本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種BMP3基因甲基化檢測用試劑體系和試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是目前發(fā)病率較高的惡性腫瘤，在歐美發(fā)達國家,其發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，僅次于肺癌，也是最常見的胃腸道惡性腫瘤。近年來,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈不斷上升趨勢，死亡率為惡性腫瘤第5位。早期結(jié)直腸癌患者經(jīng)治療后5年生存率可達90％以上，但往往早期結(jié)直腸癌患者很少有臨床癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)。而晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率不足10％。因此，尋找一個有效的易于篩查及早期診斷結(jié)直腸癌的試驗方法，對結(jié)直腸癌的治療甚至治愈有很重要的意義。目前常用的結(jié)直腸癌篩查、診斷方法，如糞便隱血試驗及結(jié)直腸鏡檢查等存在特異性、敏感性或患者依從性的不足，限制了其在結(jié)直腸癌篩查及早期診斷中的廣泛應用。在腫瘤研究中許多腫瘤的產(chǎn)生都伴隨有基因的甲基化，癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化狀態(tài)，可導致癌基因的激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改變是腫瘤細胞的一個重要特征。因此本發(fā)明選擇了與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的BMP3基因甲基化狀態(tài)來確定結(jié)直腸癌的發(fā)生。經(jīng)過大量臨床試驗確定了BMP3基因的甲基化會導致結(jié)直腸癌的發(fā)生，通過檢測病人腸道內(nèi)大量脫落癌細胞中的BMP3基因甲基化狀態(tài)，從而診斷結(jié)直腸癌的發(fā)生。本發(fā)明采用先進的分子診斷方法，采用熒光PCR法早期、快速、簡便、敏感、特異檢測結(jié)直腸癌。熒光PCR技術(shù)在1995年由美國PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術(shù)問題是：結(jié)直腸癌早期診斷困難，現(xiàn)有技術(shù)的診斷方法敏感性低、陽性率低并且不方便，尚未有能夠快速、簡便地檢測BMP3基因甲基化狀態(tài)的試劑。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用試劑體系和試劑盒及其應用，用來解決現(xiàn)有的結(jié)直腸癌診斷困難，敏感性低、陽性率低和不方便的問題。具體而言，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用試劑體系，所述試劑體系包括特異性引物和特異性探針，所述特異性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特異性探針如SEQIDNO.3所示。優(yōu)選的，所述特異性探針上連接有熒光基團和淬滅基團，其中，所述的熒光基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基熒光素、異硫氰酸熒光素、TexasRed、Cy3、Cy5或VIC中的一種；所述的淬滅基團選自BHQ、4-(4-惡氨基苯偶氮)苯甲酸)或羧基四甲基羅丹明。優(yōu)選的，所述試劑體系還包括陽性標準品，所述陽性標準品中含有插入了BMP3基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的重組質(zhì)粒。優(yōu)選的，試劑體系還包括陰性標準品，所述的陰性標準品中含有未插入BMP3基因甲基化特異性序列的質(zhì)粒。優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒的濃度為1.0×103-1.0×104copies/μL，所述陰性標準品中質(zhì)粒濃度為1.0×103-1.0×104copies/μL。優(yōu)選的，所述的質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒相同，選自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322或pMD-T中的一種，優(yōu)選為pGM-T或pBR322。優(yōu)選的，所述陽性標準品中的重組質(zhì)粒和所述陰性標準品中的質(zhì)粒的制備方法如下：(1)以序列SEQIDNO.4為模板，利用引物序列SEQIDNO.5和SEQIDNO.6進行擴增，得到目的基因；(2)將目的基因連接到質(zhì)粒載體上，得到連接產(chǎn)物；(3)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)；(4)篩選含有構(gòu)建好的重組質(zhì)粒作為陽性標準品；不含目的基因的重組質(zhì)粒作為陰性標準品。優(yōu)選的，所述的試劑體系還包括緩沖液和dNTPs，所述的緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀和氯化鎂。優(yōu)選的，所述的三羥甲基氨基甲烷的濃度為50～200mM；氯化鉀的濃度為300～800mM；氯化鎂的濃度為20～50mM。優(yōu)選的，所述的三羥甲基氨基甲烷的濃度為100～150mM；氯化鉀的濃度為400～600mM；氯化鎂的濃度為30～40mM。優(yōu)選的，所述的試劑體系還包括DNA聚合酶。優(yōu)選的，所述的DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。第二方面，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用試劑盒，其包含以上任一項所述的試劑體系。第三方面，本發(fā)明提供了特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3在制備BMP3基因甲基化檢測試劑或者試劑盒中的應用。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3在制備BMP3基因甲基化結(jié)直腸癌檢測試劑或者試劑盒中的應用。優(yōu)選的，以上應用中，所述的BMP3基因甲基化檢測試劑或試劑盒的使用方法包括如下步驟：(1)對樣本DNA進行甲基化處理；(2)利用特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3，對步驟(1)得到的甲基化處理的樣本DNA進行熒光定量PCR反應，檢測樣本DNA的甲基化水平。優(yōu)選的，以上應用中，所述使用方法還包括：將含有插入了BMP3基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的重組質(zhì)粒作為陽性標準品，進行熒光定量PCR反應；將含有未插入BMP3基因甲基化特異性序列SEQIDNO.4的質(zhì)粒作為陰性標準品，進行熒光定量PCR反應。優(yōu)選的，以上應用中，所述將甲基化處理的樣本DNA的制備方法包括如下步驟：(1)從糞便樣本中提取基因組DNA；(2)利用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，得到甲基化處理的樣本DNA。優(yōu)選的，以上應用中，所述的熒光定量PCR反應條件為：94～95℃預變性2～5min，1個循環(huán)；94～95℃15～20s、53～55℃30～50s、58～60℃30～50s，40～50個循環(huán)本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明試劑盒定量準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結(jié)果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。(2)本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度和特異性高，由于采取特異性引物和探針的雙保險設(shè)計，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測結(jié)直腸癌。(3)本發(fā)明試劑盒檢測速度快，總共僅需2個小時，步驟簡單，可同時進行高通量樣本檢測。下面結(jié)合附圖和各個具體實施方式，對本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進行詳細說明，其中：附圖說明圖1為本發(fā)明實施例一提供的結(jié)直腸癌陽性標準品的熒光PCR擴增曲線和陰性標準品的熒光PCR擴增曲線。其中編號1為陽性標準品，編號2為陰性標準品。圖2為本發(fā)明實施例二提供的志愿者樣本的熒光PCR擴增曲線。其中，編號為5，6，7的樣本檢測結(jié)果為結(jié)直腸癌樣本，編號為3，4的樣本檢測結(jié)果為非結(jié)直腸癌樣本。具體實施方式如上所述，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用試劑體系和試劑盒，其目的是為了提高被測人群結(jié)直腸癌診斷的靈敏度和特異性，提供早期診斷的可靠性。具體而言，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化結(jié)直腸癌檢測用試劑體系，所述的試劑盒包括用于結(jié)直腸癌檢測的特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2和特異性探針SEQIDNO.3。具體而言，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用的試劑體系和試劑盒，所述試劑體系中含有反應液和DNA聚合酶。反應液中含有特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3；特異性探針的5’和3’端分別連接有熒光基團和熒光淬滅基團。所述熒光基團和熒光淬滅基團為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的基團。當探針上同時含有熒光報告基團和熒光淬滅基團時，不發(fā)出熒光；當特異性探針被DNA聚合酶降解時，熒光報告基團和熒光淬滅基團分開，發(fā)出熒光。反應液中還含有聚合酶鏈式反應需要的基本組分，比如緩沖液和dNTPs。在其中一優(yōu)選實施方式中，反應液中的緩沖液組成為50～200mM三羥甲基氨基甲烷，300～800mM氯化鉀和10～30mM氯化鎂。試劑體系中的DNA聚合酶為TaqDNA聚合酶。在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了一種含有BMP3基因甲基化序列的重組質(zhì)粒，所述BMP3基因甲基化序列如SEQIDNO.4所示，所述質(zhì)粒選自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322和pMD-T中的一種。在重組質(zhì)粒篩選過程中，轉(zhuǎn)化成功的含有BMP3基因甲基化序列的重組質(zhì)粒裝入陽性標準品管內(nèi)，作為陽性對照；沒有轉(zhuǎn)化成功的空白質(zhì)粒裝入陰性標準品管內(nèi)，作為陰性對照。在又一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了一種BMP3基因甲基化檢測用試劑盒，所述試劑盒包含作為陽性對照的陽性標準品，作為陰性對照的陰性標準品，反應液以及DNA聚合酶。反應液與前述BMP3基因甲基化檢測用的試劑體系中的反應液相同，同樣含有特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，以及特異性探針SEQIDNO.3，反應液的組成為：每16μL反應液中含有的SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和dNTP的量依次為10-15μM，10-15μM，10-15μM和2.5-3.0mM。試劑盒中的樣品管內(nèi)裝有從糞便中提取、并經(jīng)甲基化處理后的DNA樣本。作為陽性標準品的重組質(zhì)粒和作為陰性標準品的質(zhì)粒篩選方法包括以下步驟：(1)以序列SEQIDNO.4為模板，利用引物進行PCR擴增，所述引物序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；(2)將PCR擴增產(chǎn)物連接到質(zhì)粒上；(3)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)；(4)篩選含有構(gòu)建好的重組質(zhì)粒裝入陽性標準品管內(nèi)，不含重組質(zhì)粒的裝入陰性對照品管內(nèi)。采用本發(fā)明所述試劑盒檢測BMP3基因甲基化的情況，檢測方法包括以下步驟：樣品預處理，將處理后的樣品加入樣品管內(nèi)。制備待測溶液，即往陽性標準品管、陰性標準品管和樣品管中分別加入反應液和DNA聚合酶，混勻；各組待測溶液中的樣品量或陽性標準品含量或者陰性標準品含量相同，且反應液和DNA聚合酶的含量也相同；通常，待測溶液中陽性標準品、陰性標準品或者樣品與反應液、DNA聚合酶的比為：(1-2)μL：(18-20)μL：(5-20)U。將待測溶液放入熒光定量PCR儀中進行測定，PCR測定的條件為：94～95℃預變性2～5min，1個循環(huán)；94～95℃15～20s，53～55℃30～50s，58～60℃30～50s，共40～50個循環(huán)；最后分析熒光定量PCR測定結(jié)果，判斷樣品提供者是否患有結(jié)直腸癌。檢測前的樣品處理方法包括，先利用基因組DNA提取試劑盒從糞便樣本中提取DNA，再利用基因組DNA甲基化處理試劑盒處理提取得到的DNA。甲基化處理試劑盒的原理為亞硫酸氫鹽法甲基化處理，經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后的DNA作為樣品。本發(fā)明中的樣本DNA來源于人的糞便DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽法甲基化的處理。樣本基因組DNA經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后，若樣本基因組中的BMP3基因序列中的胞嘧啶(C)已經(jīng)被甲基化，則經(jīng)甲基化處理試劑盒處理之后的BMP3基因序列不變，如SEQIDNO.4所示，特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3能與SEQIDNO.4結(jié)合，熒光PCR反應過程中，在DNA聚合酶的作用下探針SEQIDNO.3上的5’熒光基團與3’淬滅基團分離，發(fā)出熒光；若樣本基因組中的BMP3基因序列中的胞嘧啶(C)沒有被甲基化，則經(jīng)甲基化處理試劑盒處理后，BMP3基因序列中的C變成U，即甲基化處理后的BMP3基因序列與SEQIDNO.4不同，特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3無法與處理后的樣本DNA結(jié)合，熒光PCR反應過程中，探針SEQIDNO.3保持完整，由于同時連接有5’熒光基團與3’淬滅基團，熒光PCR反應過程中不發(fā)出熒光；即經(jīng)甲基化處理試劑盒后，甲基化的BMP3基因在熒光定量PCR檢測過程中會發(fā)出熒光，而沒有甲基化的BMP3基因不發(fā)熒光。因此，本發(fā)明所述的試劑體系和試劑盒與熒光定量PCR檢測相結(jié)合后，可以用于檢測BMP3基因的甲基化狀態(tài)。BMP3基因高度甲基化是結(jié)直腸癌的重要分子標志，故本發(fā)明所述的試劑體系和試劑盒及其使用在結(jié)直腸癌診斷中具有重要意義。采用本發(fā)明所述試劑盒檢測BMP3基因甲基化狀態(tài)的方法簡單，靈敏度高，特異性強；通過檢測BMP3基因甲基化能有效判斷樣本供體是否為結(jié)直腸癌患者。應當說明的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)的方法，具體可參照薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。下面結(jié)合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，其中實施例中所用的試劑和儀器的廠家如下：熒光定量PCR儀，廠家：美國ABI實時熒光定量PCR儀7500，美國；dNTPs，廠家：TAKARA，日本；TaqDNA聚合酶，廠家：TAKARA，日本；SAP酶EF0511，廠家：賽默飛世爾科技有限公司；ExoI酶，廠家：TAKARA，日本；基因組DNA提取試劑盒，購自天根公司；基因組DNA甲基化處理試劑盒，購自QIAGEN公司；pGM-T質(zhì)粒載體，pUC18質(zhì)粒載體，pMD18-T質(zhì)粒載體，均購自天根生化科技(北京)有限公司；本發(fā)明中用到的特異性引物，以及特異性探針序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其中，特異性探針上連接的熒光基團和淬滅基團一并由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。實施例一試劑盒的準備(一)陽性標準品和陰性標準品的制備通過對大量臨床結(jié)直腸癌患者以及正常人群的DNA序列進行比對分析，設(shè)計得到一條和結(jié)直腸癌疾病有關(guān)的序列，BMP3基因甲基化序列SEQIDNO.4，SEQIDNO.4序列如下：TTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAGTTGGTTTGG60AGTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTCGGTTTTTTGCGTTTTCGGAGTGTTTCGTAGCGACGT120CGGGAGTCGACGCGTCGCGCGGGTATTTAGTTATGGTT158人工合成SEQIDNO.4序列，然后以SEQIDNO.4序列為模板，采用常規(guī)PCR技術(shù)，以結(jié)直腸癌細胞基因組甲基化處理后的DNA(SEQIDNO.4序列)為模板，擴增BMP3基因靶序列，PCR反應體系見表1。其中引物序列SEQIDNO.5為：5’-TTATTTCGTTGTATTCGGTCGCG-3’；引物序列SEQIDNO.6為：5’-AACCATAACTAAATACCCGCGCGA-3’，表1PCR反應體系表1中的緩沖液為pH8.0的Tris-HCl緩沖液。擴增結(jié)束后，將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到pGM-T質(zhì)粒載體上，得到連接有目的基因的質(zhì)粒；所述PCR產(chǎn)物的純化體系如表2所示：表2PCR產(chǎn)物純化體系組分體積(μL)PCR產(chǎn)物20SAP酶0.85(1U/μL)ExoI酶0.375(10U/μL)ddH2O3.775總體積25將PCR產(chǎn)物純化體系放置于PCR擴增儀內(nèi)進行反應，反應條件為37℃、20min，73℃、20min。然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙向DNA測序鑒定，目的基因與質(zhì)粒連接成功的重組質(zhì)粒作為陽性標準品，提取質(zhì)粒，紫外分光光度計定量，并將陽性標準品稀釋到103拷貝每微升的濃度，保存于-20℃。將沒有發(fā)生重組的pGM-T質(zhì)粒稀釋到103拷貝每微升的濃度作為陰性標準品。(二)反應液的制備根據(jù)BMP3基因的高甲基化序列SEQIDNO.4，設(shè)計特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2和特異性探針SEQIDNO.3，其中，正向引物SEQIDNO.1為5’-GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC-3’；反向引物SEQIDNO.2為5’-CTCCCGACGTCGCTACG-3’；特異性探針SEQIDNO.3為5’-TTTTTTGCGTTTTCGGAGTGTTTCG-3’，特異性探針上含有熒光報告基團FAM和熒光淬滅基團BHQ，F(xiàn)AM和BHQ分別連接在特異性探針序列SEQIDNO.3的5’和3’端。按照表3所示的配方，制備反應液，備用。表3反應液的配方反應液成分體積(μL)10*buffer2引物SEQIDNO.1(10μM)0.4引物SEQIDNO.2(10μM)0.4特異性探針SEQIDNO.3(10μM)0.4dNTPs(2.5mM)0.8水14總體積18其中，緩沖液(buffer)溶液的配方如下：Tris-HCl100mM、KCl500mM、MgCl225mM，其中Tris-HCl的pH值為8.5。(三)試劑盒的組成將以上制備得到的陽性標準品、陰性標準品、反應液和DNA聚合酶分別裝在不同的ep管中，制備得到本實施例所述的試劑盒，其中，所述反應液中含有用于結(jié)直腸癌檢測的特異性引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2以及特異性探針SEQIDNO.3。陽性標準品管和陰性標準品管的容量均為200μL，分別裝有濃度為103copies/μL的陽性標準品和陰性標準品。反應液管的容積為500μL，管內(nèi)的反應液總體積為380μL。DNA聚合酶管的容積為0.65mL，其裝有TaqDNA聚合酶22μL，其濃度為0.5U/μL。實施例二試劑盒的使用利用實施例一制備得到的試劑盒檢測樣品的BMP3基因甲基化水平。(1)樣本預處理從天津總醫(yī)院獲得臨床結(jié)直腸癌患者或者潛在患者的糞便樣本。將糞便樣本(樣本編號分別為樣本3，樣本4，樣本5，樣本6和樣本7)按照糞便基因組DNA提取試劑盒(購自QIAGEN公司)上的操作說明提取糞便中的結(jié)直腸癌的DNA。然后再用QIAGEN的甲基化處理試劑盒(購自QIAGEN公司)處理上述提取到的基因組DNA，待用。(2)樣本檢測取新的反應管，分別命名為樣品檢測組、陽性對照組和陰性對照組，分別按照表4各實驗組配方配制溶液，用移液槍吹打均勻，然后置于熒光定量PCR儀中進行測定。表4各實驗組配方檢測組樣品檢測組陽性對照組陰性對照組反應液18μL18μL18μL模板DNA1μL——陽性標準品—1μL—陰性標準品——1μLDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL1μL1μL(3)反應程序探針SEQIDNO.3上的熒光報告基團FAM發(fā)出綠色熒光，當探針中的序列無法與待測溶液中的DNA模板配對時，探針保持完整，即同時含有熒光報告基團FAM和熒光淬滅基團BHQ，PCR擴增后無法檢測到熒光；而當探針能夠與待測溶液中的DNA發(fā)生堿基互補配對時，探針被TaqDNA聚合酶降解，探針5’的報告基團與3’的淬滅基團分離，PCR擴增過程中能夠檢測到熒光。探針序列SEQIDNO.3是以BMP3基因高甲基化后的DNA序列為模板設(shè)計的，若PCR擴增過程能檢測到熒光則說明體系中存在BMP3基因高甲基化后的序列，結(jié)直腸癌檢測結(jié)果很可能為陽性；若PCR擴增過程中無法檢測到熒光，則結(jié)直腸檢測結(jié)果可能為陰性；具體的結(jié)直腸癌檢測結(jié)果判斷還需要結(jié)合PCR擴增后的定量分析。打開參數(shù)窗口，設(shè)置程序為：95℃5分鐘，1個循環(huán)；95℃15秒，53℃40秒，58℃40秒，共40個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運行程序。(4)反應結(jié)果判斷采用軟件對熒光定量PCR結(jié)果進行分析，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線參數(shù)的起始值、停止值以及閾值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，起始值可以在1～10、停止值可以在5～20范圍選擇)，使標準曲線窗口下的標準曲線圖達到最佳。在定量分析菜單下分析結(jié)果，根據(jù)標本點在標準曲線的位置確定標本濃度。其中，如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值>＝36，則判斷樣品為陰性或樣品的總含量小于檢測極限。如果增長曲線呈S型曲線且Ct值<36，則樣品的診斷結(jié)果為陽性。當熒光PCR儀程序運行完成后，在軟件中選中陽性標準品和陰性標準品時其熒光曲線圖應為圖1所示。本次實驗的臨床樣本熒光曲線圖如圖2所示。從圖1可以看出，陰性標準品(編號2)為一條CT值為40的水平直線，陽性標準品為CT值小于36的S型曲線。圖1所示結(jié)果同時表明，本發(fā)明的試劑盒工作正常。圖2為臨床樣本的檢測結(jié)果，從圖2的檢測結(jié)果可以看出，樣品編號為5，6和7的樣本，患了結(jié)直腸癌，樣品編號為3和4的樣本為陰性，沒有患結(jié)直腸癌。以上所述僅為本發(fā)明較佳實施例，并不用于局限本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進等，均需要包含在發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>天津脈絡(luò)生物科技有限公司<120>BMP3基因甲基化檢測用試劑體系和試劑盒及其應用<130>OICN160091<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1gtttaattttcggtttcgtcgtc23<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2ctcccgacgtcgctacg17<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ttttttgcgttttcggagtgtttcg25<210>4<211>158<212>DNA<213>人工序列<400>4ttatttcgttgtattcggtcgcgtttcgggtttcgtgcgttttcgttttagttggtttgg60agtttaattttcggtttcgtcgtcggttttttgcgttttcggagtgtttcgtagcgacgt120cgggagtcgacgcgtcgcgcgggtatttagttatggtt158<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ttatttcgttgtattcggtcgcg23<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6aaccataactaaatacccgcgcga24當前第1頁1 2 3