本發(fā)明屬于高分子藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種溫度和氧化雙響應(yīng)的聚合物膠束及其制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤己經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的最嚴(yán)重疾病之一。臨床上常用的癌癥治療手段有化學(xué)治療、放射治療和手術(shù)治療等，其中，化學(xué)治療是最常用和重要的治療途徑。但臨床上所用的抗腫瘤藥物在應(yīng)用中有諸多的缺陷，如：水溶性劑穩(wěn)定性差、藥物毒副作用大，在治療疾病的同時(shí)也殺死了人體的正常細(xì)胞。而藥物傳遞系統(tǒng)和控制釋放恰恰能夠解決這些問(wèn)題。藥物控制釋放是指將藥物和適當(dāng)載體按照一定的比例和形式制成制劑，在進(jìn)入人體后控制藥物在人體內(nèi)部的作用部位、作用時(shí)間以及吸收和代謝的過(guò)程。和傳統(tǒng)的直接用藥方式相比較，藥物控制釋放的優(yōu)點(diǎn)有：(1)可實(shí)現(xiàn)藥物的主動(dòng)或被動(dòng)靶向傳遞，將藥物直接作用與病變部位，降低了藥物對(duì)正常人體細(xì)胞和組織的毒副作用；(2)可以對(duì)藥物在人體內(nèi)作用時(shí)間加以調(diào)節(jié)，適當(dāng)延長(zhǎng)藥物作用的時(shí)間，尤其對(duì)需要長(zhǎng)期用藥的病人，可以減少頻繁用藥的痛苦；(3)由于藥物載體的靶向作用，提高了藥物的利用率，尤其對(duì)于比較昂貴的藥物如抗腫瘤藥物，具有很重要的意義。

常用的藥物載體有無(wú)機(jī)材料納米粒子、聚合物膠束、樹(shù)枝狀聚合物、脂質(zhì)體以及聚合物納米水凝膠等，其中，能對(duì)腫瘤組織微環(huán)境做出響應(yīng)的環(huán)境敏感型的聚合物膠束具有良好的應(yīng)用前景。環(huán)境敏感型聚合物膠束能夠有效的將藥物帶到病灶部位，在腫瘤組織特殊環(huán)境的剌激下，迅速的釋放藥物，以減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用，更好地發(fā)揮藥效。

對(duì)于溫度敏感的聚合物體系，通過(guò)選擇具有最低臨界溶解溫度(lcst)或最高溶解溫度(ucst)的聚合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。典型的lcst和ucst值可在20～40℃之間調(diào)控。所謂lcst，是指低于臨界溫度時(shí)聚合物可以溶解在溶劑中，而高于臨界溫度時(shí)聚合物不溶解發(fā)生聚集。研究得最多的聚合物是聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipaam)，聚(n-異丙基丙烯酰胺)在水中的lcst是32℃，這個(gè)臨界溫度不受聚合物濃度和分子量的影響。上述載體膠束的臨界溫度略低于人體溫度，難以直接應(yīng)用，但通過(guò)在主鏈上復(fù)合較親水的單體，如二甲基丙烯酰胺(n,n'-dimethylacrylamide)^[1]，羥甲基丙烯酰胺(n-hydroxymethylaerylamide)^[2]，丙烯酰胺(acrylamide)^[3]，可進(jìn)一步提高lcst。卓仁禧等合成的n-異丙基丙烯酰胺和羥甲基丙烯酰胺共聚物可以把lcst提高到42℃^[4]。

相比單一響應(yīng)性的聚合物載體膠束，多重響應(yīng)性納米的載藥膠束一方面可能會(huì)有更好的藥物緩釋和控釋作用另一方面會(huì)提高載藥效率。為了更好的控制藥物釋放和提高抗癌活性，本專利將多重響應(yīng)整合于同一個(gè)藥物傳遞系統(tǒng)，制備更加復(fù)雜精密的多重環(huán)境響應(yīng)型聚合物載藥膠束用于抗腫瘤藥物遞送。值得注意的是，同時(shí)具有溫度和氧化響應(yīng)性的聚合物載藥膠束具有廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種lcst可調(diào)，并具有氧化響應(yīng)性的聚合物膠束載藥體系及其制備方法，該聚合物膠束載藥體系表現(xiàn)出了對(duì)低濃度氧化物敏感，最低臨界溶解溫度可調(diào)節(jié)，膠束穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

1.本發(fā)明提供了一種溫度和氧化雙響應(yīng)的共聚物，具有式(1)所示的結(jié)構(gòu)：

其中，所述-r1-r2,-r3優(yōu)選自如下結(jié)構(gòu)：

j，m，n為聚合度：m+n>20，5<j<60，

其中，優(yōu)選地，所述式(1)中的結(jié)構(gòu)中：70>m+n>50，10<j<20。

2.結(jié)構(gòu)式(1)的聚合物，其單體包括環(huán)硫丙烯，n-異丙基丙烯酰胺，n,n-二甲基丙烯酰胺。

3.一種溫度和氧化雙響應(yīng)的共聚物的制備方法，包括：

a.通過(guò)陰離子開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)，以環(huán)硫丙烯為單體制備得到聚環(huán)硫丙烯大分子引發(fā)劑；

b.以聚環(huán)硫丙烯為引發(fā)劑，n-異丙基丙烯酰胺，n,n-二甲基丙烯酰胺按一定比例加入，通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)得到所述的共聚物。

4.一種兩親性聚合物膠束的制備方法，通過(guò)以下步驟制備：

a.將兩親性聚合物溶于有機(jī)溶劑中；

b.將溶液緩慢勻速的滴入水中；

c.攪拌過(guò)夜然后透析除去有機(jī)溶劑。

5.一種兩親性聚合物膠束的制備方法，其中有機(jī)溶劑選自二甲基亞砜(dmso)，四氫呋喃(thf)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，二氯甲烷(dcm)，丙酮(at)，本發(fā)明中，優(yōu)選為四氫呋喃。

6.根據(jù)4中制備的膠束，優(yōu)選地，所述膠束的粒徑為30nm～300nm。

7.根據(jù)4中制備的膠束，優(yōu)選地，所述膠束的最低臨界溶解溫度(lcst)可調(diào)，范圍為30℃～45℃。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明原料來(lái)源廣泛，所用的環(huán)硫丙烯、2-溴-2-甲基丙酰溴、甲醇鈉甲醇溶液、n-異丙基丙烯酰胺、n,n-二甲基丙烯酰胺、溶劑、催化劑、配位劑、引發(fā)劑、溴化劑、均可工業(yè)化生產(chǎn)，合成方法簡(jiǎn)單易行。合成的雙響應(yīng)性共聚物具有l(wèi)cst的溫度響應(yīng)性、氧化響應(yīng)性、共聚物在水中可以很容易地組裝為穩(wěn)定納米膠束。所得穩(wěn)定納米膠束具有溫度響應(yīng)性、生物降解性和生物相容性，在藥物控制釋放領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明：

圖1共聚物gpc圖

圖2共聚物粒徑圖

圖3粒徑隨溫度變化圖

圖4不同溫度下的nmr圖

圖5動(dòng)態(tài)散射光強(qiáng)度變化圖

圖6共聚物氧化前后nmr圖

圖7載藥膠束藥效實(shí)驗(yàn)圖

實(shí)施例一：

共聚合物的制備

材料與方法：

環(huán)硫丙烯，購(gòu)自tci公司，2-溴-2-甲基丙酰溴，甲醇鈉甲醇溶液購(gòu)自百靈威公司，n-異丙基丙烯酰胺，n,n-二甲基丙烯酰胺購(gòu)自adamas公司，反應(yīng)中所用溶劑均重蒸除水干燥。

1.聚環(huán)硫丙烯大分子引發(fā)劑的合成，其步驟為：

采用陰離子開(kāi)環(huán)聚合的方法合成，制備聚環(huán)硫丙烯。將20ml干燥四氫呋喃導(dǎo)氮?dú)?h，然后加入tbp2ml，2-羥基乙酰硫酯162mg，甲醇鈉甲醇溶液2.8ml反應(yīng)幾分鐘，加入環(huán)硫丙烯1g，再反應(yīng)一段時(shí)間，加入溴乙酰胺0.6ml，常溫下反應(yīng)2h，旋干溶劑，用甲醇沉淀，離心去掉上清液，反復(fù)用甲醇沉淀3次，得到無(wú)色油狀物，將產(chǎn)物溶于20ml無(wú)水的二氯甲烷中，加入三個(gè)當(dāng)量的三乙胺，再在冰浴條件下加入過(guò)量的2-溴-2-甲基丙酰溴，在冰浴下反應(yīng)1h移到常溫下反應(yīng)24h，旋干溶劑，用甲醇反復(fù)沉淀，離心取下層油狀物，得到大分子引發(fā)劑。

2.共聚合物的制備，其步驟為：

將大分子引發(fā)劑50mg，約300mgnipaam，dmmam0.05ml溶于1.5mldmf/h2o混合溶液中，導(dǎo)氮?dú)獬舴磻?yīng)溶劑中的氧，將現(xiàn)制備好的0.2ml左右cucl/me6tren水溶液在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下注入反應(yīng)液中，在常溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液堿性氧化鋁柱過(guò)濾，旋干后用冰浴的乙醚沉淀。得到白色的固體粉末。

實(shí)施例二：

共聚物分子量的測(cè)定

共聚物分子量的測(cè)定采用凝膠色譜法測(cè)定(gpc)。色譜柱為styragel(hr5e,4.6x300mm,waters)，檢測(cè)器為微分折射計(jì)檢測(cè)儀(difierentialreactometerdetector,jasco,ri-930)，流動(dòng)相為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，流速1.0m/ml，柱溫為30℃，樣品為1mg/ml的嵌段共聚物的dmf溶液，進(jìn)樣量50μl。色譜柱用聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品。圖1為gpc結(jié)果圖。

實(shí)施例三：

雙響應(yīng)性共聚物膠束的制備

分別稱取10mg共聚物，加入適量丙酮溶解。在不斷攪拌下，緩慢加入到10ml水中，繼續(xù)攪拌8h，然后透析，除去四氫呋喃溶劑，透析結(jié)束后產(chǎn)品以0.22μm微孔濾膜濾過(guò)除菌。

實(shí)施例四：

雙響應(yīng)性共聚物膠束的粒徑測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射(dls法，malvern,zetasizernanoseries90)測(cè)定膠束粒徑，散射角為175°，樣品濃度為1mg/ml。結(jié)果測(cè)得粒徑分別為70.06nm。分布如圖2所示。

實(shí)施例五：

雙響應(yīng)性共聚物膠束的最低臨界溶解溫度的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射法(dls法)測(cè)定最低臨界溶解溫度，從25℃～45℃逐漸升高溫度，記錄溫度升高過(guò)程中每一度的動(dòng)態(tài)光散射強(qiáng)度，最臨界溶解溫度就是動(dòng)態(tài)光散射強(qiáng)度變化到最高值一半的對(duì)應(yīng)的溫度。測(cè)得最低溶解臨界溫度為38.9℃。

實(shí)施例六：

共聚物的臨界膠束濃度(cmc)采用熒光光譜法的方法測(cè)定，將1mg/ml尼羅紅的四氫呋喃溶液1ml加入實(shí)施例三中的膠束后，攪拌24h，載離心去除未載上的尼羅紅，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。再稀釋到0.75，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01，0.005，0.002，0.001，0.0005mg/ml，測(cè)定不同濃度下的熒光。然后以濃度為橫軸，熒光強(qiáng)度為縱軸，斜率發(fā)生變化的點(diǎn)就是對(duì)應(yīng)的臨界膠束濃度。測(cè)得的臨界膠束濃度為0.316mg/ml。

實(shí)施例七：

溫度響應(yīng)性測(cè)試

1.粒徑隨溫度的變化

在進(jìn)行實(shí)施例五的同時(shí)，記錄下粒徑的變化，如圖3所示。

當(dāng)溫度逐漸升高，但是未達(dá)到最低臨界溶解溫度時(shí)，由于溫度升高，使整個(gè)親水鏈?zhǔn)湛s，粒徑逐漸變小，但是當(dāng)溫度升高到最低臨界溶解溫度上以后，親水鏈變成疏水鏈，膠束發(fā)生聚集，粒徑變大。

2.核磁表征共聚物的溫度響應(yīng)

取2mg共聚物溶解在氘代的磷酸緩沖溶液0.5ml中(50mm)，從25℃～43℃每間隔兩度記錄一張氫譜。部分結(jié)果如圖4所示。

可以看出，隨著溫度升高，親水鏈變得逐漸疏水，n-異丙基丙烯酰胺和n,n-二甲基丙烯酰胺的信號(hào)峰逐漸減弱。

實(shí)施例八：

氧化響應(yīng)性測(cè)試

1.氧化環(huán)境中動(dòng)態(tài)光散射強(qiáng)度變化

在雙氧水的作用下，疏水端的聚環(huán)硫丙烯會(huì)被氧化成親水性的聚合物。因此整個(gè)膠束體系會(huì)崩解，動(dòng)態(tài)光射強(qiáng)度會(huì)變小，因此可以用動(dòng)態(tài)光散射強(qiáng)度的變化反應(yīng)共聚物的氧化情況。

取實(shí)施例三中的膠束配成2ml含1％的h2o2待測(cè)樣品，立刻測(cè)量散射光強(qiáng)度，以后每隔5min測(cè)量一次，2h后可以明顯的看到動(dòng)態(tài)光散射強(qiáng)度逐漸的降低，表示聚環(huán)硫丙烯正在逐漸被氧化。如下圖5所示。

2.氧化前后核磁的對(duì)比

為了更直觀的看出氧化前后的變化，0.333ml30％的雙氧水被加入到1.667ml中溶有2mg共聚物的水溶液中，常溫下攪拌24h后，凍干，以cdcl3作溶劑得到氫譜，前后對(duì)比如圖6所示。從圖6可以看出，聚環(huán)硫丙烯的特征峰消失和新的跟亞砜(或砜)的峰產(chǎn)生。

實(shí)施例九:

取5mgdox(溶于四氫呋喃溶液中)與實(shí)施例三中制備的膠束攪拌8h，透析24h，離心去掉未包裹的dox，得到雙響應(yīng)性聚合物膠束載藥體系。進(jìn)行藥效試驗(yàn)，所用細(xì)胞為a549，得到細(xì)胞毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，如圖7所示。b為載藥膠束，dox為阿霉素。

在此說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。