本發(fā)明屬于熒光探針領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)一種基于bodipy熒光染料的增強(qiáng)型的單線態(tài)氧熒光探針的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在生物體系中，單線態(tài)氧（¹o2）是重要的活性氧物種。¹o2具有高的化學(xué)活性和較大的擴(kuò)散半徑，它能穿透線粒體膜或核膜，造成dna的損傷；可與組蛋白作用，組氨酸殘基經(jīng)¹o2氧化作用，產(chǎn)生一種新的光產(chǎn)物。并且，它的多少與細(xì)胞損傷、死亡成正比關(guān)系；可氧化半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、蛋氨酸和酪氨酸殘基，使蛋白質(zhì)喪失功能；可使酶蛋白分子發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，導(dǎo)致構(gòu)型改變而失活或暴露出某些隱蔽的肽鍵而易遭蛋白酶的水解，從而造成人的衰老。上述這些作用將損壞有機(jī)體，包括對(duì)細(xì)胞膜的損傷致變作用、再生的改變等，在生物體系中可能引起許多蛋白質(zhì)光氧化疾病。因此，¹o2一方面具有較強(qiáng)的毒性，造成機(jī)體的損傷，另一方面又是生物體免疫系統(tǒng)的主要?dú)⒕鷦?，還可用于癌癥的光動(dòng)力療法。

由于¹o2反應(yīng)活性高，壽命很短，在水溶液中，壽命約為10^-6-10^-5s，故其分析測(cè)定仍然是一項(xiàng)難題。¹o2采用的分析方法有分光光度法、電子順磁共振法、磷光光度法、色譜法、化學(xué)發(fā)光法等。這些方法或有的容易受到共存離子、溶劑等因素的影響，并且無(wú)法滿足生理?xiàng)l件下檢測(cè)的需要；或有的所用儀器相對(duì)昂貴，操作程序也相對(duì)復(fù)雜等缺點(diǎn)。這些對(duì)了解體內(nèi)¹o2的功能機(jī)制顯著地受到影響。雖然用磷光法能夠直接監(jiān)測(cè)¹o2，但缺乏實(shí)用性，因?yàn)槠浒l(fā)射具有非常低的光致發(fā)光量子產(chǎn)率（plqys≈10^-6）。因此，設(shè)計(jì)具有高的靈敏度和寬的動(dòng)力學(xué)范圍來檢測(cè)生物體中¹o2的探針已成為分析研究的熱點(diǎn)之一。

在各種各樣的探針中，熒光探針由于具有高的靈敏度和低的檢出限，并且在生物成像應(yīng)用方面有很大優(yōu)勢(shì)，是目前公認(rèn)的檢測(cè)¹o2的最佳方法。通過連接熒光團(tuán)與¹o2捕獲基團(tuán)而設(shè)計(jì)的熒光探針已經(jīng)有一些報(bào)道，但其靈敏度不高，有些是需在堿性環(huán)境中，檢測(cè)范圍受到限制。這些報(bào)道的熒光團(tuán)有熒光素、聚芴、菁等，捕獲基團(tuán)有蒽及衍生物、組氨酸等。在¹o2和捕獲基團(tuán)之間發(fā)生[2＋4]環(huán)加成反應(yīng)后，熒光發(fā)生變化。但是這些探針中，以bodipy類染料作為設(shè)計(jì)平臺(tái)的單線態(tài)氧的熒光探針還鮮有報(bào)道。而bodipy類熒光染料具有良好的光化學(xué)物理性能，如摩爾消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，熒光光譜峰寬窄、光熱化學(xué)穩(wěn)定性高、染料光譜性質(zhì)穩(wěn)定、染料分子結(jié)構(gòu)中不含離子電荷、較小的分子質(zhì)量與較低的細(xì)胞毒性等優(yōu)良的性質(zhì)?；诖?，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于bodipy類的熒光增強(qiáng)型的單線態(tài)氧的熒光探針，以實(shí)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下對(duì)¹o2的高選擇性、高靈敏度的識(shí)別及檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單線態(tài)氧熒光探針的制備方法及應(yīng)用，從而快速準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)光動(dòng)力療法中光敏劑產(chǎn)生的¹o2的濃度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種針對(duì)單線態(tài)氧檢測(cè)的熒光探針c1，其結(jié)構(gòu)式為：

所述的c1熒光探針，其設(shè)計(jì)特征在于將分子中蒽與bodipy染料巧妙的合成連起來，利用蒽把bodipy的熒光淬滅，整個(gè)分子幾乎沒有熒光；當(dāng)與單線態(tài)氧作用后，發(fā)生[2＋4]環(huán)加成反應(yīng)后，bodipy的熒光恢復(fù)。熒光從無(wú)到有，從而可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)單線態(tài)氧。

所述的單線態(tài)氧熒光探針的制備方法，其特征在于包括以下兩個(gè)步驟：

第一步：準(zhǔn)確稱取9，10-2甲基-2醛基蒽（1.17g，5.0mmol）溶于干燥的ch2cl2（500ml），在氮?dú)獾臍夥障?，慢慢滴入新?,4-二甲基吡咯（1.1ml，12.5mmol），再加入0.1ml三氟乙酸作為催化劑，反應(yīng)液由澄清逐漸變成血紅色，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)10小時(shí)。

第二步：用針筒注入溶于干燥四氫呋喃的二氯二氰基苯醌（ddq）（1.13g，5.0mmol），繼續(xù)室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)0.5h。再在冰水浴條件下，慢慢加入三乙胺（10.0ml，71.9mmol），加完之后繼續(xù)攪拌15min，再慢慢滴加三氟化硼乙醚（10.0ml，79.6mmol），撤掉冰水浴，室溫下反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后，加入250ml水，用二氯甲烷（3×120ml）萃取，合并二氯甲烷相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干溶劑。粗產(chǎn)物用（二氯甲烷：石油醚=1：5）洗脫純化，得到產(chǎn)物c1為紫紅色固體(23%)。

本發(fā)明提供的探針c1是基于bodipy染料熒光增強(qiáng)型的熒光探針，具有經(jīng)典bodipy的光譜特性，即光穩(wěn)定性好，較高的摩爾消光系數(shù)、較高的熒光量子產(chǎn)率和較低的細(xì)胞毒性等特性，并且吸收和發(fā)射波長(zhǎng)均在可見光區(qū)，適合熒光顯微鏡分析檢測(cè)生物樣品中單線態(tài)氧的定量和定性分析與熒光成像。

本發(fā)明提供的熒光探針可以用于化學(xué)樣品、生物樣品或醫(yī)學(xué)樣品中單線態(tài)氧的定量分析與熒光成像。

本發(fā)明提供的探針，突出的優(yōu)點(diǎn)是：

本發(fā)明提供的熒光探針只有兩步合成，并為一鍋反應(yīng)，合成簡(jiǎn)單，合成條件較溫和；

本探針的設(shè)計(jì)是基于單線態(tài)氧的[2＋4]環(huán)加成反應(yīng)，所以選擇性高，其中羥基自由基（ho·）、超氧陰離子自由基（o2^-·）、雙氧水（h2o2）、次氯酸根（clo^-）、過氧亞硝基（onoo^-）、一氧化氮（no）對(duì)探針響應(yīng)很小，選擇性好；

本探針是熒光增強(qiáng)型的，與未加入單線態(tài)氧的探針溶液，增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到27倍，靈敏度高；

本探針c1-h2o2-clo^-系統(tǒng)在中性環(huán)境中熒光強(qiáng)度與單線態(tài)氧的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；

本探針c1對(duì)單線態(tài)氧可以快速響應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在15分鐘內(nèi)時(shí)，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，之后熒光強(qiáng)度幾乎不變。如此快的響應(yīng)時(shí)間（表明此反應(yīng)的活性大），能應(yīng)用于實(shí)時(shí)檢測(cè)。

本探針結(jié)構(gòu)中由于蒽基團(tuán)的光致電子轉(zhuǎn)移（pet）導(dǎo)致探針本身的熒光被淬滅，當(dāng)與單線態(tài)氧反應(yīng)后，發(fā)生[2＋4]環(huán)加成，蒽的共軛結(jié)構(gòu)被破壞，pet終止，bodipy的熒光迅速恢復(fù)，熒光迅速增強(qiáng)，在365nm的手持熒光燈下肉眼可見，可用于可視化檢測(cè)單線態(tài)氧。

附圖說明

圖1探針c1的合成路線

圖2探針c1(5μm)對(duì)各種活性氧物種的響應(yīng)。1.blank,2.ho·,3.o2^-·,4.h2o2,5.clo^-,6.onoo^-,7.no,8.¹o2.¹o2.:100μmnaocl+0.5mmh2o2;no:100mm1-hydroxy-2-oxo-3-(3-amino-propyl)-3-methyl-1-triazene(noc-13,no供體);h2o2:100mmh2o2;o2^-·:100mmko2；onoo^-:100mm3-morpholinosydnonimine(sin-1,onoo^-供體);clo^-:100mmnaocl;ho·:100mmh2o2+100mm(nh4)2fe(so4)2

圖3探針c1與50mmh2o2在不同濃度的naocl緩沖溶液（tris-hcl,ph=7.4）中的熒光光譜圖。

圖4在525nm處熒光強(qiáng)度與單線態(tài)氧濃度呈線性關(guān)系。

圖5熒光探針c1(5μm)與¹o2（100μm）的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例只是用于詳細(xì)說明本發(fā)明，并不以任何方式限制發(fā)明的范圍。

實(shí)施例探針的合成：

準(zhǔn)確稱取9，10-2甲基-2醛基蒽（1.17g，5.0mmol）溶于干燥的ch2cl2（500ml），在氮?dú)獾臍夥障拢稳胄抡?,4-二甲基吡咯（1.1ml，12.5mmol），再加入0.1ml三氟乙酸作為催化劑，反應(yīng)液由澄清逐漸變成血紅色，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)10小時(shí)。然后用針筒注入溶于干燥四氫呋喃的二氯二氰基苯醌（ddq）（1.13g，5.0mmol），繼續(xù)室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)0.5h。再在冰水浴條件下，慢慢加入三乙胺（10.0ml，71.9mmol），加完之后繼續(xù)攪拌15min，再慢慢滴加三氟化硼乙醚（10.0ml，79.6mmol），撤掉冰水浴，室溫下反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后，加入250ml水，用二氯甲烷（3×120ml）萃取，合并二氯甲烷相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干溶劑。粗產(chǎn)物用（二氯甲烷：石油醚=1：5）洗脫純化，得到產(chǎn)物c1為紫紅色固體(23%)。

光譜測(cè)試：

在試管中加入0.03ml探針c1母液（5×10^-4mol/l），0.27ml乙醇，和2.7mlph值為7.4的tris-hcl緩沖溶液，混合均勻，然后加入0.5mmh2o2在不同濃度的naocl緩沖溶液，反應(yīng)15min后進(jìn)行光譜測(cè)定。激發(fā)光波長(zhǎng)為450nm,激發(fā)光狹縫寬度為5.0nm,發(fā)射峰狹縫寬度為5.0nm。圖3可知，探針c1對(duì)單線態(tài)氧具有較高的靈敏度。并且在2×10^?6mol/l到1×10^?4mol/l濃度范圍內(nèi)，探針在525nm處的熒光強(qiáng)度與¹o2的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖4），線性關(guān)系為f=89.52973+4.25406c，相關(guān)系數(shù)為r=0.997，這表明在較大的濃度范圍內(nèi)可以作定量檢測(cè)。

當(dāng)在熒光探針c1(5μm)中分別加入100mm羥基自由基（ho·）、超氧陰離子自由基（o2^-·）、雙氧水（h2o2）、次氯酸根（clo^-）、過氧亞硝基（onoo^-）、一氧化氮（no），沒有引起明顯的熒光增強(qiáng)，只有當(dāng)加入單線態(tài)氧（¹o2）時(shí)熒光顯著增強(qiáng)（圖2）。

考察了熒光探針c1(5μm)與¹o2（100μm）的反應(yīng)時(shí)間，探針c1與¹o2反應(yīng)大約15分鐘后（圖5），其熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和，說明探針c1在生物樣品實(shí)時(shí)檢測(cè)及熒光成像應(yīng)用方面將會(huì)有較大優(yōu)勢(shì)。