本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種靶向高分子藥物載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

兩親性高分子，尤其是生物相容的兩親性高分子(也就是含有親水性和疏水性兩種鏈段的高分子)被廣泛研究，因?yàn)樗鼈兛梢栽谒型ㄟ^疏水鏈段間的疏水作用等自聚集形成具有各種不同形態(tài)的納米粒子，這種性質(zhì)使得兩親性高分子在藥物釋放體系有很大的應(yīng)用前景，如可控釋放體系、靶向釋放體系等。我們知道，目前大部分藥物(如抗癌藥物)是疏水性的，也就是不溶于水，很容易被人體內(nèi)的一系列排斥反應(yīng)排出體外，如藥物抵制作用、酶降解作用等等，這大大限制了癌癥等疾病治療的有效性。而兩親性高分子形成的納米粒子可以作為藥物載體，把藥物包埋在疏水核內(nèi)，表面由納米粒子的親水層保護(hù)，這樣藥物便可被輸送到病變部位(如腫瘤等)，從而起到有效治療癌癥的作用。

對高分子納米粒子的表面進(jìn)行靶向性基團(tuán)的修飾，可以提高藥物輸送的選擇性和疾病治療的有效性。因?yàn)榘邢蛐图{米粒子將包埋的藥物定向輸送到腫瘤等病變部位，這樣既可以減少藥物對正常細(xì)胞的損害，又可因提高藥物利用率而減少藥物的用量，從而減輕藥物對人體產(chǎn)生的副作用。因此，靶向型高分子納米粒子在藥物釋放體系有很大的應(yīng)用前景。

葉酸是細(xì)胞(尤其是增生細(xì)胞)所必需的維生素，參與多種代謝途徑的一碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)。葉酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通過兩種跨膜蛋白，即低親和力的還原性葉酸載體和高親和力的葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)來完成。目前已證實(shí)FR在多種腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，而在多數(shù)正常組織中的表達(dá)僅限于一些難于進(jìn)入血液循環(huán)的上皮細(xì)胞頂膜。正因?yàn)镕R表達(dá)的特性，F(xiàn)R天然配體—葉酸(folic acid,FA)成為將藥物靶向到腫瘤細(xì)胞的重要分子，葉酸具有與葉酸受體的高親和力(K_d＝l×10^-10mol·L^-1)、低免疫原性、易于修飾、體積小(M_w＝441.4)、高度化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性，高的腫瘤滲透性、易與藥物結(jié)合，與有機(jī)和水性溶劑的相容性以及低成本等優(yōu)點(diǎn)，使葉酸介導(dǎo)腫瘤靶向的研究得到迅速發(fā)展。

近年來，國內(nèi)外對葉酸靶向的高分子藥物釋放體系已有較廣泛地研究。Park等合成的葉酸修飾后的包埋紫杉醇的葉酸-聚己內(nèi)酯-聚乙二醇(FA-PCL-PEO)納米粒子比PCL-PEO納米粒子對癌細(xì)胞有更高的細(xì)胞毒性(Park,E.K.；et al.Journal of Controlled Release 2005,109,158)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是提供一種新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的聚合物，具有藥物靶向載體作用。

本發(fā)明的含葉酸靶向高分子藥物載體，含有葉酸靶向基團(tuán)的、由聚氧乙烯-氧丙烯-氧乙烯(PEO₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀,Pluronic F127)作為親水鏈段、聚己內(nèi)酯[polycaprolactone,PCL]作為疏水鏈段的兩親性嵌段共聚物葉酸-聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯-聚己內(nèi)酯(FA-F127-PCL)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

其中n代表己內(nèi)酯的重復(fù)單元的數(shù)目。

本發(fā)明

其合成路線如圖1，具體制備方法是：

(1)取0.71g(1.61mmol)的FA與0.36g(1.76mmol)的1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)混合加入攪拌中的70ml的無水DMSO，在室溫下攪拌48小時(shí)。再將干燥后的20g的F127與0.20mg(1.60mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入其中，再在25℃室溫下攪拌48小時(shí)，之后在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液在普通DMSO環(huán)境下用3500截留分子量的透析袋透析3小時(shí)，之后再用二蒸水透析24小時(shí)。旋干后用CH₂Cl₂溶解后沉入凍乙醚之中純化兩次，取沉淀烘干后制得FA-F127-OH；

(2)用FA-F127-OH做大分子引發(fā)劑和辛酸亞錫為催化劑，在無水、無氧的條件下，引發(fā)環(huán)狀單體己內(nèi)酯(caprolactone,CL)進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，最終得到所需的共聚物。具體合成方法為：反應(yīng)瓶通過抽真空-通氬氣除氧除濕后，在氬氣條件下加入FA-F127-OH、己內(nèi)酯和辛酸亞錫，己內(nèi)酯的量為FA-F127-OH重量的40–50％，辛酸亞錫的量為己內(nèi)酯重量的0.1-0.15％，將反應(yīng)物加熱至140-160℃，攪拌下，反應(yīng)持續(xù)15-17小時(shí)；將反應(yīng)物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物質(zhì)沉出，過濾；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，過濾，干燥，得到FA-F127-PCL共聚物。

本發(fā)明還涉及FA-F127-PCL共聚物在包埋抗癌藥物紫杉醇中的應(yīng)用。

包埋紫杉醇的方法是：

1、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL納米粒子的制備

稱取15mg FA-F127-PCL聚合物和5mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞試管中，加3ml四氫呋喃(THF)進(jìn)行溶解。再將該THF溶液分散于15g超純水中，倒入透析袋中透析24h，以除去未包封的紫杉醇。

2、紫杉醇包埋率和載藥量的測定

取0.3ml步驟1中的納米粒子水溶液凍干，然后加入0.7ml乙腈-水(7︰3v/v)混合溶液溶解，接著用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測試，測試條件如下：C18柱，以1.0ml·min^-1流速的乙腈-水(7:3v/v)為流動相，在227nm處檢測峰面積，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的主峰面積相比較，計(jì)算樣品中的紫杉醇濃度。

包埋率的計(jì)算公式如下：

3、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL納米粒子的釋放

取10ml透析液，放置在對應(yīng)的透析袋中；將透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的廣口瓶中。廣口瓶放在恒溫震蕩儀中，保持瓶中溶液在37.5℃震蕩。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，從廣口瓶中取5mL釋放外液，再補(bǔ)充5ml的PBS的緩沖液，保持總量為100mL。釋放液中紫杉醇的含量用HPLC法測定，測試條件同上。

本發(fā)明涉及的FA-F127-PCL兩親性嵌段共聚物是一個(gè)具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的聚合物。并且與現(xiàn)有的FA-F127-PLA共聚物相比，具有更好的藥物緩釋效果。

附圖說明

圖1本發(fā)明聚合物FA-F127-PCL的合成路線。

圖2本發(fā)明聚合物FA-F127-PCL的紫外吸收圖。

圖3包埋紫杉醇的FA-F127-PCL納米粒子的體外釋放圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本發(fā)明的FA-F127-PCL共聚物的制備方法如下：

(1)取0.71g(1.61mmol)的FA與0.36g(1.76mmol)的1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)混合加入攪拌中的70ml的無水DMSO，在室溫下攪拌48小時(shí)。再將干燥后的20g的F127與0.20mg(1.60mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入其中，再在25℃室溫下攪拌48小時(shí)，之后在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液在普通DMSO環(huán)境下用3500截留分子量的透析袋透析3小時(shí)，之后再用二蒸水透析24小時(shí)。旋干后用CH₂Cl₂溶解后沉入凍乙醚之中純化兩次，取沉淀烘干后制得FA-F127-OH；所得共聚物稱重為18.0g,產(chǎn)率為81.7％。

(2)用FA-F127-OH做大分子引發(fā)劑和辛酸亞錫為催化劑，在無水、無氧的條件下，引發(fā)環(huán)狀單體己內(nèi)酯(caprolactone,CL)進(jìn)行開環(huán)聚合反應(yīng)，最終得到所需的共聚物。具體合成方法為：反應(yīng)瓶通過抽真空-通氬氣除氧除濕后，在氬氣條件下加入FA-F127-OH(5g)、己內(nèi)酯(2.25g)和辛酸亞錫2.5mg，將反應(yīng)物加熱至150℃，攪拌下，反應(yīng)持續(xù)16小時(shí)；將反應(yīng)物二氯甲烷溶解，然后沉入甲醇中，有白色物質(zhì)沉出，過濾；然后再用二氯甲烷溶解聚合物，并沉入甲醇中，過濾，干燥，得到FA-F127-PCL共聚物0.7g，產(chǎn)率為9.6％。。

結(jié)構(gòu)表征¹H NMR(400MHz,DMSO-d⁶,ppm):1.01-1.05(m,-OCH₂-CH(CH₃)-),1.25-1.35(m,-O-(CH₂)₂-CH₂-(CH₂)₂-CO-),1.4-1.7(m,-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CO-),2.25-2.35(m,-O-(CH₂)₄-CH₂-CO-),3.35-3.7(m,-OCH₂-CH₂-and-OCH₂-CH(CH₃)-),3.9-4.0(m,-O-CH₂-(CH₂)₄-CO-).4.21-4.24(t,-CO-OCH₂-CH₂-).

制備得到的FA-F127-PCL共聚物的分子量和PCL的鏈段含量由FA-F127-PCL的核磁譜圖計(jì)算得到，結(jié)果為FA-F127-PCL的分子量(Mn)為19440，PCL鏈段的含量為35.2wt％，也即相應(yīng)聚合物的結(jié)構(gòu)式為FA-PEO₁₀₀-PPO₆₅-PEO₁₀₀-PCL₃₀。FA-F127-PCL共聚物中FA的含量由紫外分光光度計(jì)測試得到。由288nm處FA的紫外吸收峰可知(見圖2)，F(xiàn)A已成功連接到F127-PCL共聚物的端基上。

實(shí)施例2本發(fā)明FA-F127-PCL共聚物包埋紫杉醇

1、包埋紫杉醇的FA-F127-PCL納米粒子的制備

稱取15mg FA-F127-PCL聚合物和5mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞試管中，加3ml四氫呋喃(THF)進(jìn)行溶解。再將該THF溶液分散于15g超純水中，倒入透析袋中透析24h，以除去未包封的紫杉醇。

2、紫杉醇包埋率和載藥量的測定

取0.3ml步驟1中的納米粒子水溶液凍干，然后加入0.7ml乙腈-水(7︰3v/v)混合溶液溶解，接著用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行測試，測試條件如下：C18柱，以1.0ml·min^-1流速的乙腈-水(7:3v/v)為流動相，在227nm處檢測峰面積，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的主峰面積相比較，計(jì)算樣品中的紫杉醇濃度。

包埋率的計(jì)算公式如下：

由計(jì)算結(jié)果可知，F(xiàn)A-F127-PCL共聚物的紫杉醇包埋率為45.4％。

實(shí)施例3

1.包埋紫杉醇的FA-F127-PCL納米粒子的體外釋放

取10ml透析液，放置在對應(yīng)的透析袋中；將透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的廣口瓶中。廣口瓶放在恒溫震蕩儀中，保持瓶中溶液在37.5℃震蕩。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，從廣口瓶中取5mL釋放外液，再補(bǔ)充5ml的PBS的緩沖液，保持總量為100mL。釋放液中紫杉醇的含量用HPLC法測定，測試條件同上。由測試結(jié)果可知(見圖3)，紫杉醇包埋在納米粒子中后呈現(xiàn)較好的緩釋過程；在釋放141h后，只有約8％的紫杉醇釋放出來。

2.包埋紫杉醇的FA-F127-PLA納米粒子的體外釋放

稱取3mg FA-F127-PLA(Mn 27000,PLA 51.7wt％,FA 12.6mol％)聚合物和0.3mg紫杉醇(Paclitaxel，PTX)于具塞試管中，加3ml二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解。再將該DMSO溶液分散于10g超純水中，倒入透析袋中透析，以除去未包封的紫杉醇。

取10ml透析液，放置在對應(yīng)的透析袋中；將透析袋(分子截留量3.5kDa)放在含有100ml PBS溶液的廣口瓶中。廣口瓶放在恒溫震蕩儀中，保持瓶中溶液在37.5℃震蕩。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，從廣口瓶中取5mL釋放外液，再補(bǔ)充5ml的PBS的緩沖液，保持總量為100mL。釋放液中紫杉醇的含量用HPLC法測定，測試條件同上。由測試結(jié)果可知，紫杉醇包埋在FA-F127-PLA納米粒子中后緩釋效果不明顯，10小時(shí)后已經(jīng)有約65％的紫杉醇釋放出來，96小時(shí)后釋放量達(dá)到了約85％。

由結(jié)果比較可知，本發(fā)明FA-F127-PCL共聚物的紫杉醇釋放率遠(yuǎn)低于FA-F127-PLA共聚物，也就是說紫杉醇在FA-F127-PCL納米粒子中的緩釋作用大大增強(qiáng)。