本實(shí)用新型涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀。

背景技術(shù)：

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異性核酸片段技術(shù)。此技術(shù)主要利用兩對(duì)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，從而保證引物可以在等溫條件下順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。因?yàn)槠淇朔藗鹘y(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR反應(yīng)）需通過反復(fù)的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，并避免了反復(fù)降溫的耗時(shí)過程，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，可以在15-60分鐘擴(kuò)增出10⁹-10¹⁰倍靶序列拷貝，具有更高的靈敏度、特異性和擴(kuò)增效率。LAMP在病原微生物的快速檢測(cè)、遺傳病檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性分型等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。目前LAMP已應(yīng)用于腫瘤突變基因、結(jié)核分枝桿菌及病毒的快速檢測(cè)。

LAMP產(chǎn)物檢測(cè)方法包括瓊脂糖電泳檢測(cè)，焦磷酸鎂濁度檢測(cè)，熒光定量檢測(cè)和熒光目測(cè)。LAMP產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)的結(jié)果為連續(xù)梯狀電泳條帶，但由于需要開蓋檢測(cè)，容易造成污染。熒光定量檢測(cè)存在較為繁瑣且需特殊儀器設(shè)備、成本高的特點(diǎn)。焦磷酸鎂濁度檢測(cè)是相對(duì)簡便檢測(cè)方法，但仍需實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)儀，從而限制了其廣泛應(yīng)用。熒光目測(cè)法是目前最簡便、快速的方法，選擇鈣黃綠素作為熒光指示劑，反應(yīng)前加入LAMP反應(yīng)體系，一步反應(yīng)后無需開蓋，可直接裸眼準(zhǔn)確判斷反應(yīng)結(jié)果，適用于即時(shí)檢測(cè)（Point of care testing, POCT）。POCT主要是指在實(shí)驗(yàn)室以外的現(xiàn)場(chǎng)（包括患者床旁、急診科室、醫(yī)師診所、家庭內(nèi)）實(shí)施的快速檢測(cè)。就LAMP技術(shù)本身而言，并不能實(shí)現(xiàn)LAMP反應(yīng)的POCT。

微流控芯片（Microchip）是一種可集成化，微型化和便攜化的技術(shù)平臺(tái)。此技術(shù)在微米尺度的空間上進(jìn)行流體控制，可將臨床實(shí)驗(yàn)室的功能集成在幾平方厘米的芯片上。其具備規(guī)模集成，樣品處理時(shí)間短，檢測(cè)靈敏度高和成本低的特點(diǎn)，為LAMP反應(yīng)的POCT提供了廣闊的應(yīng)用平臺(tái)。LAMP結(jié)合微流控芯片（Microchip）則可擺脫對(duì)精良儀器設(shè)備及精確溫度的的依賴，可望實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP反應(yīng)的POCT。

目前，許多研究將LAMP技術(shù)與微流控芯片結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原體核酸及腫瘤基因突變的簡單、快速檢測(cè)。但上述研究仍需水浴鍋、熱板等插電的輔助設(shè)備提供恒溫，受固定的檢測(cè)場(chǎng)所限制，達(dá)不到POCT的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀，以實(shí)現(xiàn)LAMP反應(yīng)的即時(shí)檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案：

一方面，本實(shí)用新型提供一種便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀，包括箱蓋及箱體，所述箱體內(nèi)設(shè)置微流控芯片、溫控裝置和可視化檢測(cè)系統(tǒng)；所述溫控裝置包括溫度控制器及加熱金屬塊，所述微流控芯片放置于所述加熱金屬塊上，所述微流控芯片和所述加熱金屬塊周圍設(shè)置透明擋板，所述透明擋板上設(shè)置可拆卸的蓋板，所述可視化檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置于所述蓋板上，所述可視化檢測(cè)系統(tǒng)包括微型攝像機(jī)和微型紫外熒光燈。

優(yōu)選的，所述微流控芯片包括檢測(cè)槽道、獨(dú)立對(duì)照槽道、陽性對(duì)照槽道、陰性對(duì)照槽道以及陰性獨(dú)立對(duì)照槽道，所述檢測(cè)槽道、陽性對(duì)照槽道和陰性對(duì)照槽道通過相應(yīng)的流體控制通道連接至樣品及試劑反應(yīng)液入口，所述流體控制通道的旁側(cè)設(shè)置引物包被入口，所述樣品及試劑反應(yīng)液入口位于所述微流控芯片的中央，所有槽道的端部均設(shè)置廢液出口，所述獨(dú)立對(duì)照槽道及所述陰性獨(dú)立對(duì)照槽道均設(shè)置獨(dú)立的對(duì)照反應(yīng)液入口。

優(yōu)選的，所述溫度控制器為單片機(jī)控制，包括溫度控制部分、溫度顯示部分、溫度測(cè)量部分、蜂鳴報(bào)警器以及顯示面板，所述溫度控制部分包括時(shí)間程序控制，所述顯示面板包括溫度顯示窗口和電壓顯示窗口，所述蜂鳴報(bào)警器為低壓報(bào)警。

優(yōu)選的，所述低壓報(bào)警的壓力值為≤20.5V。

優(yōu)選的，所述時(shí)間程序控制的步驟為加熱溫度至恒定值，恒溫反應(yīng)1小時(shí)后，自動(dòng)開啟微型紫外燈和微型攝像機(jī)。

優(yōu)選的，所述溫度控制器的控制溫度為63℃。

優(yōu)選的，所述流體控制通道的形狀為逶迤微通道。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)槽道和所述獨(dú)立對(duì)照槽道的數(shù)量均為5個(gè)。

優(yōu)選的，所述箱蓋與所述箱體通過位于側(cè)面的鎖片連接，箱蓋的中央位置設(shè)置把手。

優(yōu)選的，所述微型攝像機(jī)和微型紫外熒光燈位于微流控芯片的正上方。

優(yōu)選的，所述微型攝像機(jī)通過WIFI與圖像顯示設(shè)備連接。

優(yōu)選的，所述圖像顯示設(shè)備包括電腦，手機(jī)，相機(jī)。

優(yōu)選的，所述可視化檢測(cè)儀的電源為鋰電池，所述鋰電池為可充電的。

第二方面，本實(shí)用新型提供了微流控芯片的制作方法及其應(yīng)用，所述制作方法包括以下步驟：

步驟一、采用軟光刻技術(shù)加工陽模；

步驟二、在步驟一所述的陽模上澆注PDMS并固化；

步驟三、將步驟二處理后的陽模與玻璃片進(jìn)行鍵合。

所述微流控芯片的應(yīng)用包括骨髓增殖性腫瘤多位點(diǎn)基因突變檢測(cè)、其他腫瘤多位點(diǎn)基因突變及病原體核酸檢測(cè)。

第三方面，本實(shí)用新型提供了便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一、從引物包被入口注入引物，制成功能化的微流控芯片；

步驟二、檢測(cè)槽道、陽性對(duì)照槽道和陰性對(duì)照槽道從樣品及試劑反應(yīng)液入口注入反應(yīng)液，然后從樣品及試劑反應(yīng)液入口注入礦物油，最后封堵微流控芯片的樣品及試劑反應(yīng)液入口、廢液出口；

步驟三、各獨(dú)立對(duì)照槽道通過相應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)液入口分別加入對(duì)照反應(yīng)液，然后封堵相應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)液入口及廢液出口；

步驟四、將上述步驟處理后的微流控芯片放置在加熱金屬塊上，由溫控裝置加熱，并恒溫反應(yīng)1小時(shí)；

步驟五、開啟微型紫外熒光燈，用微型攝像機(jī)拍攝檢測(cè)結(jié)果并傳送至圖像顯示設(shè)備。

優(yōu)選的，所述步驟一所述的微流控芯片的功能化采用蒸發(fā)法。

優(yōu)選的，所述步驟二和所述步驟三中的引物、礦物油及反應(yīng)液的注入均采用移液器。

優(yōu)選的，所述步驟二和所述步驟三中的樣品及試劑反應(yīng)液入口、對(duì)照反應(yīng)液入口、廢液出口均采用環(huán)氧膠封堵。

優(yōu)選的，所述步驟四中的恒溫反應(yīng)的溫度為63℃。

最后，本實(shí)用新型還涉及便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀的應(yīng)用，其涵蓋微流控芯片等溫?cái)U(kuò)增所涉及的全部應(yīng)用領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全的檢測(cè)、病毒的檢測(cè)、常見致病菌的檢測(cè)、細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)及腫瘤的檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有以下有益效果：本實(shí)用新型基于微流控芯片技術(shù)，結(jié)合LAMP技術(shù)，利用熒光目測(cè)法，將反應(yīng)、檢測(cè)及結(jié)果集成于一個(gè)便攜式設(shè)備，擺脫了固定場(chǎng)所及固定檢測(cè)設(shè)備的限制，也不依賴于精確的溫度控制，其實(shí)現(xiàn)了LAMP反應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)、快速、自動(dòng)化檢測(cè)，并可將檢測(cè)結(jié)果快速傳輸至用戶手中，有效節(jié)約了用戶的時(shí)間，完成了LAMP反應(yīng)的即時(shí)檢測(cè)。

附圖說明

圖1是本實(shí)用新型所述的便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀的立體圖；

圖2是如圖1所示的便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀在關(guān)閉狀態(tài)下的立體圖；

圖3是位于如圖1所示的微流控芯片的示意圖；

圖4是位于如圖1所示的溫控裝置的結(jié)構(gòu)圖；

圖中的附圖標(biāo)記為：

1、箱蓋；2、箱體；3、鎖片；4、把手；5、微流控芯片；6、溫度控制器；7、加熱金屬塊；8、透明擋板；9、蓋板；10、溫度顯示窗口；11、電壓顯示窗口；12、微型攝像機(jī)；13、微型紫外熒光燈；

21~25、檢測(cè)槽道；26、樣品及試劑反應(yīng)液入口；27、對(duì)照反應(yīng)液入口；28、引物包被入口；29、廢液出口；30、流體控制通道；P1~P5、獨(dú)立對(duì)照槽道；P、陽性對(duì)照槽道；N、陰性對(duì)照槽道；N*：陰性獨(dú)立對(duì)照槽道。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本實(shí)用新型的技術(shù)方案，而不能以此來限制本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。

如圖1和圖2所示，本實(shí)用新型所述的便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀，包括箱蓋1及箱體2，所述箱蓋1與所述箱體2通過位于側(cè)面的鎖片3連接，所述箱體2內(nèi)設(shè)置微流控芯片5、溫控裝置和可視化檢測(cè)系統(tǒng)；所述溫控裝置包括溫度控制6及加熱金屬塊7，所述微流控芯片5放置于所述加熱金屬塊7上，所述微流控芯片5和所述加熱金屬塊7周圍設(shè)置透明擋8，所述透明擋板8上設(shè)置可拆卸的蓋板9，所述可視化檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置于所述蓋板9上，所述可視化檢測(cè)系統(tǒng)包括微型攝像機(jī)12和微型紫外熒光燈13。

如圖3所示，所述微流控芯片5包括檢測(cè)槽道21~25、獨(dú)立對(duì)照槽道P1~P5、陽性對(duì)照槽道P、陰性對(duì)照槽道N以及陰性獨(dú)立對(duì)照槽道N*，所述檢測(cè)槽道21~25、陽性對(duì)照槽道P和陰性對(duì)照槽道N通過相應(yīng)的流體控制通道30連接至樣品及試劑反應(yīng)液入口26，所述流體控制通道30的旁側(cè)設(shè)置引物包被入口28，所述樣品及試劑反應(yīng)液入口26位于所述微流控芯片5的中央，所有槽道的端部均設(shè)置廢液出口29，所述獨(dú)立對(duì)照槽道P1~P5及所述陰性獨(dú)立對(duì)照槽道N*均設(shè)置獨(dú)立的對(duì)照反應(yīng)液入口27。

如圖4所示，所述溫控裝置為單片機(jī)控制，包括溫度控制部分、溫度顯示部分、溫度測(cè)量部分、蜂鳴報(bào)警器以及顯示面板，所述溫度控制部分包括時(shí)間程序控制，所述時(shí)間程序控制的步驟為加熱溫度至恒定值，恒溫反應(yīng)1小時(shí)后，自動(dòng)開啟微型紫外燈和微型攝像機(jī)，所述顯示面板包括溫度顯示窗口10和電壓顯示窗口11，所述蜂鳴報(bào)警器為低壓報(bào)警。所述單片機(jī)連接溫度測(cè)量部分電路、繼電器驅(qū)動(dòng)電路、顯示電路及蜂鳴器報(bào)警電路，所述繼電器驅(qū)動(dòng)電路連接加熱金屬塊。

本實(shí)用新型還提供一種便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一、從引物包被入口28注入LAMP引物，制成功能化的微流控芯片5；

步驟二、檢測(cè)槽道21~25、陽性對(duì)照槽道P和陰性對(duì)照槽道N通過樣品及試劑反應(yīng)液入口26注入反應(yīng)液，然后從樣品及試劑反應(yīng)液入口26注入礦物油，最后封堵微流控芯片的樣品及試劑反應(yīng)液入口26、廢液出口29；

步驟三、各獨(dú)立對(duì)照槽道P1~P5、N*通過相應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)液入口27分別加入對(duì)照反應(yīng)液，然后封堵相應(yīng)的對(duì)照反應(yīng)液入口27及廢液出口29；

步驟四、將上述步驟處理后的微流控芯片5放置在加熱金屬塊7上，由溫控裝置加熱，并恒溫反應(yīng)1小時(shí)；

步驟五、開啟微型紫外熒光燈13，用微型攝像機(jī)12拍攝檢測(cè)結(jié)果并傳送至圖像顯示設(shè)備。

實(shí)施例一

步驟一、制作微流控芯片5

采用軟光刻技術(shù)加工SU-8陽模，模塑法制作微流控芯片5，在陽模上澆注PDMS，固化后與玻璃片進(jìn)行鍵合。

其中，此芯片5的LAMP反應(yīng)區(qū)具有5個(gè)檢測(cè)槽道21~25及相應(yīng)的獨(dú)立對(duì)照槽道P1~P5，每個(gè)槽道容積約7 μL，其尺寸為10 mm(L)×2.4 mm(W) ×0.3 mm(H)。每個(gè)檢測(cè)槽道21~25連接流體控制通道30的逶迤微通道，其尺寸為29.5 mm(L)×0.1-0.2 mm(W) ×0.05-0.3 mm(H)；同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照槽道P、陰性對(duì)照槽道N和陰性獨(dú)立對(duì)照槽道N*，作為反應(yīng)體系的質(zhì)量控制。在微流控芯片5的使用過程中采用液體礦物油進(jìn)行流體控制。

步驟二、加工便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀

所述可視化檢測(cè)儀的尺寸為12 cm(L)×10cm(W) ×8 cm(H)，具有便攜性。采用鋰電池供電，溫控裝置由單片機(jī)控制。本實(shí)用新型中的溫度傳感器選用美國Dallas公司生產(chǎn)的單總線數(shù)字式集成溫度傳感器。

溫控裝置的技術(shù)性能：工作溫度0 –40℃；濕度≤90%，無腐蝕性氣體，控制溫度50- 100℃；控制精度：≤±0.3；一次連續(xù)工作時(shí)間3小時(shí)左右。

步驟三、基于微流控芯片的LAMP反應(yīng)的可視化檢測(cè)儀的檢測(cè)過程

本實(shí)施例以骨髓增殖性腫瘤多位點(diǎn)基因突變的檢測(cè)為例。

各槽道對(duì)應(yīng)的引物及反應(yīng)液如下：

利用軟件確定DNA序列上6個(gè)不同的區(qū)域，針對(duì)突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)的引物外(F3，B3)，內(nèi)引物（FIP，BIP）及環(huán)引物（LF，LB）。微流控芯片5個(gè)檢測(cè)槽道21~25分別對(duì)應(yīng)檢測(cè)5種基因位點(diǎn)，如下：

JAK2 V617F野生型引物：617 F3-W，617 B3-W，617 FIP-W及617 BIP-W；

JAK2 V617F突變型引物：617 F3-M，617 B3-M，617 FIP-M及617 BIP-M；

MPL W515K突變型引物：515 F3-K， 515 B3-K，515 FIP-K，515 BIP-K和515 LF-K：

MPL W515L突變型引物：515 F3-L，515 B3-L，515 FIP-L，515 BIP-L和515 LF-L；

MPL W515野生型引物：515 F3-W，551 B3-W，515 FIP-W，515 BIP-W和515 LF-W；

使用去離子雙蒸水溶解引物及探針至如下工作濃度：F3（5 μM）、B3（5 μM）、FIP（40 μM）、BIP（40 μM）、LF（40 μM）。

所述檢測(cè)槽道21~25的反應(yīng)液類型為25 μL 10 ×反應(yīng)緩沖液，4 μL DNA，2 μL鈣黃綠素，2 μL Bst DNA 聚合酶，17 μL去離子雙蒸水。

所述獨(dú)立對(duì)照槽道P1~P5的反應(yīng)液類型為3 μL 10×反應(yīng)緩沖液，0.5 μL DNA，0.25 μL Bst DNA 聚合酶，0.25 μL 鈣黃綠素，1 μL引物和1.5 μL去離子雙蒸水；

所述陽性對(duì)照槽道P的引物為Loopamp?DNA 擴(kuò)增試劑盒中陽性對(duì)照DNA（0.5 μL）和引物DNA（1 μL），反應(yīng)液類型與檢測(cè)槽道一致。

所述陰性對(duì)照槽道N不包被引物，反應(yīng)液類型與檢測(cè)槽道1~5一致。

所述陰性獨(dú)立對(duì)照槽道N*用雙蒸水代替模板DNA，反應(yīng)液類型為：3 μL 10 ×反應(yīng)緩沖液，0.25 μL Bst DNA 聚合酶，0.25 μL 鈣黃綠素，1 μL引物溶液DNA, 和2 μL去離子雙蒸水。

所述可視化檢測(cè)儀的檢測(cè)步驟如下：

使用前，將上述的不同引物對(duì)通過蒸發(fā)法包被于相應(yīng)的檢測(cè)槽道21~25/N/P內(nèi)，制成功能化芯片，由于引物具有特異性，LAMP反應(yīng)后即可對(duì)不同的基因突變進(jìn)行檢測(cè)；

采用移液器將50 μL LAMP反應(yīng)液從樣品及試劑反應(yīng)液入口26加到微流控芯片5，然后再將4 μL礦物油從樣品及試劑反應(yīng)液入口29加入，最后用環(huán)氧膠封堵微流控芯片5的樣品及試劑反應(yīng)液入口26、廢液出口29。

各對(duì)照槽道P1~P5/N*分別加入6.5 μL LAMP反應(yīng)液，用上述同樣方法封堵對(duì)照反應(yīng)液入口27和廢液出口29。

將微流控芯片5放置于加熱金屬塊7上，通過溫控裝置將溫度加熱至63℃，恒溫反應(yīng)1小時(shí)，然后自動(dòng)開啟微型紫外熒光燈13，在紫外光照射下（365 nm），反應(yīng)陽性結(jié)果顯示裸眼可見的綠色熒光，即檢測(cè)結(jié)構(gòu)為骨髓增殖性腫瘤患者M(jìn)PL W515K 突變。微型攝像機(jī)12拍攝檢測(cè)結(jié)果并將其傳送至智能手機(jī)。用戶即可在手機(jī)瀏覽器中第一時(shí)間查看檢驗(yàn)進(jìn)程，報(bào)告的完整圖片和結(jié)論等信息。

實(shí)施例二

所述微流控芯片5的應(yīng)用包括骨髓增殖性腫瘤多位點(diǎn)基因突變檢測(cè)、其他腫瘤多位點(diǎn)基因突變及病原體核酸檢測(cè)。

實(shí)施例三

所述可視化檢測(cè)儀的應(yīng)用涵蓋微流控芯片等溫?cái)U(kuò)增所涉及的全部應(yīng)用領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全的檢測(cè)、病毒的檢測(cè)、常見致病菌的檢測(cè)、細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)及腫瘤的檢測(cè)。

實(shí)施例四

應(yīng)用此便攜式可視化檢測(cè)儀并結(jié)合LAMP技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)肺炎鏈球菌，肺炎支原體，肺炎衣原體和腺病毒的快速同步檢測(cè)。

具體實(shí)施步驟與檢測(cè)腫瘤基因突變一致，不同之處僅在于針對(duì)不同的病原體設(shè)計(jì)特異LAMP引物，并在檢測(cè)前將多種引物包被于微流控芯片的檢測(cè)槽道，制成可應(yīng)用于多種呼吸道病原體檢測(cè)的功能化芯片。

通過上述實(shí)施例可知，本實(shí)用新型所述的便攜式微流控芯片LAMP可視化檢測(cè)儀，將反應(yīng)、檢測(cè)及結(jié)果集成于一個(gè)便攜式設(shè)備，擺脫了固定場(chǎng)所及固定檢測(cè)設(shè)備的限制，也不依賴于精確的溫度控制，其實(shí)現(xiàn)LAMP反應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)、快速、自動(dòng)化檢測(cè)，并可將檢測(cè)結(jié)果快速傳輸至用戶手中，有效節(jié)約了用戶的時(shí)間，完成了LAMP反應(yīng)的即時(shí)檢測(cè)。

以上對(duì)本實(shí)用新型的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本實(shí)用新型并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本實(shí)用新型的范疇之中。因此，在不脫離本實(shí)用新型的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本實(shí)用新型的范圍內(nèi)。