本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，病毒培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

病毒感染是導(dǎo)致全球兒童呼吸道疾病高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一，其中許多病毒具有感染力強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病急、病后免疫力不能持久等特點，極易造成疾病大流行。然而，病毒研究的發(fā)展常常與病毒培養(yǎng)有密切的關(guān)系。目前，部分新發(fā)呼吸道病毒(如人冠狀病毒和人偏肺病毒等)的體外培養(yǎng)分離率(增殖效率)非常低，還有部分新發(fā)呼吸道病毒(如人博卡病毒和C組鼻病毒等)則缺乏體外細胞培養(yǎng)模型。這極大地阻礙了新發(fā)呼吸道病毒的研究工作。因此，迫切需要建立新一代細胞技術(shù)平臺來解決這些病毒體外難于培養(yǎng)的問題。體外組織細胞培養(yǎng)是開展新病毒分離鑒定、致病機理及疫苗研發(fā)等工作不可或缺的技術(shù)平臺。

在病毒學(xué)的發(fā)展史中，利用體外培養(yǎng)的動物組織、胚胎或細胞，分離或培養(yǎng)病毒是突破性的成就。動物組織、胚胎等主要是選取易感動物如家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠等選擇對目的病毒敏感的試驗動物品種、品系，以適宜的接種途徑和劑量接種病毒，分離病毒，并借助感染范圍試驗鑒定病毒。動物模型可以觀察病毒對機體的侵害，造成的病理變化部位，也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，操作簡單，但實驗動物個體差異大，且價格昂貴，還需準備畜舍，實驗中受環(huán)境因素影響大，不可控因素多。

三維(3D)細胞培養(yǎng)技術(shù)是指利用各種方法及支持材料，模擬有機體內(nèi)生長模式，使培養(yǎng)細胞在體外呈現(xiàn)空間立體方式生長，形成類似有機體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何培養(yǎng)病毒，尤其是在傳統(tǒng)的體外細胞培養(yǎng)中不能或不易培養(yǎng)的病毒，在利用本發(fā)明的病毒培養(yǎng)方法成功培養(yǎng)該類不易培養(yǎng)的病毒后，可以得知該類病毒的特點是在二維細胞中不能培養(yǎng)、或在二維細胞中能培養(yǎng)但不能或不易分離或分離效率低。所述二維細胞是指單個細胞或由單個細胞組成的細胞群，所述細胞群不具有類似于或同于所述單個細胞來源的動物組織的結(jié)構(gòu)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了病毒培養(yǎng)方法。

本發(fā)明所提供的病毒培養(yǎng)方法，包括利用三維細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)動物細胞，得到三維培養(yǎng)的細胞；用病毒接種所述三維培養(yǎng)的細胞進行所述病毒的培養(yǎng)。

所述三維培養(yǎng)的細胞具有類似于或同于所述動物細胞來源的動物組織的結(jié)構(gòu)。所述三維培養(yǎng)的細胞均能形成三維立體細胞，而且細胞表面多突觸。所述三維培養(yǎng)的細胞具體可為含有所述動物組織特異型蛋白質(zhì)的細胞。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述病毒可以以所述動物為宿主。所述動物可為哺乳動物。所述哺乳動物具體可為人。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述病毒可為在現(xiàn)有的病毒培養(yǎng)方法中不能培養(yǎng)、或能培養(yǎng)但不能或不易分離或分離效率低的病毒。所述現(xiàn)有的病毒培養(yǎng)方法可為以下A1-A3這三種中的任一種：

A1.動物接種；

A2.雞胚接種；

A3.組織培養(yǎng)；所述組織培養(yǎng)是指對動物細胞或組織或器官進行培養(yǎng)后再接種病毒培養(yǎng)病毒。所述對動物細胞進行培養(yǎng)是指對動物細胞進行二維的培養(yǎng)。所述二維的培養(yǎng)可為培養(yǎng)得到所述二維細胞的培養(yǎng)。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述病毒可為下述1)或2)：

1)在二維細胞中不能培養(yǎng)的病毒；

2)在二維細胞中能培養(yǎng)但培養(yǎng)效率低的病毒。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述呼吸道病毒可為下述b1)或b2)：

b1)呼吸道病毒；

b2)博卡病毒或C組鼻病毒。

所述博卡病毒可為人博卡病毒。所述C組鼻病毒可為人C組鼻病毒。

在本發(fā)明的一個實施例中，用本發(fā)明的病毒培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病毒為C組鼻病毒(HRVc)，在二維細胞中培養(yǎng)C組鼻病毒時，該病毒不能復(fù)制擴增。

在本發(fā)明的另一個實施例中，用本發(fā)明的病毒培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病毒為博卡病毒(HBoV)，在二維細胞中培養(yǎng)博卡病毒時，該病毒不能復(fù)制擴增。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述動物細胞可為哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞可為人細胞。所述人細胞具體可為人呼吸道上皮細胞。所述人呼吸道上皮細胞可為人呼吸道上皮細胞或人支氣管上皮細胞。所述動物細胞可為原代細胞亦可為傳代細胞。

在本發(fā)明的實施例中得到的所述三維培養(yǎng)的細胞特異性表達上皮組織特異性蛋白質(zhì)細胞角蛋白5(CK5)、胞質(zhì)緊密粘連蛋白1(ZO-1)和泛細胞角質(zhì)蛋白(PCK)。

上述病毒培養(yǎng)方法中，所述三維細胞培養(yǎng)方法可為利用現(xiàn)有技術(shù)中的方法培養(yǎng)所述動物細胞得到所述三維培養(yǎng)的細胞。所述三維細胞培養(yǎng)方法具體可包括利用3D培養(yǎng)基和/或基質(zhì)膠培養(yǎng)所述動物細胞，得到所述三維培養(yǎng)的細胞。

所述利用3D培養(yǎng)基和/或基質(zhì)膠培養(yǎng)所述動物細胞可將所述動物細胞在基質(zhì)膠內(nèi)部和/或外部進行培養(yǎng)。所述培養(yǎng)所述動物細胞的溫度可為34-37℃。所述培養(yǎng)所述動物細胞具體可在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所述3D培養(yǎng)基具體可為BEGM BulletKit(CC-3171&CC-4175，美國Lonza公司)培養(yǎng)基。所述基質(zhì)膠具體可為Corning Matrigel Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix(356231，美國Corning公司)。

所述病毒培養(yǎng)的溫度可為34-37℃。所述病毒的培養(yǎng)具體可在CO₂培養(yǎng)箱中進行。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

X1)三維細胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)和/或分離病毒中的應(yīng)用；

X2)三維細胞培養(yǎng)方法所用物質(zhì)在培養(yǎng)和/或分離病毒中的應(yīng)用；

X3)三維細胞培養(yǎng)方法所用物質(zhì)在制備培養(yǎng)和/或分離病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用；

X4)三維細胞培養(yǎng)方法在構(gòu)建培養(yǎng)和/或分離病毒的細胞培養(yǎng)模型中的應(yīng)用；

X5)三維細胞培養(yǎng)方法所用物質(zhì)在構(gòu)建培養(yǎng)和/或分離病毒的細胞培養(yǎng)模型中的應(yīng)用；

X6)三維細胞培養(yǎng)方法所用物質(zhì)在制備構(gòu)建培養(yǎng)和/或分離病毒的細胞培養(yǎng)模型產(chǎn)品中的應(yīng)用；

X7)三維細胞培養(yǎng)方法在制備抗病毒疫苗和/或藥物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述三維細胞培養(yǎng)方法為上述病毒培養(yǎng)方法中所述三維細胞培養(yǎng)方法。所述病毒可為所述三維細胞培養(yǎng)方法中所述病毒。

實驗證明，本發(fā)明的病毒培養(yǎng)方法可以成功培養(yǎng)在體外二維細胞中不能培養(yǎng)或能培養(yǎng)但培養(yǎng)效率低的病毒：在體外三維培養(yǎng)細胞中培養(yǎng)的病毒含量起初基本保持一個濃度不變，之后有上升趨勢，并達到最高濃度，然后有所下降，下降趨勢比較緩慢，而相同的病毒在二維細胞中進行培養(yǎng)時，病毒含量極低，幾乎檢測不到，并且在后續(xù)培養(yǎng)中沒有增加現(xiàn)象。本發(fā)明不需特殊的3D細胞培養(yǎng)裝置，極大地降低了成本，易于操作，適合小規(guī)模3D細胞培養(yǎng)及小規(guī)模難培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)。本發(fā)明的病毒培養(yǎng)方法培養(yǎng)病毒時，相比較有機體，易于實驗室操作，加快實驗進程；可以更換接種細胞類型，培養(yǎng)出不同類型的組織器官模型；并可避開了直接以人作為初始實驗研究對象的倫理道德?lián)鷳n。本發(fā)明成功實現(xiàn)呼吸道病毒的體外細胞培養(yǎng)，形成具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的難培養(yǎng)病毒的病毒培養(yǎng)技術(shù)。

附圖說明

圖1為呼吸道上皮細胞基質(zhì)膠內(nèi)培養(yǎng)示意圖。

圖2為呼吸道上皮細胞基質(zhì)膠表面培養(yǎng)示意圖。

圖3為呼吸道上皮細胞基質(zhì)膠內(nèi)/外共培養(yǎng)示意圖。

圖4為細胞光學(xué)顯微圖像(20X),左圖為2D細胞,右圖為3D細胞。

圖5為細胞透射電鏡圖像(9700X),左圖為2D細胞,右圖為3D細胞。其中箭頭所指為細胞表面突觸。

圖6為細胞的組織特異性蛋白表達,左圖為2D細胞,右圖為3D細胞。

圖7為HRVc的擴增曲線?？v坐標單位為拷貝數(shù)/200μL。

圖8為HBoV的擴增曲線?？v坐標單位為拷貝數(shù)/200μL。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明所提供的病毒培養(yǎng)方法，包括利用三維細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)動物細胞，得到三維培養(yǎng)的細胞；用病毒接種三維培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)所述病毒。下面以在呼吸道上皮細胞的三維培養(yǎng)的細胞中培養(yǎng)人C組鼻病毒和博卡病毒為例，具體闡述在二維細胞中難培養(yǎng)的病毒的培養(yǎng)方法。

下述實施例中的人原代呼吸道上皮細胞HAE(朱娜等,人原代呼吸道上皮細胞體系分離人冠狀病毒HKU1的方法及其復(fù)制特點.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2015.29(1):第80-82頁)常規(guī)培養(yǎng)可用三維培養(yǎng)基BEGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B(Xie,G.C.,et al.,Gene Knockdown in Human Rhinovirus 1B Using 2'-OMe-modified siRNAs Results in the Reactivation of the Interferon Response.Biomed Environ Sci,2016.29(2):p.137-42.)常規(guī)培養(yǎng)用加入10％血清(10099-141-FBS，美國Gibco|Thermo Fisher Scientific公司)和1％雙抗(15140163，美國Gibco|Thermo Fisher Scientific公司)的RPMI-1640(11875093，美國Gibco|Thermo Fisher Scientific公司)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的C組鼻病毒為人C組鼻病毒(Human enterovirus C，HRVc)(Zeng,S.Z.,et al.,Prevalence of human rhinovirus in children admitted to hospital with acute lower respiratory tract infections in Changsha,China.J Med Virol,2014.86(11):p.1983-9.)公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的博卡病毒(HBoV)為人博卡病毒(肖霓光等,1165例急性下呼吸道感染住院兒童的病毒病原學(xué)分析.中國當代兒科雜志,2012.14(1):第28-32頁.)，公眾可從申請人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的3D培養(yǎng)基為BEGM BulletKit(CC-3171&CC-4175，瑞士Lonza公司)培養(yǎng)基產(chǎn)品，基質(zhì)膠具體為Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix(356231，美國Corning公司)。

實施例1、病毒的培養(yǎng)

1、準備細胞：

復(fù)蘇凍存的原代或傳代呼吸道上皮細胞(人原代呼吸道上皮細胞HAE和傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B)，于37℃、5.0％(體積百分比)的CO₂培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，然后按照下述步驟2的方法分別對人原代呼吸道上皮細胞HAE和傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B進行三維細胞培養(yǎng)。

2、三維細胞的培養(yǎng)：

分別采取下述方案一、方案二和方案三進行三維細胞的培養(yǎng)：

方案一：基質(zhì)膠內(nèi)培養(yǎng)體系培養(yǎng)三維細胞，培養(yǎng)過程如圖1所示，具體步驟如下：

A.挑選狀態(tài)良好的原代或傳代呼吸道上皮細胞進行普通二維培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好，即滿度達到70％-80％時用于后續(xù)實驗；

B.將步驟A二維培養(yǎng)得到的呼吸道上皮細胞用0.25％的胰酶-EDTA(25300-054,美國Gibco|Thermo Fisher Scientific公司)消化并離心，洗去血清，用3D培養(yǎng)基重懸細胞，得到細胞懸液；按250μL細胞懸液：750μL基質(zhì)膠(Matrigel)的比例混合，得到基質(zhì)膠和細胞混合液；將該混合液接種到24孔板中，每孔200μL，10⁵個細胞/孔,置于37℃、5.0％(體積百分比)的CO₂培養(yǎng)箱孵育45min，使混合液固化，得到細胞混合固態(tài)基質(zhì)膠；

C.向步驟B得到的細胞混合固態(tài)基質(zhì)膠上加入新鮮的3D細胞培養(yǎng)基，置于37℃、5.0％(體積百分比)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換一次3D細胞培養(yǎng)基；

D.培養(yǎng)7天后，得到三維培養(yǎng)的細胞(3D細胞)，將該三維培養(yǎng)的細胞命名為三維培養(yǎng)的細胞1。

方案二：基質(zhì)膠表面培養(yǎng)體系培養(yǎng)三維細胞，培養(yǎng)過程如圖2所示，具體步驟如下：

A.按呼吸道上皮細胞的常規(guī)方法培養(yǎng)原代或傳代呼吸道上皮細胞；

B.將基質(zhì)膠鋪到多孔板中，置37℃、5.0％(體積百分比)CO₂培養(yǎng)箱45min，使基質(zhì)膠固化；

C.將步驟A培養(yǎng)得到的呼吸道上皮細胞用0.25％的胰酶-EDTA消化，離心，然后用3D細胞培養(yǎng)基重懸細胞，得到細胞懸液，將細胞懸液按照0.5×10⁶個/mL，200μL/孔的體積接種于已凝固的基質(zhì)膠表面，置于37℃、5.0％(體積百分比)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換一次3D細胞培養(yǎng)基；

D.培養(yǎng)7天后，得到三維培養(yǎng)的細胞(3D細胞)，將該三維培養(yǎng)的細胞命名為三維培養(yǎng)的細胞2。

方案三：基質(zhì)膠內(nèi)/外共培養(yǎng)體系培養(yǎng)三維細胞，培養(yǎng)過程如圖3所示，具體步驟如下：

A.挑選狀態(tài)良好的原代或傳代呼吸道上皮細胞進行普通二維培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好，即滿度達到70％-80％時用于后續(xù)實驗；

B.將步驟A二維培養(yǎng)得到的呼吸道上皮細胞用0.25％的胰酶-EDTA消化并離心，洗去血清，利用3D培養(yǎng)基重懸細胞，得到細胞懸液；將細胞懸液與基質(zhì)膠按250μL細胞懸液：750μL基質(zhì)膠的比例混合，得到基質(zhì)膠和細胞混合液；將該混合液接種到24孔板中，每孔200μL，10⁵個細胞/孔,置于37℃、5.0％(體積百分比)的CO₂培養(yǎng)箱孵育45min，使基質(zhì)膠和呼吸道上皮細胞混合液固化，得到細胞混合固態(tài)基質(zhì)膠；

C.在步驟B得到的細胞混合固態(tài)基質(zhì)膠上再加入終濃度為10⁵個細胞/mL細胞懸液200μL，置于37℃、5.0％(體積百分比)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換一次3D細胞培養(yǎng)基；

D.培養(yǎng)7天后，得到三維培養(yǎng)的細胞(3D細胞)，將該三維培養(yǎng)的細胞命名為三維培養(yǎng)的細胞3。

二維細胞的培養(yǎng)：用1640培養(yǎng)基、于37℃、5.0％(體積百分比)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)原代或傳代呼吸道上皮細胞7天，每隔2天換一次培養(yǎng)基，得到二維培養(yǎng)的細胞(2D細胞)。

細胞的鑒定：

通過光學(xué)顯微鏡(CKX31，奧林巴斯)與電鏡(通過投射電鏡(TECNAI 12，美國FEI公司)觀察，用CCD相機(Erlangshen Model 1785,美國Gatan公司)拍照)觀察人原代呼吸道上皮細胞HAE和傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B按照方案一至三得到的三維培養(yǎng)的細胞與經(jīng)二維細胞的培養(yǎng)得到的二維細胞的細胞組織形態(tài)，人原代呼吸道上皮細胞HAE三維培養(yǎng)的細胞的結(jié)果如圖4和圖5所示。結(jié)果顯示，人原代呼吸道上皮細胞HAE和傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B按照方案一至三培養(yǎng)后得到的細胞均能形成三維立體細胞，而且細胞表面多突觸；而二維細胞則均不具有這些特征。

利用免疫熒光技術(shù)檢測上皮組織特異性蛋白(細胞角蛋白5(CK5)、胞質(zhì)緊密粘連蛋白1(ZO-1)和泛細胞角質(zhì)蛋白(PCK))，檢測CK5用到的抗體為Cytokeratin 5Antibody(Santa Cruz Biotechnology公司出產(chǎn)，sc-32721)，檢測ZO-1用到的抗體為ZO-1Antibody(美國Santa Cruz Biotechnology公司出產(chǎn)，sc-10804)，檢測PCK用到的抗體為pan-Cytokeratin Antibody(Santa Cruz Biotechnology公司出產(chǎn)，sc-15367)；小鼠抗兔TIRTC、小鼠抗兔FITC、羊抗小鼠TIRTC和羊抗小鼠FITC均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，用β-tublin作為對照，共聚焦顯微鏡(FV1000，日本奧林巴斯公司)觀察拍照。人原代呼吸道上皮細胞HAE得到的三維培養(yǎng)的細胞1的鑒定結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，人原代呼吸道上皮細胞HAE和傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B按照方案一至三培養(yǎng)后均有CK5、ZO-1和PCK表達；而二維細胞則均無CK5、ZO-1和PCK表達。圖6中，DAPI染色顯為細胞核結(jié)果，Merge表示免疫組化疊加圖。

以上結(jié)果表明，三維培養(yǎng)的細胞1-3具表達人體呼吸道上皮組織特異性蛋白，表明三維培養(yǎng)的細胞1-3均形成了與人體呼吸道上皮組織類似的特點，而二維細胞并不具有該結(jié)果。

4、病毒培養(yǎng)

4.1C組鼻病毒(HRVc)的培養(yǎng)

選取原代人支氣管上皮細胞HAE，按照方案三進行培養(yǎng)，得到三維培養(yǎng)的HAE；按照二維培養(yǎng)的方法培養(yǎng)原代人支氣管上皮細胞HAE，得到二維培養(yǎng)的HAE，然后利用三維培養(yǎng)的HAE和二維培養(yǎng)的HAE按照如下方法培養(yǎng)病毒：首先，分別用PBS洗細胞一次，接種C組鼻病毒(HRVc)(病毒核酸濃度為1.86E6拷貝/200μL)50μL/每孔，于34℃,5.0％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育兩個小時，然后用PBS小心地洗三次，每次5min，加入新鮮培養(yǎng)基(三維培養(yǎng)的HAE中加入3D培養(yǎng)基，二維培養(yǎng)的HAE中加入2％的1640培養(yǎng)基)200μL，34℃,5.0％的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天收取一次樣品(細胞樣品和上清)，其余時間點細胞樣品每兩天換一次新鮮培養(yǎng)基。

檢測三維細胞培養(yǎng)時細胞內(nèi)及細胞外(上清)HRVc的含量及二維細胞培養(yǎng)液中HRVc含量：提取核酸，并用qRT-PCR(7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國ABI公司)進行檢測病毒擴增情況：探針：FAM-CCG GCC CCT GAA T-MGB,HRVc引物(5’到3’)：上游引物：5’-AAA GAT TGG ACA GGG TGT GAA GA-3’，下游引物：5’-GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA GT-3’。

結(jié)果如表1所示，HRVc感染三維細胞后的病毒核酸擴增曲線如圖7所示。

表1、細胞培養(yǎng)過程中的HRVc核酸含量(病毒基因組拷貝數(shù)/200μL)

檢測發(fā)現(xiàn)，三維細胞樣本中培養(yǎng)的病毒核酸含量開始有下降趨勢，到第三天達到最低，這可能是因為病毒感染三維細胞之后，有一個潛伏期，為合成病毒復(fù)制前期。此外，還有部分進入細胞的病毒排出細胞外。然后升高，到第五天達到最高濃度，然后又慢慢下降。

每天收集的三維培養(yǎng)細胞上清中檢測到病毒核酸含量起初基本保持一個濃度不變，到第三天后有上升趨勢，到第五天達到最高濃度，然后有所下降，下降趨勢比較緩慢。而二維細胞中的病毒含量極其微弱，幾乎檢測不到，并且在后續(xù)幾天中沒有增加現(xiàn)象。綜上所述，利用三維培養(yǎng)的細胞可以成功擴增C組鼻病毒(HRVc)，而培養(yǎng)的二維細胞不可以擴增該病毒。

4.2博卡病毒(HBoV)的培養(yǎng)

選取傳代人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B(2B細胞)，按照方案三進行培養(yǎng)，得到三維培養(yǎng)的BEAS-2B；按照二維培養(yǎng)的方法培養(yǎng)原代人支氣管上皮細胞BEAS-2B，得到二維培養(yǎng)的BEAS-2B，然后利用三維培養(yǎng)的BEAS-2B和二維培養(yǎng)的BEAS-2B按照如下方法培養(yǎng)病毒：分別用PBS洗細胞一遍后，接種博卡病毒(HBoV)(病毒核酸濃度為3.51E5拷貝/200μL)50μL/每孔，于34℃,5.0％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育兩個小時，然后用PBS小心地洗三次，每次5min，加入新鮮培養(yǎng)基(三維培養(yǎng)的BEAS-2B中加入3D培養(yǎng)基，二維培養(yǎng)的BEAS-2B中加入2％的1640培養(yǎng)基)200μL，34℃,5.0％的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每收取一次樣品(細胞樣品和上清)，其余時間點的細胞樣品每兩天換一次新鮮培養(yǎng)基。

檢測三維細胞和二維培養(yǎng)時細胞內(nèi)HBoV的核酸含量：提取核酸，并利用qRT-PCR進行檢測病毒擴增情況：HBoV引物(5’到3’)：上游引物：5’-CCT ATA TAA GCT GCT GCA CTT CCT G-3’，下游引物：5’-AAG CCA TAG TAG ACT CAC CAC AAG-3’)。

結(jié)果如表2所示，HBoV感染三維細胞后的病毒核酸擴增曲線如圖8所示。

表2、細胞培養(yǎng)過程中的HBoV核酸含量(病毒基因組拷貝數(shù)/200微升)

經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn)三維細胞中培養(yǎng)的病毒核酸含量開始有下降趨勢，1-3天達到最低，且達到一個平穩(wěn)期，這可能是因為病毒感染三維細胞之后，有一個潛伏期，為合成病毒復(fù)制前期，此外，還有部分進入細胞的病毒排出細胞外。然后升高，第七天達到最高濃度，然后又慢慢下降。而二維細胞中的病毒含量呈現(xiàn)下降趨勢，到第三天達到最低，幾乎檢測不到，并且在后續(xù)幾天中一直沒有增加現(xiàn)象。綜上所述，利用三維培養(yǎng)的細胞可以成功擴增博卡病毒(HBoV)，而利用二維培養(yǎng)的細胞不可以擴增該病毒。