本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及新的抗生素pyrazolofluostatin A-C及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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Fluostatins是一類非典型角環(huán)素類化合物，這一家族的化合物結(jié)構(gòu)多樣，具有抗菌、抗腫瘤、蛋白酶抑制等多種生物活性。Pyrazolofluostatin A-C是具有吡唑環(huán)結(jié)構(gòu)的新穎的fluostatins家族化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供三種新的非典型角環(huán)素pyrazolofluostatins A-C。

本發(fā)明的三種新的非典型角環(huán)素pyrazolofluostatin A-C，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

化合物1為pyrazolofluostatin A，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為S構(gòu)型，R₃為OH，C3為S構(gòu)型；化合物2為pyrazolofluostatin B，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為R構(gòu)型，R₃為OH，C3為S構(gòu)型；化合物3為pyrazolofluostatin C，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為R構(gòu)型，R₃為H，C3為S構(gòu)型。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備抗生素pyrazolofluostatin A-C的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)制備小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的發(fā)酵培養(yǎng)物，將該發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離開，發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂吸附，后用丙酮洗脫大孔樹脂，洗脫液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取，丁酮層經(jīng)蒸餾濃縮后得到浸膏A；菌絲體先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮層經(jīng)蒸餾濃縮后得到浸膏B；

b)將浸膏A和浸膏B合并的粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100：0～0：100進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比50:50梯度洗脫下來(lái)的餾分Fr.4，后經(jīng)LH-20凝膠柱，以氯仿/甲醇體積比1:1作為流動(dòng)相洗脫，洗脫餾分再經(jīng)HPLC制備分離，得到化合物pyrazolofluostatin A-C。

所述的a步驟的制備小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的發(fā)酵培養(yǎng)物是通過(guò)以下方法制備：將活化的小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160接入種子培養(yǎng)基，28℃，200rpm，培養(yǎng)144h得種子液，將種子液以10％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)120h，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方都為每升培養(yǎng)基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，CaCO₃ 2g，余量為海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的海水或陳海水。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160在制備權(quán)利要求1所述的化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B和pyrazolofluostatin C中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B或pyrazolofluostatin C在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。

一種抗氧化藥物，其特征在于，包括化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B或pyrazolofluostatin C作為抗氧化活性成分。

本發(fā)明從小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離到了三個(gè)具有抗氧化活性的新的化合物pyrazolofluostatin A、pyrazolofluostatin B和pyrazolofluostatin C，這三個(gè)化合物具有良好的抗氧化活性，能用于制備抗氧化活性藥物，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160于2012年10月08日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為：CCTCC NO:M 2012392。其公開于專利號(hào)為：ZL201210467946.X，發(fā)明名稱為：一種小單孢菌及利用該菌制備多種抗生素的方法的專利中。

附圖說(shuō)明：

圖1是上清液的提取物(上清提取物)-浸膏A和菌絲體的提取物-浸膏B的高效液相色譜圖；

高效液相色譜(HPLC)條件：色譜柱為phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流動(dòng)相包括A相和B相，流動(dòng)相A相：10％(體積分?jǐn)?shù))的乙腈+0.08％(體積分?jǐn)?shù))的甲酸，溶劑為水，流動(dòng)B相：90％(體積分?jǐn)?shù))的乙腈，溶劑為水；進(jìn)樣程序：0-20min，流動(dòng)相比例為A相/B相(體積比)：95:5-0:100，20-21min，流動(dòng)相比例為A相/B相(體積比)：0:100，21-22min，流動(dòng)相比例為A相/B相(體積比)：0:100-95:5，22-30min，流動(dòng)相比例為A相/B相(體積比)：95:5，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速1ml/min，其中1代表化合物1，2代表化合物2，3代表化合物3。

圖2化合物1的關(guān)鍵的HMBC，¹H–¹H COSY及化合物1的晶體衍射結(jié)構(gòu)。

圖3化合物2-3的關(guān)鍵的HMBC，¹H–¹H COSY和NOE相關(guān)。

圖4化合物1的H譜圖。

圖5化合物1的C譜圖。

圖6化合物2的H譜圖。

圖7化合物2的C譜圖。

圖8化合物3的H譜圖。

圖9化合物3的C譜圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：活性代謝產(chǎn)物pyrazolofluostatin A-C的分離和制備

1、配制培養(yǎng)基：

種子培養(yǎng)基配制，每升種子培養(yǎng)基中含有：淀粉10g，葡萄糖20g，酵母粉10g，玉米粉3g，牛肉膏3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，CaCO₃ 2g，余量為海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的海水或陳海水，pH 7.2，其配制方法是將上述組分按其含量混合均勻后調(diào)pH值，然后115℃，滅菌30min，備用；

發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同。

2、發(fā)酵：

種子培養(yǎng)：將在平板上活化的海洋來(lái)源的小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160接入種子培養(yǎng)基(800mL)中，28℃，200rpm，培養(yǎng)144h制得種子液；

規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積分?jǐn)?shù)10％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中(8L)，28℃，200rpm，培養(yǎng)120h，而制得小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的發(fā)酵培養(yǎng)物。3、發(fā)酵液的萃?。?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)物先進(jìn)行離心分離(3500r·min-1，8min)，得到9L體積的上清液(發(fā)酵液)和菌絲體。發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂XAD16固相萃取，后用丙酮洗脫大孔樹脂3次，洗脫液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取3次，丁酮層經(jīng)蒸餾濃縮后得到上清液提取物-浸膏A(3.6g)；菌絲體用2L丙酮在室溫下浸提3次，每次3小時(shí)，合并提取液，減壓回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮層減壓蒸餾得菌絲體提取物—浸膏B(0.7g)。將浸膏A與B合并為浸膏C(6.5g)。

浸膏A和浸膏B通過(guò)HPLC分析，其含有化合物1、2和3，具體如圖1所示。

4、化合物的分離

a)浸膏C經(jīng)硅膠柱層析(300-400mesh)，以氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100：0～0：100進(jìn)行梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比50:50梯度洗脫下來(lái)的餾分Fr.4。

b)300mg的餾分Fr.4經(jīng)凝膠sephadex LH-20柱層析，用體積比為1:1的氯仿-甲醇作為流動(dòng)相洗脫，洗脫1200ml，每100ml收集為一個(gè)餾分，先后依次得餾分Fr.4A至Fr.4I，把收集的第7個(gè)餾分Fr.4G(120mg)。Fr.4G(120mg)使用半制備型高效液相色譜(乙腈：水85:15v/v，流速2.5ml/min)，運(yùn)用C-18反相柱(250×10.0mm i.d.,5μm,Phenomenex,USA)制備，收集保留時(shí)間為第7分鐘的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pyrazolofluostatin B(11mg，化合物2)；收集保留時(shí)間第9分鐘的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pyrazolofluostatin A(17mg，化合物1),收集保留時(shí)間第11分鐘的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pyrazolofluostatin C(7mg，化合物3)。

5、化合物的鑒定

通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，對(duì)本發(fā)明的從小單孢菌(Micromonospora rosaria)SCSIO N160的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備得到的3個(gè)化合物—化合物1-3(對(duì)應(yīng)化合物pyrazolofluostatin A-C)(式(I))對(duì)其進(jìn)行鑒定，其鑒定結(jié)果如下：

圖2化合物1的關(guān)鍵的HMBC，¹H–¹H COSY及化合物1的晶體衍射結(jié)構(gòu)。

圖3化合物2-3的關(guān)鍵的HMBC，¹H–¹H COSY和NOE相關(guān)。

圖4化合物1的H譜圖。

圖5化合物1的C譜圖。

圖6化合物2的H譜圖。

圖7化合物2的C譜圖。

圖8化合物3的H譜圖。

圖9化合物3的C譜圖，化合物1、2和3的核磁數(shù)據(jù)如表1所示。

化合物1(pyrazolofluostatin A):白色晶體，UV(MeOH)λ_max(logε)202nm(4.04),263nm(4.02),284nm(3.80)；IR(KBr)ν_max 3211,1656,15973cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 353.0784,[M-H]^-,calcd for 353.0779)

化合物1的負(fù)源高分辨電噴霧質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 353.0784,[M-H]^-，推測(cè)其分子式為C₁₈H₁₄N₂O₆(計(jì)算值為353.0779，不飽和度為13),IR譜在3265cm^-1有強(qiáng)吸收，提示在分子中存在NH。分析¹H,¹³C和HSQC(表1)數(shù)據(jù)表明該化合物含有一個(gè)甲基(δ_H1.42,3H,s)，一對(duì)連氧的相互偶合的次甲基(δ_H 5.03,1H,d,J＝4.0Hz；3.80,1H,d,J＝4.0Hz)，一個(gè)1,2,3-三取代的苯環(huán)(δ_H 6.71,1H,d,J＝7.5Hz；6.90,1H,dd,J＝7.0,7.5Hz；6.82,d,J＝7.0Hz)，碳譜顯示有18個(gè)碳，包括1個(gè)甲基，2個(gè)sp³雜化的次甲基，3個(gè)sp²雜化的次甲基，和12個(gè)季碳。進(jìn)一步的2D NMR分析，顯示化合物1中有一個(gè)典型的fluorenone環(huán)(A,B,C環(huán))，和一個(gè)不已烯環(huán)(D環(huán))，以上的這些信號(hào)說(shuō)明化合物1是非典型角環(huán)素家族中的一員(Zhang,W.；Liu,Z.；Li,S.；Lu,Y.；Chen,Y.；Zhang,H.；Zhang,G.；Zhu,Y.；Zhang,G.；Zhang,W.；Liu,J.；Zhang,C.,.J.Nat.Prod.2012,75,1937-1943)。

化合物1的NMR譜與fluostatin C相似。與fluostatin C相比，化合物1中C-2，C-3位碳化學(xué)位移下移，說(shuō)明化合物1中C-2，C-3位是兩個(gè)羥基，不同于fluostatin C，C-2，C-3是環(huán)氧。另外，根據(jù)化合物1的分子式、不飽和度，及C-4位的化學(xué)位移的變化，推測(cè)化合物1中含有吡唑環(huán)。這樣構(gòu)建了化合物1的平面結(jié)構(gòu)，化合物1的相對(duì)構(gòu)型是通過(guò)偶合常數(shù)與NOE相關(guān)來(lái)確定的。根據(jù)H-1/H-2間的偶合常數(shù)(³J_H1-H2 4.0Hz)及與參考文獻(xiàn)的比較(Zhang,W.；Liu,Z.；Li,S.；Lu,Y.；Chen,Y.；Zhang,H.；Zhang,G.；Zhu,Y.；Zhang,G.；Zhang,W.；Liu,J.；Zhang,C.,.J.Nat.Prod.2012,75,1937-1943)，將H-1/H-2歸屬為反式構(gòu)型。H-1/H-3間的NOE相關(guān)說(shuō)明了H-1/H-3同側(cè)。最后，在水：甲醇混合體系中，我們得到了化合物1的單晶(CCDC 1481191)，從而進(jìn)一步確證了化合物1的結(jié)構(gòu)。根據(jù)化合物的Flack常數(shù)0.05(3),將化合物1確定為1R,2S,和3S。

化合物2(pyrazolofluostatin B):白色固體，Pyrazolofluostatin B(2):UV(MeOH)λ_max(logε)203nm(4.11),263nm(4.06),284nm(3.88),331nm(3.62)；IR(KBr)ν_max 3265,1660,1589,cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 353.0788,[M-H]^-,calcd for 353.0779,Figure S2A).

化合物2的負(fù)源高分辨電噴霧質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 353.0788([M-H]^-，推測(cè)其分子式為C₁₈H₁₄N₂O₆(計(jì)算值為353.0779)?；衔?的¹H和¹³C譜數(shù)據(jù)(表1)與化合物1的很相似，分子量與化合物1相同。推測(cè)化合物2與化合物1是一對(duì)立體異構(gòu)體。進(jìn)一步，通過(guò)仔細(xì)分析化合物2的2D NMR確認(rèn)了化合物2的平面結(jié)構(gòu)。與化合物1相比，化合物2中H-1/H-2間的偶合常數(shù)變大[³J_H1-H2(7.3Hz)，化合物1中為(³J_H1-H2 4.0Hz)]，推測(cè)化合物2中H-1/H-2間的構(gòu)型為順式。化合物2中OH-1/OH-3和H-2/H₃-12間的NOE相關(guān)說(shuō)明OH-2與OH-3在同一側(cè)，也進(jìn)一步說(shuō)明H-1與H-2為順式。最后，通過(guò)與化合物1相比，將化合物2的絕對(duì)構(gòu)型歸屬為1R，2R，3S。

化合物3(pyrazolofluostatin C):UV(MeOH)λ_max(logε)202nm(4.02),261nm(4.01),285nm(3.97),323nm(3.48)；IR(KBr)ν_max 3265,167,1662cm^-1.¹H and ¹³C NMR data,see Table 1；HRESIMS(m/z 337.0838,[M-H]^-,calcd for 337.0830,Figure S3A)

化合物3為白色固體?；衔?的負(fù)源高分辨電噴霧質(zhì)譜圖顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z337.0838[M-H]-，推測(cè)其分子式為C₁₈H₁₄N₂O₅(計(jì)算值為337.0830)?；衔?的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)與化合物1的很相似(表1)。主要的不同之處在于化合物3中C-3位由甲基取代了羥基。H-3/H₃-12間的COSY相關(guān)及H₃-12到C-2/C-3/C-4的HMBC相關(guān)證明了這種不同。進(jìn)一步，通過(guò)詳細(xì)的分析2D NMR歸屬了化合物3的平面結(jié)構(gòu)。根據(jù)化合物3中H-1/H-2and H-2/H-3間的偶合常數(shù)(JH-1/H-2＝2.0Hz和JH-2/H-3＝3.0Hz)及H-1/H-3，和H-2/H₃-12的NOE相關(guān)，將H-1/H-2，H-2/H-3間確定為反式構(gòu)型。

由此確定化合物1-3的結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

化合物1為pyrazolofluostatin A，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為S構(gòu)型，R₃為OH，C3為S構(gòu)型；化合物2為pyrazolofluostatin B，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為R構(gòu)型，R₃為OH，C3為S構(gòu)型；化合物3為pyrazolofluostatin C，R₁為OH，C1為R構(gòu)型，R₂為OH，C2為R構(gòu)型，R₃為H，C3為S構(gòu)型。

表1.化合物pyrazolofluostatin A–C(1–3)的NMR(500MHz)核磁數(shù)據(jù)歸屬

Table1.¹H NMR(500MHz)and ¹³C NMR(125MHz)assignments of compounds 1–3(J in Hz within parentheses).

^aRecorded at 500MHz in DMSO-d₆；assignments were based on DEPT,HSQC,COSY,HMBC,and NOESY experiments.

實(shí)施例2：pyrazolofluostatin A–C的抗氧化活性測(cè)定

Pyrazolofluostatin A–C針對(duì)DPPH進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[Chou,T.-H.；Ding,H.-Y.；Lin,R.-J.；Liang,J.-Y.；Liang,C.-H.,Inhibition of Melanogenesis and Oxi dation by Protocatechuic Acid from Origanum vulgare(Oregano).J.Nat.Prod.2010,73,1767-1774]，以Vitamin C作為對(duì)照(對(duì)DPPH的EC₅₀是19.8±0.89μM)。結(jié)果表明pyrazo lofluostatin A對(duì)DPPH的EC₅₀是48.6±0.62μM；Pyrazolofluostatin B對(duì)DPPH的EC₅₀是31.7±0.43μM；Pyrazolofluostatin C對(duì)DPPH的EC₅₀是21.7±0.47μM。Pyrazolofluostatin A–C對(duì)所測(cè)的DPPH有抗氧化活性，通過(guò)生物工程或化學(xué)修飾可望開發(fā)成為抗氧化新藥。

表2.化合物pyrazolofluostatin A–C的抗氧化測(cè)定。

^aVitamin C,positive control。