本發(fā)明涉及n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法。
背景技術(shù)：
生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，bas)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。生物素-親合素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實驗研究的各個領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。
生物素廣泛分布于動、植物組織中，常從含量較高的卵黃(α型)和肝組織(β型)，提取αβ兩型的生物活性基本相同，現(xiàn)已可人工合成。生物素在機(jī)體內(nèi)以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，故又稱為輔酶r或維生素h。分子量為244.31，分子中有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中i環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；ii環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)。
利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。主要有用于標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的生物素n-羥基丁二酰亞胺酯(bnhs)和生物素對硝基酚酯(pbnp)。然而上述兩種活化生物素的水溶性均較差，但是被標(biāo)記的蛋白質(zhì)等生物大分子通常以水作為最佳溶劑。為了增進(jìn)生物素標(biāo)記反應(yīng)的效率，可以將生物素修飾成水溶性較好的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯，sulfo-nhs。該活化生物素可以與被標(biāo)記物在水相中順利發(fā)生均相反應(yīng)，生成連接有生物素的生物大分子，應(yīng)用于各種檢測以及定位觀察等研究領(lǐng)域。
n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯的反應(yīng)活性較高，容易在制備和儲存的過程中變質(zhì)，至今沒有成熟的合成方法被報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明之目的是提供一種原料易得、工藝簡單、環(huán)境友好，并且適合大量生產(chǎn)的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法，能夠避免了產(chǎn)物在后處理過程中變質(zhì)分解，解決高活性水溶性活化生物素的制備困難問題。
由此，本發(fā)明提供一種n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法，該方法是使生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽發(fā)生反應(yīng)而得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物，化學(xué)反應(yīng)式如下：
在上述反應(yīng)式中，
該方法包括如下步驟：
步驟一：將生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽加入到第一溶劑中，在縮合劑的作用下發(fā)生縮合反應(yīng)；
步驟二：將步驟一反應(yīng)后得到的反應(yīng)液中的所述第一溶劑去除，剩余物用色譜進(jìn)行分離，并收集含有n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物的分離溶液；
步驟三：去除所述分離溶液中的第二溶劑，得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物。
作為優(yōu)選方式，所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、n,n'-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、氯化亞砜或草酰氯。
作為優(yōu)選方式，所述第一溶劑為二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作為優(yōu)選方式，步驟三中去除分離溶液中的第二溶劑的方式為凍干、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或其組合。
作為優(yōu)選方式，步驟二中所述色譜為高效液相色譜或中壓制備色譜。
作為優(yōu)選方式，所述第一溶劑可以與所述第二溶劑相同或不同。
本發(fā)明還提供一種n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法，該方法是使生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽發(fā)生反應(yīng)而得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物，化學(xué)反應(yīng)式如下：
在上述反應(yīng)式中，
該方法包括如下步驟：
步驟一：將生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽加入到第一溶劑中，在縮合劑的作用下發(fā)生縮合反應(yīng)；
步驟二：將步驟一反應(yīng)后得到的反應(yīng)液中加入第三溶劑，攪拌后所述反應(yīng)液變渾濁；
步驟三：在所述反應(yīng)液分層后，去除上清液，得到位于下層的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物。
作為優(yōu)選方式，所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、n,n'-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、氯化亞砜或草酰氯。
作為優(yōu)選方式，所述第一溶劑為二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作為優(yōu)選方式，所述第三溶劑為乙醇、甲醇、四氫呋喃、乙醚、乙腈中的一種或多種。
本發(fā)明的特點是適合放大生產(chǎn)，原料易得，制備工藝簡單，對環(huán)境友好，避免了產(chǎn)物在后處理過程中變質(zhì)分解的技術(shù)問題。
具體實施方式
在此記載的實施例為本發(fā)明的特定的具體實施方式，用于說明本發(fā)明的構(gòu)思，均是解釋性和示例性的，不應(yīng)解釋為對本發(fā)明實施方式及本發(fā)明范圍的限制。除在此記載的實施例外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠基于本申請權(quán)利要求書和說明書所公開的內(nèi)容采用顯而易見的其它技術(shù)方案，這些技術(shù)方案包括對在此記載的實施例做出任何顯而易見的替換和修改的技術(shù)方案。
本發(fā)明的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法是使生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽發(fā)生反應(yīng)而得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物，化學(xué)反應(yīng)式如下：
在上述反應(yīng)式中，
作為第一實施例，本發(fā)明的方法可以包括如下步驟：
步驟一：將生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽加入到第一溶劑中，在縮合劑的作用下發(fā)生縮合反應(yīng)；
步驟二：將步驟一反應(yīng)后得到的反應(yīng)液中的所述第一溶劑去除，剩余物用色譜進(jìn)行分離，并收集含有n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物的分離溶液；
步驟三：去除所述分離溶液中的第二溶劑，得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物。
需要說明的是，所述縮合劑可以為二環(huán)己基碳二亞胺、n,n'-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、氯化亞砜或草酰氯。
所述第一溶劑可以為二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作為本實施例的進(jìn)一步實施方式，步驟三中去除分離溶液中的第二溶劑的方式可以為凍干、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或其組合。
作為本實施例的進(jìn)一步實施方式，步驟二中所述色譜可以為高效液相色譜或中壓制備色譜。
請注意，在本發(fā)明中，所述第一溶劑與所述第二溶劑可以是同一種溶劑，也可以不同的溶劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)生產(chǎn)的實際需要來確定。
作為第二實施例，本發(fā)明的方法可以包括如下步驟：
步驟一：將生物素與n-羥基琥珀酰亞胺磺酸或n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鹽加入到第一溶劑中，在縮合劑的作用下發(fā)生縮合反應(yīng)；
步驟二：將步驟一反應(yīng)后得到的反應(yīng)液中加入第三溶劑，攪拌后所述反應(yīng)液變渾濁；
步驟三：在所述反應(yīng)液分層后，去除上清液，得到位于下層的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯或其衍生物。
與第一實施例一樣，在第二實施例中所述縮合劑也可以為二環(huán)己基碳二亞胺、n,n'-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、氯化亞砜或草酰氯。
所述第一溶劑也可以為二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺。
作為本實施例的進(jìn)一步實施方式，所述第三溶劑可以為乙醇、甲醇、四氫呋喃、乙醚中的一種或多種。
為了更清楚地理解本發(fā)明，下面還相應(yīng)于上述第一和第二實施例說明具有更具體限定的示例一和示例二，當(dāng)然這些具體示例是用于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。
在下面的示例一和示例二中，所制備的產(chǎn)品是n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽，其屬于n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯的衍生物。
示例一
n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽的制備，化學(xué)反應(yīng)式為：
步驟一：冰水浴的條件下，將生物素(244.3mg，1mmol)、dcc(412mg，2.0mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(217.1mg，1.0mmol)加入到dmf(20ml)中，在冰水浴中攪拌1小時；然后，升溫到室溫，在室溫下攪拌24小時。
步驟二：用蒸發(fā)儀將步驟一反應(yīng)液中dmf去除，剩余物通過制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，其中，洗脫劑為乙腈和水的混合體系，分離后得到含有產(chǎn)物n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽的乙腈、水混合溶液。
步驟三：將步驟二得到的混合溶液通過減壓旋蒸去除乙腈，再通過凍干去除水分，最終得到產(chǎn)物n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽的固體粉末210mg，收率47％，ms:443。
示例二
n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽的制備，化學(xué)反應(yīng)式為：
步驟一：冰水浴的條件下，將生物素(244.3mg，1mmol)、edc(383mg，2.0mmol)和n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉(217.1mg，1.0mmol)加入到dmso(20ml)中，在冰水浴中攪拌1小時；然后，升溫到室溫，在室溫下攪拌24小時。
步驟二：向步驟一反應(yīng)液中加入四氫呋喃，攪拌后反應(yīng)液變渾濁。
步驟三：將步驟二中的渾濁反應(yīng)液通過離心分離，去除上清液；再向下層粘稠物中加入四氫呋喃，攪拌離心，去除上清液；所得到的粗產(chǎn)物通過中壓制備色譜分離，所得到的產(chǎn)品溶液通過減壓旋蒸和凍干得到n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯鈉鹽固體粉末181mg，收率40％，ms:443。
以上對本發(fā)明的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法的實施方式進(jìn)行了說明。對于本發(fā)明的n-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素酯及其衍生物的制備方法的具體特征可以根據(jù)上述披露的特征的作用進(jìn)行具體改進(jìn)，這些改進(jìn)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。而且，上述披露的各技術(shù)特征并不限于已披露的與其它特征的組合，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可根據(jù)本發(fā)明之目的進(jìn)行各技術(shù)特征之間的其它組合，以實現(xiàn)本發(fā)明之目的為準(zhǔn)。