zhì)?！皟?nèi)源性”指根據(jù)情況在細(xì)胞、生物或人體內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)。“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當(dāng)兩個比較序列中的位置均被相同堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時，例如如果兩個dna分子的每一個位置都被腺嘌呤占據(jù)時，那么所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數(shù)除以比較的位置數(shù)×100的函數(shù)。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那么兩個序列為60％同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那么兩個序列為95％同源。一般而言，當(dāng)比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進(jìn)行比較。本文使用的表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有這類名稱都包括后代。因此，單詞“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)目。還應(yīng)當(dāng)理解的是，由于故意或非有意的突變，所有后代在dna含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同的功能或生物學(xué)活性的突變后代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。本文使用的“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“pcr”是指其中微量的特定部分的核酸、rna和/或dna如在例如美國專利號4,683,195中所述擴(kuò)增的程序或技術(shù)。一般來說，需要獲得來自目標(biāo)區(qū)域末端或之外的序列信息，使得可以設(shè)計寡核苷酸引物；這些引物在序列方面與待擴(kuò)增模板的對應(yīng)鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴(kuò)增材料的末端一致。pcr可用于擴(kuò)增特定的rna序列、來自總基因組dna的特定dna序列和由總細(xì)胞rna轉(zhuǎn)錄的cdna、噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般參見mullis等(1987)coldspringharborsymp.ouant.biol.51:263；erlich編輯，(1989)pcrtechnology(stocktonpress,n.y.)。本文使用的pcr被視為用于擴(kuò)增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)法的一個實例，但不是唯一的實例，所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴(kuò)增或產(chǎn)生核酸的特定部分?！叭芜x”或“任選地”意味著隨后所描述地事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說明包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生的場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區(qū)”意味著特定序列的抗體重鏈可變區(qū)可以但不必須存在?！八幬锝M合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學(xué)上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，所述其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。二.實施例與測試?yán)韵陆Y(jié)合實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實施例并非限制著本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如冷泉港的抗體技術(shù)實驗手冊，分子克隆手冊；或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規(guī)試劑。實施例1.凝血酶抗原及檢測用蛋白的制備1、相關(guān)凝血酶及凝血酶原序列編碼人凝血酶原(h-prothrombin)序列、小鼠凝血酶原(m-prothrombin)序列和食蟹獼猴凝血酶原(cyno-prothrombin)序列由cro公司上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成(以上凝血酶原蛋白均由本發(fā)明設(shè)計模版序列)，經(jīng)過一步pcr在3’端帶上his或flag編碼序列后，帶his標(biāo)簽的人凝血酶原(h-prothrombin-his)，帶flag標(biāo)簽的人凝血酶原(h-prothrombin-flag)，帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶原(m-prothrombin-his)和帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶原(cyno-prothrombin-his)分別克隆到ptt5載體上(biovector，cat#:102762)，在hek293e細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)瞬時表達(dá)。重組表達(dá)得到的凝血酶原(prothrombin)通過初步純化和體外激活得到凝血酶(thrombin),并經(jīng)過進(jìn)一步純化，得到的帶flag標(biāo)簽的人凝血酶(h-thrombin-flag)用于免疫，帶his標(biāo)簽的人凝血酶(h-thrombin-his),帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶(m-thrombin-his)和帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶(cyno-thrombin-his)用于在體外篩選的抗體測試。seqidno:1帶flag標(biāo)簽的人凝血酶原mahvrglqlpgclalaalcslvhsqhvflapqqarsllqrvrrantfleevrkgnlerecveetcsyeeafealesstatdvfwakytacetartprdklaaclegncaeglgtnyrghvnitrsgiecqlwrsryphkpeinstthpgadlqenfcrnpdssttgpwcyttdptvrrqecsipvcgqdqvtvamtprsegssvnlsppleqcvpdrgqqyqgrlavtthglpclawasaqakalskhqdfnsavqlvenfcrnpdgdeegvwcyvagkpgdfgycdlnyceeaveeetgdgldedsdraiegrtatseyqtffnprseqidno:2帶his標(biāo)簽的人凝血酶原mahvrglqlpgclalaalcslvhsqhvflapqqarsllqrvrrantfleevrkgnlerecveetcsyeeafealesstatdvfwakytacetartprdklaaclegncaeglgtnyrghvnitrsgiecqlwrsryphkpeinstthpgadlqenfcrnpdssttgpwcyttdptvrrqecsipvcgqdqvtvamtprsegssvnlsppleqcvpdrgqqyqgrlavtthglpclawasaqakalskhqdfnsavqlvenfcrnpdgdeegvwcyvagkpgdfgycdlnyceeaveeetgdgldedsdraiegrtatseyqtffnprseqidno:3帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶原mahvrglqlpgclalaalcslvhsqhvflapqqalsllqrvrrassgfleevfkgnlerecveetcsyeeafealesstatdafwakytacetartsrdtlaaclegncaedlgtnyrghvnitrsgiecqlwrsryphkpeinstthpgadlqenfcrnpdssttgpwcyttdptvrreecsipvcgqdqvtvvmtprssvnlslpseecvpdrgrqyqghlavtthglpclawasaqakalskhqdfdsavqlvenfcrnpdgdeegvwcyvagkpgdfeycdlnyceeavdeetgdglgedpdraiegrtatseyqtffdprseqidno:4帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶原mshvrglglpgclalaalvslvhsqhvflapqqalsllqrvrransgfleelrkgnlerecveeqcsyeeafealespqdtdvfwakytvcdsvrkpretfmdclegrcamdlgvnylgtvnvthtgiqcqlwrsryphkpeinstthpgadlkenfcrnpdssttgpwcyttdptvrreecsvpvcgqegrttvvmtprsggskdnlspplgqcltergrlyqgnlavttlgspclpwnslpaktlskyqdfdpevklvenfcrnpdwdeegawcyvagqpgdfeycnlnyceeavgeenydvdesiagrttdaefhtffnek注：序列中下劃線部分為帶相應(yīng)標(biāo)簽的凝血酶序列。2、凝血酶原相關(guān)重組蛋白的純化、體外激活，凝血酶相關(guān)重組蛋白以及重組抗體的純化1).帶his標(biāo)簽的人凝血酶原、帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶原和帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶原的純化步驟：將細(xì)胞表達(dá)上清樣品高速離心去除雜質(zhì)。用pbs緩沖液(ph7.4)平衡鎳柱，沖洗2-5倍柱體積，將上清樣品以一定流速上nisepharoseexcel柱。用pbs緩沖液沖洗柱子，至a280讀數(shù)降至基線，再用pbs+10mm咪唑沖洗層析柱，除去非特異結(jié)合的雜蛋白，并收集流出液，最后用含有300mm咪唑的pbs溶液洗脫目的蛋白，并收集洗脫峰。收集的洗脫液濃縮后用脫鹽柱將樣品緩沖液換成pbs溶液，以備后續(xù)體外激活和進(jìn)一步純化。2).帶flag標(biāo)簽的人凝血酶原重組蛋白的純化步驟：將樣品高速離心去除雜質(zhì)，并濃縮至適當(dāng)體積。利用0.5×pbs(ph7.4)平衡flag親和柱，沖洗2-5倍柱體積。將除雜后的細(xì)胞表達(dá)上清樣品上柱。用0.5×pbs沖洗柱子，至a280讀數(shù)降至基線。用pbs沖洗柱子，沖洗雜蛋白，并收集。用含有100μg/ml3×flag多肽的tbs緩沖液洗脫目的蛋白，并收集，以備后續(xù)體外激活和進(jìn)一步純化。3).凝血酶原相關(guān)重組蛋白的體外激活以及激活后凝血酶相關(guān)蛋白的進(jìn)一步純化：經(jīng)過上述初步親和層析(鎳柱或flag親和柱)得到的凝血酶原，以質(zhì)量比100：1與ecarin酶混合均勻后于室溫孵育過夜。激活后的樣品高速離心去除沉淀后，用離子交換柱和分子排阻色譜法sec做進(jìn)一步純化。3.1)離子交換帶his標(biāo)簽的人凝血酶、帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶、帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶用陽離子交換柱sphp柱來純化，帶flag標(biāo)簽的人凝血酶用陰離子交換柱qhp柱進(jìn)一步純化。陽離子交換選用緩沖液a為10mmpb,ph6.8緩沖液，緩沖液b為10mmpb,ph6.8，1mnacl緩沖液，陰離子交換選用緩沖液a為10mmtris-hcl,ph8.5緩沖液，緩沖液b為10mmtris-hcl,ph8.5，1mnacl緩沖液。離子交換柱預(yù)先用5個柱體積的緩沖液a緩沖液平衡，將換至緩沖液a緩沖液的激活后凝血酶樣品以一定流速上樣，上樣結(jié)束后再以緩沖液a緩沖液平衡柱子至a280吸收值到基線。用緩沖液b緩沖液在20個柱體積時間內(nèi)從0％上升到80％的濃度梯度洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)過sds-page鑒定目的蛋白所在組分，并進(jìn)一步通過質(zhì)譜和肽圖驗證。3.2)分子排阻色譜sec柱(superdex75)預(yù)先用pbs(ph7.4)平衡，樣品上樣后用pbs作為流動相洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)過sds-page鑒定目的蛋白所在組分，并進(jìn)一步通過質(zhì)譜和肽圖驗證。4).重組抗體的純化將細(xì)胞表達(dá)上清樣品高速離心去除雜質(zhì)，雜交瘤表達(dá)上清用蛋白g柱，重組抗體表達(dá)上清用蛋白a柱進(jìn)行純化。用pbs(ph7.4)沖洗柱子，至a280讀數(shù)降至基線。用100mm乙酸ph3.0洗脫目的蛋白，用1mtris-hcl,ph8.0中和。洗脫樣品適當(dāng)濃縮后，利用pbs平衡好的凝膠層析superdex200(ge)進(jìn)一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。實施例2.抗人凝血酶單克隆抗體的制備1.免疫抗人凝血酶抗體通過免疫兔子產(chǎn)生。實驗用新西蘭大白兔，雌性，2-3kg。(上海甲干生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：scxk(滬)2010-0028)。飼養(yǎng)環(huán)境：spf級。兔子購進(jìn)后，實驗室環(huán)境飼養(yǎng)1周，12/12小時光/暗周期調(diào)節(jié)，溫度20-25℃；濕度40-60％。將已適應(yīng)環(huán)境的兔子進(jìn)行免疫。免疫抗原為帶flag標(biāo)簽的人凝血酶(seqidno:1雙下劃線所示)。免疫方案：抗原用弗氏佐劑(sigmacatno.f5881/f5506)乳化：首免用弗氏完全佐劑(cfa)，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑(ifa)。抗原與佐劑比例為1:1500μg/只(首免)，250μg/只(加強(qiáng)免疫)。第0天皮下多點注射500μg/只的乳化后抗原，首免后每兩周一次加強(qiáng)免疫，共6-8周。于第22，36，50，64天取血，用elisa方法確定兔血清中的抗體滴度。在4免以后，選擇血清中抗體滴度高并且滴度趨于平臺的兔子，取脾及骨髓細(xì)胞進(jìn)行rna提取建庫。2.兔源噬菌體單鏈抗體庫構(gòu)建取兔子脾和骨髓，用trizol(invitrogencatno.15596-018)提取組織總rna。使用primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit試劑盒(takaracatno.6210a)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。根據(jù)christophrader等人的報道(j.biol.chem.2000,275:13668-13676)設(shè)計并合成構(gòu)建文庫的引物(金唯智)。通過三輪pcr反應(yīng)，獲得單鏈抗原結(jié)合片段。pcr反應(yīng)均使用latag(takaracatno.rr02mb)。第一輪pcr以cdna為模板，分別擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列；第二輪pcr以第一輪產(chǎn)物為模板，在重鏈可變區(qū)5’端和輕鏈可變區(qū)3’端引入sfi1酶切位點序列，在重鏈可變區(qū)3’端和輕鏈可變區(qū)5’端引入連接序列；第三輪pcr以第二輪pcr產(chǎn)物的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)共同為模板，進(jìn)行搭橋pcr，獲得重鏈可變區(qū)在前，輕鏈可變區(qū)在后的單鏈抗原結(jié)合片段。將單鏈抗原結(jié)合片段和經(jīng)過改造的建庫載體pcantab5e(amershambiosciences/gecatno.27-9400-01)用sfi1(nebcatno.#r0123l)進(jìn)行酶切，電泳后用gelextractionkit(omegacatno.d2500-02)進(jìn)行純化回收。然后用t4dna連接酶(nebcatno.#m0202l)16度連接16-18小時，再用上述試劑盒進(jìn)行純化回收，最后用去離子水洗脫。取1μg連接產(chǎn)物與1支電轉(zhuǎn)化感受態(tài)tg1(lucigencatno.60502-2)混合，電轉(zhuǎn)化儀(bioradmicropulser)參數(shù)設(shè)至2.5kv，200ω，25uf，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。重復(fù)轉(zhuǎn)化10次，涂平板，37℃倒置培養(yǎng)16-18小時。將所有菌落刮洗下來混和在一起，加入終濃度為15％的甘油，-80℃保存?zhèn)溆?。該庫的庫容超過1×108。3.篩選噬菌體單鏈抗體庫得到抗人凝血酶的陽性單克隆噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行包裝濃縮后，首先進(jìn)行三輪淘洗。將噬菌體庫(1012～1013/pfu)懸浮于1ml2％mpbs(含有2％脫脂奶粉的pbs)中，并加入100μlm-280streptavidin(invitrogencatno.11206d)，置于轉(zhuǎn)臺上反復(fù)翻轉(zhuǎn)，室溫封閉1小時。將管子置于磁力架上2分鐘，去除dynabeads，噬菌體庫轉(zhuǎn)移至新的管子中。向封閉后的噬菌體庫中加入2μg/ml生物素標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的人凝血酶(seqidno:2雙下劃線所示)，置于轉(zhuǎn)臺上反復(fù)翻轉(zhuǎn)1小時。同時取100μldynabeads懸浮于1ml2％mpbs中，置于轉(zhuǎn)臺上反復(fù)翻轉(zhuǎn)，室溫封閉1小時。將管子置于磁力架上2分鐘，吸去封閉液。將封閉后的dynabeads加入到噬菌體庫和帶his標(biāo)簽的凝血酶混合液中，置于轉(zhuǎn)臺上反復(fù)翻轉(zhuǎn)15分鐘。將管子置于磁力架上2分鐘，吸去混合液。用1mlpbst(含0.1％tween-20的pbs)洗dynabeads10次，再加入0.5ml1mg/ml胰蛋白酶(sigmacatno.t1426-250mg)，置于轉(zhuǎn)臺上反復(fù)翻轉(zhuǎn)孵育15分鐘，進(jìn)行洗脫。洗脫下來的噬菌體直接感染對數(shù)期的大腸桿菌tg1，測定滴度并進(jìn)行擴(kuò)增濃縮，用于下一輪淘洗。第二輪淘洗噬菌體庫(1011～1012/pfu)，生物素標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的人凝血酶濃度降為0.5μg/ml，結(jié)合時間縮短為30分鐘，pbst洗滌次數(shù)增加至15次。第三輪淘洗噬菌體庫(1010～1011/pfu)，生物素標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的人凝血酶濃度降為0.1μg/ml，結(jié)合時間縮短為30分鐘，pbst洗滌次數(shù)增加至20次。三輪淘洗完成后，將洗脫下來的噬菌體感染大腸桿菌tg1涂平板，隨機(jī)挑取單克隆，用于噬菌體elisa。將克隆接種于96孔深孔板37℃度培養(yǎng)16～18小時。取少量接種至另一個96孔深孔板，至od600達(dá)到0.5左右，加入m13k07輔助噬菌體(nebcatno.n0315s)進(jìn)行包裝。4000g離心10分鐘去除菌體，吸取培養(yǎng)液進(jìn)行人凝血酶結(jié)合elisa(見測試?yán)?)。篩選得到陽性克隆mab-1512作為重點分子進(jìn)行后續(xù)的人源化。陽性克隆菌種及時凍存保種并送測序公司測序，測得陽性克隆mab-1512dna序列對應(yīng)的氨基酸序列如下：>mab-1512vhqsleesggrlitpggsltltctasgfslsnydmswvrqapgkglewigmietdgsifhaswvngrftisktattvdlkmtslttedtatyfcvrgsndydaygypyftlwgqgtlvtvssseqidno：5>mab-1512vlelvltqspsasatlgasakltctlssahetytidwyqqhqgeapqylmelksdgsynkgagvpdrfsgsssgadrylmipsvqaddeatyhcgadfsdgyvfgggtqltvtgseqidno：6注：順序為fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，序列中斜體為fr序列，下劃線為cdr序列。表1.各重鏈及輕鏈cdr區(qū)序列通過實施例4對陽性克隆mab-1512進(jìn)行分子克隆和表達(dá)純化，得到嵌合抗體ch-1512，針對人凝血酶、凝血酶原進(jìn)行結(jié)合活性鑒定(測試?yán)?和測試?yán)?)。同時，檢測嵌合抗體ch-1512與不同種屬的凝血酶的交叉結(jié)合活性(見測試?yán)?)，與不同種屬的凝血酶的親和力(見測試?yán)?)，以及對人凝血酶酶活性的影響(見測試?yán)?)。檢測結(jié)果如下表2和圖1所示。表2.嵌合抗體與不同種屬的凝血酶及凝血酶原的體外活性表2結(jié)果表明，ch-1512與不同種屬的凝血酶，包括人、鼠、猴凝血酶均有強(qiáng)的結(jié)合力，而與人凝血酶原的結(jié)合較弱。圖1結(jié)果表明，ch-1512與凝血酶結(jié)合后并不影響其對底物s2228的酶解活性。實施例3.兔抗人凝血酶單克隆抗體的人源化1.抗人凝血酶抗體ch-1512人源化構(gòu)架選擇通過比對imgt人類抗體重輕鏈可變區(qū)種系基因數(shù)據(jù)庫和moe軟件，分別挑選與嵌合抗體ch-1512同源性高的重輕鏈可變區(qū)種系基因作為模板，將此兔源抗體的cdr分別移植到相應(yīng)的人源模板中，形成次序為fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的可變區(qū)序列。其中氨基酸殘基由kabat編號系統(tǒng)確定并注釋。嵌合抗體ch-1512的人源化重鏈模板為ighv3-66*01和hjh4.1，人源化輕鏈模板為iglv4-60*01和hjk4.1，人源化可變區(qū)序列如下：>h1512-1vh(cdrgraft)evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvsnydmswvrqapgkglewvsmietdgsifhaswvngrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargsndydaygypyftlwgqgtlvtvssseqidno：13>h1512-1vl(cdrgraft)qpvltqsssasaslgssvkltctlssahetytidwhqqqpgkaprylmklksdgsynkgagvpdrfsgsssgadryltisnlqledeadyycgadfsdgyvfgggtkveikseqidno：14注：順序為fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，序列中斜體為fr序列，下劃線為cdr序列。2.回復(fù)突變的設(shè)計ch-1512的回復(fù)突變設(shè)計，見下表3：表3.ch-1512回復(fù)突變設(shè)計注：如p2l表示依照kabat編號系統(tǒng)，將2位p突變回l。grafted，移植的，代表兔抗體cdr植入人種系fr區(qū)序列。突變后的具體序列舉例如下：h1512_vl.1d：elvltqsssasaslgssvkltctlssahetytidwyqqqpgkaprylmelksdgsynkgagvpdrfsgsssgadryltisnlqledeatyhcgadfsdgyvfgggtkveikseqidno：15h1512_vh.1f：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftvsnydmswvrqapgkglewigmietdgsifhaswvngrftiskdnskntvylqmnslraedtavyfcvrgsndydaygypyftlwgqgtlvtvssseqidno：16h1512_vl.1e：qlvltqsssasaslgssvkltctlssahetytidwyqqqpgkaprylmelksdgsynkgagvpdrfsgsssgadryltisnlqledeatyhcgadfsdgyvfgggtkveikseqidno：17回復(fù)突變后的輕重鏈可變區(qū)進(jìn)行重新組合，獲得的抗體由實施例4的制備方法進(jìn)行克隆和表達(dá)純化，并通過測試?yán)?的elisa實驗檢測其與人凝血酶蛋白的結(jié)合活性。根據(jù)檢測結(jié)果(表5)最終選擇以下抗體(表4)進(jìn)行下一步的體內(nèi)體外活性檢測。表4.人源化抗體輕重鏈可變區(qū)序列抗體編號重鏈可變區(qū)輕鏈可變區(qū)h1512-1seqidno：13seqidno：14h1512-8seqidno：13seqidno：15h1512-12seqidno：16seqidno：17針對本發(fā)明抗體進(jìn)行結(jié)合人凝血酶、凝血酶原的活性鑒定(測試?yán)?和測試?yán)?)，同時，檢測本發(fā)明抗體與不同種屬的凝血酶的交叉結(jié)合活性(見測試?yán)?)，與不同種屬的凝血酶的親和力(見測試?yán)?)，以及對人凝血酶酶活性的影響(見測試?yán)?)。測試結(jié)果表明，人源化抗體h1512-12和ch-1512一樣，與不同種屬的凝血酶，包括人、鼠、猴凝血酶均有強(qiáng)的結(jié)合力。圖2結(jié)果表明，h1512-12和ch-1512一樣，與凝血酶結(jié)合后并不影響其對底物s2228的酶解活性。實施例4.重組以及人源化抗體的制備抗體選用人重鏈igg4/輕鏈kappa的恒定區(qū)與各可變區(qū)組合，在fc段做了s228p突變來增加igg4抗體的穩(wěn)定性，也可選用本領(lǐng)域其它已知的突變來增加其性能。重鏈恒定區(qū)：astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkseqidno：18輕鏈恒定區(qū)：rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno：191.重組抗體的分子克隆噬菌體展示篩選所獲得的候選抗體分子經(jīng)過測序后，得到可變區(qū)編碼基因序列。以測序所得序列設(shè)計引物首尾引物，以測序基因為模板，經(jīng)過pcr搭建各抗體vh/vk基因片段，再與表達(dá)載體phr(帶信號肽及higg4恒定區(qū)基因(ch1-fc/cl)片段)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組抗體全長表達(dá)質(zhì)粒vh-ch1-fc-phr/vk-cl-phr。2.人源化抗體的分子克隆人源設(shè)計之后的抗體序列，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后產(chǎn)生人密碼子偏好的編碼基因序列，設(shè)計引物pcr搭建各抗體vh/vk基因片段，再與表達(dá)載體phr(帶信號肽及恒定區(qū)基因(ch1-fc/cl)片段)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建人源化抗體全長表達(dá)質(zhì)粒vh-ch1-fc-phr/vk-cl-phr。3.重組以及人源化抗體的表達(dá)與純化分別表達(dá)抗體輕重鏈的質(zhì)粒以1:1.5的比例轉(zhuǎn)染hek293e細(xì)胞，6天后收集表達(dá)上清，高速離心去除雜質(zhì)，用蛋白a柱進(jìn)行純化。用pbs沖洗柱子，至a280讀數(shù)降至基線。用100mm乙酸ph3.0洗脫目的蛋白，用1mtris-hcl,ph8.0中和。洗脫樣品適當(dāng)濃縮后，利用pbs平衡好的凝膠層析superdex200(ge)進(jìn)一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。得到人源化抗體h1512-12。以下用生化測試方法驗證本發(fā)明抗體性能及有益效果。測試?yán)?.噬菌體展示單鏈抗體結(jié)合人凝血酶蛋白的elisa實驗用ph7.4的pbs(sigma，catno.p4417-100tab)緩沖液將鏈霉親和素(sigma，catno.s4762-5mg)稀釋至5μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標(biāo)板中，于37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體后，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，并用pbst緩沖液(ph7.4pbs含0.05％tweeen-20)洗板3次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)稀釋至0.125μg/ml的生物素標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的人凝血酶蛋白(內(nèi)部生產(chǎn)，seqidno:2雙下劃線所示)，置4℃16-18小時。棄去酶標(biāo)板中的反應(yīng)液，用pbst洗板5次后，加入100μl/孔用樣品稀釋液1:1稀釋的噬菌體培養(yǎng)液，放于37℃孵育箱孵育1小時。孵育結(jié)束后用pbst洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的mousehrp/anti-m13conjugated二抗(ge，catno.27-9421-01)，37℃孵育1小時。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl，catno.52-00-03)，于室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1mh2so4終止反應(yīng)，用novostar酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取吸收值。測試?yán)?.凝血酶抗體結(jié)合人凝血酶蛋白的elisa實驗抗凝血酶抗體的結(jié)合力通過抗體與人凝血酶的elisa實驗來檢測。用生物素標(biāo)記試劑盒(東仁化學(xué)，catno.lk03)標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的凝血酶通過與包被在酶標(biāo)板中的鏈霉親和素結(jié)合從而固定到96孔酶標(biāo)板中，抗體加入后信號的強(qiáng)弱被用于判斷抗體和凝血酶的結(jié)合活性，具體實驗方法如下。用ph7.4的pbs(sigma，catno.p4417-100tab)緩沖液將鏈霉親和素(sigma，catno.s4762-5mg)稀釋至5μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標(biāo)板中，于37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體后，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，并用pbst緩沖液(ph7.4pbs含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)稀釋至0.5μg/ml的生物素標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的人凝血酶蛋白(seqidno:2雙下劃線所示)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結(jié)束后，棄去酶標(biāo)板中的反應(yīng)液，用pbst洗板6次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度的本發(fā)明凝血酶待測抗體，放于37℃孵育箱孵育2小時。孵育結(jié)束后用pbst洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗人二抗(jacksonimmunoresearch，catno.109-035-003)，37℃孵育1小時。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl，catno.52-00-03)，于室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1mh2so4終止反應(yīng)，用novostar酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取吸收值，計算本發(fā)明凝血酶抗體對人凝血酶的結(jié)合ec50值，結(jié)果見表5。表5.人源化抗體和抗原的結(jié)合活性mab-1512人源化抗體ec50(nm)h1512-143.4h1512-819.31h1512-120.16結(jié)果顯示，本發(fā)明篩選得到的凝血酶人源化抗體與人凝血酶蛋白抗原有較高的結(jié)合活性。測試?yán)?.凝血酶抗體結(jié)合人凝血酶原蛋白的elisa實驗?zāi)冈敲附饣罨玫侥傅那绑w?？鼓冈贵w的結(jié)合力通過抗體與人凝血酶原的elisa實驗來檢測，具體實驗方法如下。用ph7.4的pbs(sigma，catno.p4417-100tab)緩沖液將帶his標(biāo)簽的人凝血酶原(seqidno:2)稀釋至10μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標(biāo)板中，4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體后，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后棄去封閉液，并用pbst緩沖液(ph7.4pbs含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)梯度稀釋的本發(fā)明凝血酶待測抗體，放于37℃孵育箱孵育1小時。孵育結(jié)束后用pbst洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗人二抗(jacksonimmunoresearch，catno.109-035-003)，37℃孵育1小時。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl，catno.52-00-03)，于室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1mh2so4終止反應(yīng)，用novostar酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對人pro凝血酶的結(jié)合ec50值。測試?yán)?.抗凝血酶抗體與不同種屬凝血酶的交叉結(jié)合實驗為檢測篩選到的凝血酶抗體對于不同種屬來源的凝血酶的體外結(jié)合能力，小鼠和食蟹獼猴凝血酶被用于進(jìn)行體外結(jié)合檢測。用ph7.4的pbs(sigma，catno.p4417-100tab)緩沖液將his-tagantibody(genscript，catno.a00174)稀釋至0.5μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標(biāo)板中，于37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體后，加入用pbs稀釋的5％脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，并用pbst緩沖液(ph7.4pbs含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液(ph7.4pbs含1％bsa)稀釋至0.5μg/ml的帶his標(biāo)簽的小鼠凝血酶蛋白(seqidno:3雙下劃線所示)或帶his標(biāo)簽的食蟹獼猴凝血酶蛋白(seqidno:4雙下劃線所示)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結(jié)束后，棄去酶標(biāo)板中的反應(yīng)液，用pbst洗板6次后，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度本發(fā)明凝血酶待測抗體，放于37℃孵育箱孵育2小時。孵育結(jié)束后用pbst洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗人二抗(jacksonimmunoresearch，catno.109-035-003)，37℃孵育1小時。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb顯色底物(kpl，catno.52-00-03)，于室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1mh2so4終止反應(yīng)，用novostar酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對小鼠和食蟹獼猴凝血酶的結(jié)合ec50值。結(jié)果見表6。表6.人源化抗體與不同種屬的凝血酶結(jié)合的體外活性表6結(jié)果表明，人源化抗體h1512-12和ch-1512一樣，與不同種屬的凝血酶，包括鼠、猴凝血酶均有強(qiáng)的結(jié)合力。測試?yán)?.biacore檢測凝血酶抗體親和力實驗按照人抗捕獲試劑盒(cat.#br-1008-39，ge)說明書中所述的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯(lián)于cm5生物傳感芯片(cat.#br-1000-12，ge)上，從而親和捕獲待測抗體，然后于芯片表面流經(jīng)凝血酶或凝血酶原(帶his標(biāo)簽的人凝血酶或凝血酶原)，利用biacore儀器實時檢測反應(yīng)信號從而獲得結(jié)合和解離曲線，通過擬合得到親和力數(shù)值，見下表y。在實驗中每個循環(huán)解離完成后，用人抗捕獲試劑盒里配置的再生溶液將生物芯片洗凈再生。結(jié)果見表7。表7.人源化抗體與人凝血酶和人凝血酶原的親和力底物h1512-12biacorekd(m)人凝血酶2.79e-9人凝血酶原2.64e-8結(jié)果表明，本發(fā)明人源化抗體h1512-12與人凝血酶有強(qiáng)親和力，而與人凝血酶原親和力較弱。測試?yán)?.凝血酶抗體對凝血酶酶活的影響本實驗通過測試凝血酶對其底物s2228的酶解活性，檢測本發(fā)明抗體對凝血酶酶活的影響。用ph7.4的pbs梯度稀釋帶his標(biāo)簽的人凝血酶至濃度為100nm，25μl/孔加入黑壁透明底96孔板中。用pbs把本發(fā)明凝血酶待測抗體梯度稀釋至濃度為2000nm-62.5nm(1:2梯度稀釋)，25μl/孔，也加入此板中。室溫孵育30-60分鐘后，用pbs稀釋s2228(用于檢測凝血酶活性的底物，序列：h-d-phe-pip-arg-pna.2hcl，吉爾生化(上海)有限公司合成)至濃度為4mm，50μl/孔，加入到上一步驟的板中。陰性對照為僅加入凝血酶，或僅加入s2228的對照孔。室溫孵育30分鐘后，用novostar酶標(biāo)儀在波長405nm處讀取吸收值。結(jié)果見圖2，其中凝血酶和s2228表示陰性對照孔測出的od值，0.625:1，1.25:1，2.5:1，5:1，10:1，20:1表示待測抗體與凝血酶的不同摩爾比時測出的od值。圖2結(jié)果表明，h1512-12與凝血酶結(jié)合后，并不影響其對底物s2228的酶解活性。測試?yán)?.正常人血漿aptt實驗本實驗通過將正常人血漿與igg或不同濃度的凝血酶抗體共孵育，測試本發(fā)明抗體對aptt(activatedpartialthromboplastintime，活化部分凝血活酶時間)值的影響。igg為陰性對照，即利用傳統(tǒng)的親和層析方法如proteina純化獲得的人免疫球蛋白；h1512-12為本發(fā)明不同濃度待測抗體。實驗結(jié)果如圖3所示，隨著抗體h1512-12濃度的增加，正常人血漿的aptt值也有所延長。h1512-12在最高濃度3200nm時，aptt值的增加也達(dá)到33.6秒的峰值(表8)。表8.不同濃度凝血酶抗體的對正常人血漿的aptt值的增加量測試?yán)?.氯化鐵誘導(dǎo)的靜脈血栓模型尾靜脈注射凝血酶抗體，來評價本發(fā)明的抗體對抑制血栓生成的作用。sd大鼠(購自上海西普爾·必凱實驗動物有限責(zé)任公司)在實驗室環(huán)境中適應(yīng)7天。腹腔注射20％烏拉坦麻醉后，尾靜脈注射給藥，給藥15分鐘后，將浸潤了10％fecl3的2×5毫米濾紙條貼附于暴露的靜脈管壁上，3分鐘后去掉濾紙，用適量生理鹽水沖洗氯化鐵貼附部位，27分鐘后截取腎靜脈以下髂腰靜脈以上長度10毫米的后腔靜脈血管，剝離管腔中的血栓，在萬分之一天平上稱重。記錄血栓重量。實驗結(jié)果如圖4和表9所示，尾靜脈注射h1512-12，在6mg/kg及12mg/kg的劑量下，能顯著的抑制血栓的生成。h1512-126mg/kg組與h1512-1212mg/kg組的平均血栓重量，分別降低至2.91毫克和0.18毫克，與同型抗體組(igg-6mg/kg)的平均血栓重量10.75毫克相比較，具有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著差異。表9.各組血栓的平均重量及標(biāo)準(zhǔn)誤差測試?yán)?.食蟹猴動靜脈吻合模型8只健康食蟹猴(雌雄各半，海南金港生物技術(shù)股份有限公司提供)在實驗室環(huán)境中適應(yīng)兩周，稱重，根據(jù)體重均衡分成2組，每組4只。用舒泰進(jìn)行麻醉，之后再追加戊巴比妥進(jìn)行深度麻醉。術(shù)前對不同組分別緩慢下肢靜脈推注本發(fā)明抗體藥物及對照藥物(藥物及劑量見表10)。以下步驟均在37℃恒溫手術(shù)臺上操作。在腹股溝下手術(shù)分離出股動靜脈，先做左側(cè)再做右側(cè)。手術(shù)動靜脈插管。插管固定好之后，放開動脈夾(放開左側(cè)動脈夾時間為給藥后15分鐘，右側(cè)的時間為給藥后25分鐘)并同時開始計時，血流持續(xù)15分鐘。用止血鉗或者血管夾夾住插管的兩端防止栓子脫落，取出硅膠管放入有生理鹽水的培養(yǎng)皿，然后用手術(shù)剪取出帶有血栓的促凝線，在擦手紙上兩端各吸水3秒，后精密電子稱稱重，并算出血栓的凈重。表10.食蟹猴動靜脈吻合模型及術(shù)后血栓重量實驗結(jié)果如圖5所示，在6mg/kg的劑量下，h1512-12能顯著的抑制獼猴血栓的生成，與陰性抗體組(igg-6mg/kg)的平均血栓重量相比較，具有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著差異。統(tǒng)計方法為one-wayanova及studentttest。與同型抗體組(igg-6mg/kg)組相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。實施例10：本發(fā)明凝血酶抗體的藥代動力學(xué)測試以食蟹猴為受試動物，用elisa方法(見測試?yán)?)檢測給藥后食蟹猴血清中的血藥濃度，用winnolin軟件和excel來計算受試藥物的t1/2及其主要參數(shù)。研究本發(fā)明的化合物在食蟹猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為，評價其藥動學(xué)特征。實驗用食蟹猴，普通級，雄性，3-5歲，3.5-4.5公斤，成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司自養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：普通區(qū)房間。實驗室環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)不小于3天，12/12小時光/暗周期調(diào)節(jié)，溫度16-26℃，相對濕度40-70％。對食蟹猴進(jìn)行分組，每組3只。實驗當(dāng)天，每只食蟹猴分別靜脈注射受試藥物，給藥劑量為3mg/kg，10mg/kg。靜脈注射體積為10ml/kg，給藥速度2-4ml/分鐘。給藥后采血時間點為0.25h,2h,4h,8h,1d,2d,3d,4d,7d,10d,14d,21d,28d,35d。每次約取血1ml，肝素鈉抗凝，冰盒暫存，2-8℃1800g離心10分鐘分裝，-70℃保存。用elisa方法檢測血清中的血藥濃度，用winnolin軟件和excel來計算受試藥物的t1/2及其主要參數(shù)，結(jié)果如下：本發(fā)明抗體的藥代動力學(xué)參數(shù)見下表11：表11凝血酶抗體食蟹猴體內(nèi)藥代動力學(xué)檢測結(jié)論：本發(fā)明抗體的藥代吸收良好，具有明顯的藥代吸收效果。序列表<110>江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司、上海恒瑞醫(yī)藥有限公司<120>凝血酶抗體、其抗原結(jié)合片段及醫(yī)藥用途<130>370019cg-360046<160>19<170>patentinversion3.3<210>1<211>630<212>prt<213>人工序列<220><223>帶flag標(biāo)簽的人凝血酶原序列<400>1metalahisvalargglyleuglnleuproglycysleualaleuala151015alaleucysserleuvalhisserglnhisvalpheleualaprogln202530glnalaargserleuleuglnargvalargargalaasnthrpheleu354045glugluvalarglysglyasnleugluargglucysvalglugluthr505560cyssertyrgluglualapheglualaleugluserserthralathr65707580aspvalphetrpalalystyrthralacysgluthralaargthrpro859095argasplysleualaalacysleugluglyasncysalagluglyleu100105110glythrasntyrargglyhisvalasnilethrargserglyileglu115120125cysglnleutrpargserargtyrprohislysprogluileasnser130135140thrthrhisproglyalaaspleuglngluasnphecysargasnpro145150155160aspserserthrthrglyprotrpcystyrthrthraspprothrval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