本發(fā)明屬于食用菌分子遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，特別涉及一種以米粒作為培養(yǎng)基質(zhì)的金針菇轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

近年來金針菇不同菌種的基因組已經(jīng)相繼測(cè)通，基因組中蘊(yùn)藏的大量信息被注釋，超過1萬個(gè)基因被預(yù)測(cè)。然而這其中大量的基因功能尚未驗(yàn)證，從而嚴(yán)重阻礙了金針菇分子育種的進(jìn)一步研究，也阻礙了科學(xué)家從分子水平對(duì)金針菇菌種進(jìn)行改良。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是進(jìn)行食用菌分子育種和基因功能研究的重要手段之一，建立一套穩(wěn)定、高效的外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)十分有必要。然而現(xiàn)有的報(bào)道中，金針菇轉(zhuǎn)化用的培養(yǎng)基大多是馬鈴薯葡萄糖瓊脂其轉(zhuǎn)化效率低，后期陽性轉(zhuǎn)化子難于分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種以米粒作為培養(yǎng)基質(zhì)的金針菇轉(zhuǎn)化方法，該方法與現(xiàn)有的方法相比，操作方便，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化子易分離，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種以米粒作為培養(yǎng)基質(zhì)的金針菇轉(zhuǎn)化方法，包括：

(1)將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金針菇菌絲，帶培養(yǎng)基(50mm×50mm)一起挑入均質(zhì)儀中，加入液體培養(yǎng)基，間歇打碎，得到液體菌絲；然后將液體菌絲接入米粒培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)8-10天，期間每天搖勻，至米粒變白；

(2)將含有雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在含有相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上劃線接種，28℃培養(yǎng)2～3天；再挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基(含抗生素)中，28℃、180～220r/min培養(yǎng)至od600＝0.5～0.6；然后取農(nóng)桿菌菌液重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、180～220r/min培養(yǎng)至od600＝0.5～0.6；

(3)取步驟(1)中的米粒加入至容器中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加乙酰丁香酮as200umol/l)，超聲、浸泡，吸掉上清液；其中，超聲頻率為40～60khz，功率為140～160w，時(shí)間為1min～2min；浸泡時(shí)間為10～15min；

(4)將步驟(2)中的農(nóng)桿菌菌液加入步驟(3)中，超聲、靜置侵染，吸掉多余菌液，20～25℃培養(yǎng)72小時(shí)以上，期間每天搖勻；最后挑取單米粒轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板(含相應(yīng)抗生素)，20～25℃培養(yǎng)7～10天，即可；其中，超聲頻率為40～60khz，功率為140～160w，時(shí)間為10s～20s；靜置侵染時(shí)間為20～30min。

所述步驟(1)中的米粒培養(yǎng)基的配制方法為：將米粒清洗干凈，蒸餾水浸泡至米粒微軟，散開到紗布上，吸干水分，再裝入三角瓶中，高溫高壓滅菌(120℃，30分鐘)。

所述步驟(2)和(3)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：k-buffer1ml；m-nsolution2ml；1％cacl20.1ml；0.01％feso41ml；20％nh4no30.25m；sporeelements0.5ml；50％甘油1ml；1mol/lph5.3mes4ml；2mol/l葡萄糖0.5ml；無菌ddh2o定容至100ml。

所述k-buffer的組成為：k2hpo420g，kh2po414.5g，用koh調(diào)ph值至7.0，無菌ddh2o定容至100ml。

所述m-nsolution的組成為：mgso4.7h2o3g，nacl1.5g，無菌ddh2o定容至100ml。

所述sporeelements的組成為：znso4.7h2o500mg/l，cuso4.5h2o500mg/l，h3bo3500mg/l，mnso4.h2o500mg/l，namoo4.2h2o500mg/l，5種溶液等體積混勻，過濾除菌，4℃保存。

所述步驟(3)中的米粒、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和農(nóng)桿菌菌液的加入比例為1g:1.5ml:1.5ml。

有益效果

本發(fā)明將菌絲接種到米粒培養(yǎng)基上，每天搖動(dòng)使菌絲在米粒上生長(zhǎng)均勻，搖動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的撞擊力能隨機(jī)使附著在米粒上的菌絲產(chǎn)生傷口，更利于后期與農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染反應(yīng)；且后期每一粒米粒都可作為一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化個(gè)體，操作以及統(tǒng)計(jì)起來更加快捷方便；與現(xiàn)有的方法相比，操作方便，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化子易分離，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為農(nóng)桿菌侵染小米粒-金針菇菌絲基質(zhì)后靜置培養(yǎng)；

圖2為轉(zhuǎn)化子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上的生長(zhǎng)狀況(g1-2代表菌株編號(hào))；

圖3為轉(zhuǎn)化子在篩選培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況(中間菌塊為未轉(zhuǎn)化的對(duì)照，d3-2代表菌株編號(hào))。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

1、小米粒培養(yǎng)基的制備

(1)將小米清洗干凈，用蒸餾水浸泡20分鐘至小米微軟，散開到干凈的紗布上，吸干水分；(2)稱量30g，裝入250ml的三角瓶中，高溫高壓滅菌(120℃，30分鐘)。

2、金針菇菌絲接種

(1)將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的金針菇菌絲，帶培養(yǎng)基(50mm×50mm)一起挑入均質(zhì)儀中，加入100ml馬鈴薯葡萄糖(pdb)培養(yǎng)基，間歇打碎30s。

(2)將上述液體菌絲取10ml接入小米粒培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)10天，期間每天搖，至米粒變白。

3、農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)

(1)將含有雙元表達(dá)載體gpie的農(nóng)桿菌在含有相應(yīng)抗生素(利福平rif20mg/l，卡那霉素kan50mg/l)的lb固體平板上劃線接種，28℃培養(yǎng)2天；1llb固體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g；

(2)挑取單菌落接種于5mllb液體培養(yǎng)基中(含利福平rif20mg/l，卡那霉素kan50mg/l)，28℃、200r/min培養(yǎng)至od600＝0.5～0.6；1llb液體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g；

(3)取200ul上述農(nóng)桿菌菌液，重懸于5ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加乙酰丁香酮as200umol/l)中，28℃、200r/min培養(yǎng)至od600＝0.5～0.6。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：k-buffer1ml；m-nsolution2ml；1％cacl20.1ml；0.01％feso41ml；20％nh4no30.25ml；sporeelements0.5ml；50％甘油1ml；1mol/lph5.3mes4ml；2mol/l葡萄糖0.5ml；無菌ddh2o定容至100ml。

k-buffer的組成為：k2hpo420g，kh2po414.5g，用koh調(diào)ph值至7.0，無菌ddh2o定容至100ml。

m-nsolution的組成為：mgso4.7h2o3g，nacl1.5g，無菌ddh2o定容至100ml。

sporeelements的組成為：znso4.7h2o500mg/l，cuso4.5h2o500mg/l，h3bo3500mg/l，mnso4.h2o500mg/l，namoo4.2h2o500mg/l，5種溶液等體積混勻，過濾除菌，4℃保存。4、農(nóng)桿菌侵染小米粒-金針菇菌絲基質(zhì)

(1)取培養(yǎng)好的小米粒1g左右加入玻璃小試管中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(未添加乙酰丁香酮as)1.5ml，用上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司的雙頻超聲波清洗器超聲1min(頻率40khz、功率160w)，靜置10min，吸掉上清液；

(2)加入步驟3中搖好的農(nóng)桿菌菌液1.5ml，用上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司的雙頻超聲波清洗器超聲10s(頻率40khz、功率160w)，靜置侵染20min，吸掉多余菌液，25℃靜置培養(yǎng)72小時(shí)以上，期間每天搖勻2次；

(3)將小米粒單粒轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板(含潮霉素hyg5mg/l，頭孢噻肟鈉cef400mg/l，as200umol/l)，每個(gè)平板接25粒，25℃培養(yǎng)7天；

(4)統(tǒng)計(jì)能夠長(zhǎng)出菌絲的小米個(gè)數(shù)，把小米周圍的菌絲重新挑到篩選培養(yǎng)基(hyg10mg/l，cef400mg/l)，平板中間設(shè)置沒有被農(nóng)桿菌侵染的菌絲作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)，觀察菌絲的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖3。

5、轉(zhuǎn)化子的篩選驗(yàn)證

(1)能夠長(zhǎng)出菌絲的轉(zhuǎn)化子接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，23℃～25℃下避光搖瓶培養(yǎng)，3d～4d后收集菌絲；

(2)用ctab法提取上述菌絲的基因組dna，檢測(cè)總基因組dna濃度和純度，調(diào)整樣品dna的濃度一致；

(3)對(duì)上述提取的dna進(jìn)行標(biāo)記基因潮霉素hyg的pcr擴(kuò)增；

pcr擴(kuò)增體系為：總體積20μl，包括：10×pcrbuffer2μl，25mmol/lmgcl22μl，10mmol/ldntp0.4μl，5u/μltaqdna酶0.2μl，10μmol/lhyg正向引物和反向引物總體積各1μl，濃度20ng～30ng/μl提取的模板dna2μl，ddh2o11.4μl；

pcr反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30second，56℃40second，72℃30second，30個(gè)循環(huán)；72℃8min。

所用潮霉素引物為：

hyg-f：gatgttggcgacctcgtatt；

hyg-r：tcgttatgtttatcggcacttt；

(4)pcr產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)公司測(cè)序驗(yàn)證；

(5)統(tǒng)計(jì)陽性轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率結(jié)果為38.26％，并保種。

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<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

上海炎地農(nóng)業(yè)科技有限公司

<120>一種以米粒作為培養(yǎng)基質(zhì)的金針菇轉(zhuǎn)化方法

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