一種用于拯救麻疹病毒、重組麻疹病毒的系統(tǒng)以及方法與流程

文檔序號：11703367閱讀：277來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于一種用于拯救麻疹病毒、重組麻疹病毒的系統(tǒng)以及方法

背景技術(shù)：

麻疹病毒(measlesvirus)是麻疹的病原體，分類上屬于副粘病毒科麻疹病毒屬。麻疹是兒童常見的一種急性傳染病，其傳染性很強(qiáng)，以皮丘疹、發(fā)熱及呼吸道癥狀為特征。若無并發(fā)癥，愈后良好。我國自60年代初應(yīng)用減毒活疫苗以來，兒童的發(fā)病率顯著下降。但在發(fā)展中國家仍是兒童死亡的一個主要原因。在天花滅絕后，who已將麻疹列為計劃消滅的傳染病之一。另外發(fā)現(xiàn)亞急性硬化性全腦炎(subacutesclerosingpanencephalitits，sspe)與麻疹病毒有關(guān)。

mv-s191是我國麻疹疫苗的生產(chǎn)株之一，已有研究表明麻疹接種后3～10年以上兒童抗體陽性率高,陽性率80.6％，抗體水平均值為108.42iu/l。提示接種麻疹疫苗后遠(yuǎn)期較高的保護(hù)性抗體水平，說明mv-s191麻疹疫苗具有良好的免疫原性。mv-s191在雞胚成纖維細(xì)胞中連續(xù)傳代35代，全基因組序列未發(fā)生任何核苷酸和氨基酸改變，未發(fā)現(xiàn)由回復(fù)突變產(chǎn)生的致病性毒株；mv感染宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中完成復(fù)制，排除整合到宿主染色體上的可能性；以上兩點充分體現(xiàn)了mv疫苗良好的遺傳穩(wěn)定性和安全性。但是，目前麻疹疫苗的制備工藝復(fù)雜，需要在不同的細(xì)胞系中傳代許多次才能得到減毒的毒株，費(fèi)時費(fèi)力。

公開號為103160473的專利申請公開了一種用于拯救麻疹病毒的方法，但是該方法利用宿主細(xì)胞rna聚合酶ii，在293-t細(xì)胞中通過cmv啟動子引導(dǎo)病毒基因組轉(zhuǎn)錄進(jìn)行11組病毒拯救實驗，僅組5，組7和組8成功拯救出了麻疹病毒，難以穩(wěn)定獲得。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的用于拯救麻疹病毒的方法。

本發(fā)明首先提供了一種用于拯救麻疹病毒或重組麻疹病毒的系統(tǒng)，它包括如下成分：

1)含有麻疹病毒反基因組全長的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒；

2)輔助質(zhì)粒1，其含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因；

3)輔助質(zhì)粒2，其含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因；

4)輔助質(zhì)粒3，其含有麻疹病毒的rna聚合酶的編碼基因。

其中，所述麻疹病毒為減毒麻疹疫苗株滬191；所述的重組麻疹病毒為表達(dá)gfp的重組麻疹病毒滬191。

其中，所述含有麻疹病毒反基因組全長的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為含有麻疹病毒反基因組全長的質(zhì)粒pt7mvs191或pt7mvs191-atu1-gfp；其中，所述pt7mvs191的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述pt7mvs191-atu1-gfp的核苷酸序列如seqidno.2所示。

其中，所述輔助質(zhì)粒1的核苷酸序列如seqidno.3所示。

其中，所述輔助質(zhì)粒2的核苷酸序列如seqidno.4所示。

其中，所述輔助質(zhì)粒3的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本發(fā)明還提供了前述拯救麻疹病毒及重組麻疹病毒的方法，它是采用前述的系統(tǒng)進(jìn)行拯救，步驟如下：

(1)將前述系統(tǒng)中的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞匯合度為60％～90％時的輔助細(xì)胞；

(2)37℃培養(yǎng)，熱休克，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3d，得培養(yǎng)的上清混合物。

(3)取步驟(2)的上清混合物，感染宿主細(xì)胞，回收表達(dá)的病毒顆粒。

步驟(1)中，所述輔助細(xì)胞為表達(dá)t7rna聚合酶的bsrt7細(xì)胞。

步驟(2)中，所述熱休克的溫度為42-44℃，優(yōu)選溫度為43.5℃；所述熱休克時間為1-4小時，優(yōu)選3小時。

步驟(3)中，所述的宿主細(xì)胞為veroslam細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞或者雞胚成纖維細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了前述的方法在制備適用于治療性和/或預(yù)防性的感染性麻疹病毒和/或重組麻疹病毒中的用途。

mv基因組由連續(xù)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元---核衣殼蛋白(n)、磷酸化蛋白(p/c/v)、基質(zhì)蛋白(m)、融膜蛋白(f)、血凝素蛋白(h)及l(fā)蛋白組成，這些基因之間存在一段基因間隔區(qū)域，該區(qū)的核苷酸變化不影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。已有多項研究在p和m基因以及h和l之間的基因間隔區(qū)域引入轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)外源基因，并已經(jīng)應(yīng)用到疫苗開發(fā)中。此外，由于mv核衣殼呈螺旋對稱，可攜帶的外源基因達(dá)mv基因組大小的30％，經(jīng)12輪傳代后，96％的病毒感染細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)外源基因。mv感染免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞后，外源基因可通過相應(yīng)免疫應(yīng)答途徑產(chǎn)生抗體。

本發(fā)明建立了可以拯救麻疹病毒滬191毒株、表達(dá)gfp的重組麻疹病毒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進(jìn)行12組實驗，均得到了具有感染力的麻疹病毒和重組麻疹病毒，拯救效率高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用前景非常優(yōu)良。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施實例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1麻疹病毒滬-191株分段示意

圖2載體pt7-ireshis-cdna的改造示意圖

圖3pt7mvs191的構(gòu)建示意圖

圖4pt7mvs191-atu-gfp的構(gòu)建示意圖

圖5pt7-mv-n的構(gòu)建示意圖

圖6pt7-mv-p的構(gòu)建示意圖

圖7pt7-mv-l的構(gòu)建示意圖

圖8改造后載體pt7-mcs的鑒定結(jié)果，1：asci、sspi雙酶切載體pt7-mcs；2：dl15000dna分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖9pt7mvs191、pt7mvs191-atu-gfp的鑒定結(jié)果

1-3：pt7mvs191-atu-gfp的限制性酶切分析：1：spei、2：ncoi、3：ecori、4：gfp的pcr產(chǎn)物5：dl5000dna分子量標(biāo)準(zhǔn)、6：dl15000dna分子量標(biāo)準(zhǔn)、7-8：pt7mvs191的限制性酶切分析7：spei、8：ecori、9：ncoi

圖10mvs191拯救實驗，a:光學(xué)顯微鏡b:熒光顯微鏡c:pt7mvs191示意圖

圖11mvs191-atu-gfp拯救實驗，a:光學(xué)顯微鏡b:熒光顯微鏡c:pt7mvs191-atu-gfp示意圖

圖12rt-pcr鑒定病毒感染，1-3:第1、2、3代毒種感染的veroslam細(xì)胞的mvf1pcr鑒定結(jié)果；4-6:第1、2、3代毒種感染的veroslam細(xì)胞的mvf4pcr鑒定結(jié)果；7：dl5000dna分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖13本發(fā)明拯救麻疹病毒或表達(dá)gfp的重組麻疹病毒的系統(tǒng)

具體實施方式

實施例1本發(fā)明拯救麻疹病毒或表達(dá)gfp的重組麻疹病毒載體的構(gòu)建

1材料與方法

1.1載體、毒株來源

麻疹病毒滬191來源于上海生物制品研究所。pt7‐ireshis‐cdna購自takara公司；載體pgem-t購自美國promega公司。

1.2主要試劑

高純度病毒rna提取試劑盒購自roche公司；phusion高保真dna聚合酶、t4dna連接酶購自neb公司；隨機(jī)引物、superscriptiii反轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine^tm2000購自美國invitrogen公司；膠回收試劑盒購自promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自omega公司；瓊脂糖、dnamarker購自takara公司；其他試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3病毒rna提取和rt-pcr

取凍干疫苗株，水溶解后，按照roche高純度病毒rna提取試劑盒說明書所示方法提取麻疹病毒滬-191株的基因組rna，以隨機(jī)引物將基因組rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna。反應(yīng)條件為：隨機(jī)引物1ul，rna11ul，dntps1ul混合后，65℃反應(yīng)5min，冰浴1min。然后加入5×fsbuffer4ul，0.1mdtt1ul，rnaseout1ul，superscriptiii1ul，55℃反應(yīng)60min；再70℃反應(yīng)15min。以此cdna為模板，用phusion高保真dna聚合酶將病毒反基因組分為7個片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)擴(kuò)增。7個片段對應(yīng)的引物及所含酶切位點如表1所示。

麻疹病毒滬-191株分段示意圖如圖1所示。

表1.麻疹病毒滬-191株分段克隆引物

1.4載體pt7-ireshis-cdna的改造

如圖2所示，以pt7-ireshis-cdna載體為模板，以pt7-ires-noti：atccgcggccgctaattcac以及pt7-ires-nhei：

tagctagcaagcttggcgtaatcatg為上下游引物，pcr擴(kuò)增去除pt7-ireshiscdna載體emcv-ires序列及sacii酶切位點。合成nhei-asci-sacii-xmai-paci-ecori-kpni-bsrgi-noti限制性內(nèi)切酶的多克隆位點序列(mcs)：

gctagctagttggcgcgccaatccccgcggggatccccccggggggaccttaattaaggccggaattccggcggggtaccccggcgctgtacagcgcataagaatgcggccgc。將多克隆位點序列(mcs)通過nhei和noti酶切位點與載體pcr擴(kuò)增產(chǎn)物連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，選取合適的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。改造后的載體命名為pt7-mcs。

用替換后多克隆位點(mcs)上的內(nèi)切酶asci和載體上的單一酶切位點sspi對改造后的pt7-mcs進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切后的長度為691bp和2300bp酶切鑒定結(jié)果見圖7。

1.5病毒反基因組pcr產(chǎn)物的克隆

擴(kuò)增的7段pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收目的條帶，回收產(chǎn)物與載體pgem-t進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)，挑取菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，小提質(zhì)粒。測序確認(rèn)插入片段與麻疹病毒滬-191株標(biāo)準(zhǔn)序列(genbankaccessno：fj416067.1)完全相同后，將質(zhì)粒分別命名為pt-mvf1、pt-mvf2、pt-mvf3、pt-mvf4、pt-mvf5、pt-mvf6以及pt-mvf7。

根據(jù)kanazawa等^[7]所述的錘頭核酸酶序列(hamrz)的結(jié)構(gòu)和作用原理在載體pt-mvf1的5'端插入t7啟動子以及hamrz。用asci和bamhi酶切合成序列：

5’-ggcgcgcctaatacgactcactatagggccaactttgtttggtctgatgagtccgtgaggacgaaacccgggtcaccaaacaaagttgggtaaggatagttcaatcaatgatcatcttctagtgcacttaggattcaagatcctattatcagggacaagagcaggattagggatatccgagatggccacacttttaaggagcttagcattgttcaaaagaaacaaggacaaaccacccattacatcaggatcc-3’與經(jīng)asci和bamhi酶切的pt-mvf1在t4dna連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)。得到的質(zhì)粒命名為pt7-mvf1-hamrz；

根據(jù)been等^[8]所述的丁型肝炎病毒核酶序列(hdvrz)的結(jié)構(gòu)和作用原理在載體pt-mvf73'端插入t7終止子以及hdvrz。用bspei和noti酶切合成序列：

5’-tccggaaccctaatcctgccctaggtggttaggcattatttgcaatatattaaagaaaactttgaaaatacgaagtttctattcccagctttgtctggtggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggcaacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggacgcggccgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgcggccgc-3’與經(jīng)bspei和noti酶切的pt-mvf7在t4dna連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)。得到的質(zhì)粒命名為pt-mvf7-hdvrz。

1.6構(gòu)建病毒全長cdna的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pt7mvs191

pt7mvs191的構(gòu)建示意圖如圖3所示。

將片段mvf2與pt7-mcs連接，并依次連接片段mvf3得到質(zhì)粒pt7-mvf23，而后將片段mvf1(hamrz)克隆至pt7-mvf23，得到麻疹病毒反基因組5’半分子質(zhì)粒，命名為pt7mvs191-5'half；將片段mvf4、mvf5、mvf6、mvf7-hdvrz先后克隆至pt7-mcs，得到麻疹病毒反基因組3’半分子質(zhì)粒，命名為pt7mvs191-3'half。將3’半分子用paci和noti酶切后克隆至5’半分子質(zhì)粒，即得到含有麻疹病毒反基因組全長的質(zhì)粒，命名為pt7mvs191(圖3)。

1.7構(gòu)建表達(dá)gfp的病毒全長cdna的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pt7mvs191-atu-gfp

pt7mvs191-atu-gfp的構(gòu)建示意圖如圖4所示。

突變掉pt7-mcs-mvf2載體上的asci酶切位點。用sali和spei酶切人工合成的附加轉(zhuǎn)錄單位(atu)序列：

5’-gtcgacccaactagcctaccctccatcattgttataaaaaacttaggaaccaggtccacacagccgccagcccatcaacgcgtacgatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccactctcggcatggacgagctgtacaagtaggcgcgcagcgcttagacgtctcgcgactagt-3’克隆至載體pt7-mvf2，將此質(zhì)粒命名為pt7-mvf2-atu。將mvf3片段與pt7-mvf2-atu載體連接，構(gòu)建pt7-mvf23-atu。該質(zhì)粒用bsiwi和bsshii雙酶切后與gfp連接，構(gòu)建ptmvs191-5'half-atu-gfp。然后按前述方式構(gòu)建含有atu的麻疹病毒反基因組5’半分子，命名為pt7mvs191-5'half-atu-gfp。將前述3’半分子ptmvs191-3'half用paci和noti酶切后克隆至5’半分子質(zhì)粒pt7mvs191-5'half-atu-gfp，即得到含有g(shù)fp的麻疹病毒反基因組全長序列的質(zhì)粒，命名為pt7mvs191-atu-gfp。

酶切鑒定pt7mvs191、pt7mvs191-atu-gfp的結(jié)果：

dnaman軟件對pt7mvs191載體序列進(jìn)行單酶切分析，spei可將該質(zhì)粒酶切成2個片段，片段大小為：5802bp，13028bp。ncoi可將該質(zhì)粒酶切成4個片段，片段大小為：936bp，1898bp，2681bp，13315bp。ecori可將該質(zhì)粒酶切成3個片段，片段大小為：411bp，5189bp，13230bp。電泳結(jié)果如圖9。酶切結(jié)果與理論序列酶切分析結(jié)果一致。

dnaman軟件對pt7mvs191-atu-gfp載體序列進(jìn)行酶切鑒定，spei可將該質(zhì)粒酶切成2個片段，片段大小為：5802bp，13892bp。ncoi可將該質(zhì)粒酶切成4個片段，片段大小為：936bp，1898bp，2681bp，14179bp。ecori可將該質(zhì)粒酶切成3個片段，片段大小為：411bp，660bp，5189bp，13230bp。用特異性上下游引物擴(kuò)增gfp片段，如圖9(lane4)可見760bp的目的條帶。將酶切鑒定正確的全長基因送樣測序，pt7mvs191-atu-gfp質(zhì)粒中的gfp編碼區(qū)序列,經(jīng)與genbank上發(fā)布的gfp(登錄號:u17997)中的相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行比對后確認(rèn)所測的序列和genbank上發(fā)布的gfp的相應(yīng)核苷酸序列完全一致,證明已構(gòu)建含有g(shù)fp的重組麻疹病毒。

pt7mvs191、pt7mvs191-atu-gfp的全長序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

1.8構(gòu)建pt7-mv-n、pt7-mv-p、pt7-mv-l

1.8.1pt7-mv-n的構(gòu)建

pt7-mv-n的構(gòu)建示意圖如圖5所示。

由于上游需要使用ncoi酶切位點，而n片段含有該位點，因此將n分為兩段(1-67bp(bamhi)、68-1578bp)連入pt7-ireshis-cdna載體。其中第一段為：合成1-67bp含有ncoi及bamhi粘性末端的兩條單鏈(l1：5＇-catggccacacttttaaggagcttagcattgttcaaaagaa

acaaggacaaaccacccattacatcag-3'；l2：5＇-catggccacacttttaaggagcttag

cattgttcaaaagaaacaaggacaaaccacccattacatcag-3')，經(jīng)退火后互補(bǔ)，連入經(jīng)ncoi+bamhi雙酶切的pt7-ireshis-cdna載體。第二段為：pcr擴(kuò)增n片段68-1578(n-p1:5'–tcaggatccggtggagccatca-3'；n-p2:5'-ggactagtctagtctagaagatttctgtcat

tg-3')片段，用bamhi、spei連入pt7-ireshis-cdna載體。

pt7-mv-n的全長序列如seqidno.3所示。

1.8.2pt7-mv-p的構(gòu)建

pt7-mv-p的構(gòu)建示意圖如圖6所示。

設(shè)計引物(p-p1：5'-aaccatggcagaagagcaggcacgcc-3'；p-p2：5'-gctctagactacttcattattatcttcatcagc-3')，擴(kuò)增p基因，用ncoi、xbai連入pt7-ireshis-cdna載體。

pt7-mv-p的全長序列如seqidno.4所示。

1.8.3pt7-mv-l的構(gòu)建

pt7-mv-l的構(gòu)建示意圖如圖7所示。

l片段采用ncoi和sali兩個位點連入pt7-ireshis-cdna載體。由于l片段含有ncoi切點，因此將l片段分兩段(1-300bp(ecori)及剩下的部分)連入載體。擴(kuò)增l片段第一段(l-p15’-cccatggatggactcgctatctgtcaaccaga-3’；l-p2：5’-gtgagttagtgtcccttaag

cattg-3’)，用ncoi、ecori連入pt7-ireshis-cdna載體，l后部分是將pvax-3’半分子下游酶切位點noti改為sali后，用ecori和sali酶切新3’半分子，回收片段。最后將其連入構(gòu)建好的pt7-l1載體。

pt7-mv-l的全長序列如seqidno.5所示。

綜上，本發(fā)明構(gòu)建得到了拯救麻疹病毒滬191毒株或表達(dá)gfp的重組麻疹病毒的系統(tǒng)所需的成分，本發(fā)明系統(tǒng)的示意圖如圖13所示。

1)含有麻疹病毒反基因組全長的質(zhì)粒pt7mvs191(核苷酸序列如seqidno.1所示)，或者pt7mvs191-atu-gfp(核苷酸序列如seqidno.2所示)；

2)輔助質(zhì)粒1(pt7-mv-n，核苷酸序列如seqidno.3所示)，其含有麻疹病毒的核衣殼蛋白的編碼基因；

3)輔助質(zhì)粒2(pt7-mv-p，核苷酸序列如seqidno.4所示)，其含有麻疹病毒的磷蛋白的編碼基因；

4)輔助質(zhì)粒3(pt7-mv-l，核苷酸序列如seqidno.5所示)，其含有麻疹病毒的rna聚合酶的編碼基因。

實施例2采用本發(fā)明系統(tǒng)拯救麻疹病毒、表達(dá)gfp的重組麻疹病毒

采用本發(fā)明實施例1構(gòu)建的載體拯救麻疹病毒、表達(dá)gfp的重組麻疹病毒：如圖13所示，建立拯救系統(tǒng)。

1病毒的拯救

將bsrt7細(xì)胞于6孔板中37℃培養(yǎng)24h，待其長成單層，細(xì)胞匯合度為80％～90％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。12μg全長質(zhì)粒pt7mvs191、12μgpt7mvs191-atu-gfp分別和輔助質(zhì)粒8μgpt7-mv-n，4μgpt7-mv-p，1μgpt7-mv-l混合，加入至100μldmem高糖培養(yǎng)液混勻后，再與已預(yù)混10μllipofectamine2000reagent的100μldmem培養(yǎng)液混勻，室溫放置30min后滴加至6孔板中，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-18h，更換新配制的含2％nbs的dmem高糖培養(yǎng)液，24h培養(yǎng)。43.5℃熱休克3h，繼續(xù)培養(yǎng)3d。

吸取6孔板上清混合物感染veroslam細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)4d后，觀察病變。收獲凍融的病變細(xì)胞及上清混合物中的病毒顆粒，pcr鑒定拯救病毒。

2、檢測

2.1細(xì)胞病變的檢測結(jié)果

本實驗共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒接種至bsrt7細(xì)胞后，43.5℃熱休克3h，以培養(yǎng)3d后的病毒上清感染veroslam細(xì)胞，可觀察到較為明顯的cpe(細(xì)胞病變效應(yīng))(如圖10，圖11)，即有多核巨細(xì)胞，胞內(nèi)和核內(nèi)有嗜酸性包涵體，典型的合胞體樣病變。用拯救的重組的pt7mvs191-atu-gfp病毒感染veroslam細(xì)胞，可在合胞體中觀察到gfp的綠色熒光(如圖11)。

2.2rt-pcr檢測拯救病毒

p1代拯救病毒mv-s191在veroslam細(xì)胞上連續(xù)傳2代，待達(dá)到90％以上病變時后收獲病毒液，提取細(xì)胞總rna，以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cdna，分別以3代病毒cdna為擴(kuò)增模板，以病毒基因mvf1、mvf4片段引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，mvf1片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：2044bp，mvf4片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：2330bp。

如圖12所示，第1、2、3代毒種感染的veroslam細(xì)胞可檢測到病毒rna存在。

3、本發(fā)明方法的拯救效率

重復(fù)步驟1的方法6次，檢測本發(fā)明方法的拯救效率。

顯微鏡結(jié)果顯示：pt7mvs191、pt7mvs191-atu-gfp拯救上清與宿主細(xì)胞veroslam共培養(yǎng)3d后，6組實驗均可觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(可見合胞體)。熒光顯微鏡結(jié)果顯示：pt7mvs191-atu-gfp拯救上清與宿主細(xì)胞veroslam共培養(yǎng)3d后，6組實驗均可觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)以及綠色熒光，這表明本發(fā)明成功拯救到麻疹病毒以及表達(dá)gfp的重組麻疹病毒。

共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量以及拯救結(jié)果如表2和表3所示：

表2：pt7mvs191拯救實驗中轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和3個輔助表達(dá)質(zhì)粒的量及拯救結(jié)果

表3：pt7mvs191-atu-gfp拯救實驗中轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和3個輔助表達(dá)質(zhì)粒的量及拯救結(jié)果

由表2和表3可知，本發(fā)明的拯救系統(tǒng)以及方法共進(jìn)行12次實驗，顯微鏡觀察及rt-pcr方法驗證均成功收獲具有感染性的麻疹病毒和重組麻疹病毒。說明該系統(tǒng)以及方法的拯救效率高，穩(wěn)定性好。

綜上，本發(fā)明構(gòu)建得到了可以拯救麻疹病毒滬191毒株、表達(dá)gfp的重組麻疹病毒的系統(tǒng)，并且建立了拯救效率極高的拯救方法，可用來獲得治療性或預(yù)防性組合物中的麻疹病毒或重組麻疹病毒。

sequencelisting

<110>成都生物制品研究所有限責(zé)任公司

<120>一種用于拯救麻疹病毒、重組麻疹病毒的系統(tǒng)以及方法

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