本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及長(zhǎng)非編碼RNA-Linc00673在診斷及制備治療子癇前期藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

子癇前期(PE)是在多基因遺傳背景和環(huán)境因素共同影響下產(chǎn)生的妊娠特有疾病,母胎界面免疫平衡和免疫耐受失調(diào),導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力減退,進(jìn)而胎盤著床過(guò)淺和胎盤供血供氧不足,造成局部氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生大量毒性因子及炎性介質(zhì),使全身多臟器血管內(nèi)皮損傷、血管痙攣,出現(xiàn)多系統(tǒng)受累的臨床表現(xiàn)。目前仍然是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。現(xiàn)唯一的治愈途徑是胎兒和胎盤從母體娩出。由于發(fā)病機(jī)制尚不明確，疾病發(fā)生的分子機(jī)制不明，臨床預(yù)防治療仍缺乏有力有效的措施。隨著基因研究工程的深入，L科學(xué)家對(duì)運(yùn)用基因診斷和分子生物學(xué)在早期診斷子癇前期并靶向治療方面進(jìn)行了很多研究。

近年來(lái)，高通量測(cè)序的基因表達(dá)分析技術(shù)和生物信息學(xué)推動(dòng)了大規(guī)模的人類基因組學(xué)的研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)的一類非蛋白編碼的RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等)調(diào)控基因的表達(dá)水平。大量的研究顯示，異常lncRNAs表達(dá)與多樣的人類疾病相關(guān)。在子癇前期中曾有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR、MEG3、SPRY4-IT1等的異常表達(dá)在該疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了重要的作用。因此，發(fā)現(xiàn)更多與子癇前期相關(guān)的lncRNAs，并對(duì)他們?cè)诩膊≈兴鸬纳飳W(xué)功能進(jìn)行研究，并深入探索其分子機(jī)制，對(duì)將來(lái)早期診斷及治療該疾病提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。Linc00673是一條長(zhǎng)度為2275nt的lncRNA，其位于人類染色體17q25.1。我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常孕婦胎盤組織，子癇前期胎盤組織中的linc00673表達(dá)量顯著上調(diào)。在敲低Linc00673后，研究了Linc00673在子癇前期發(fā)生和發(fā)展中的作用并研究了Linc00673在滋養(yǎng)細(xì)胞中的相關(guān)靶基因的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)目的

本發(fā)明的目的是提供Linc00673在診斷子癇前期及在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用。

一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其核苷酸序列為SEQ NO:1:

一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用；

一種檢測(cè)Linc00673的引物，如SEQ NO:4、5所示；

SEQ NO:4

Linc00673 F TACCACACCCTTTCTTGCCC

SEQ NO:5

Linc00673 R ACACTGGCCTCTTTACACGG

一種干擾Linc00673的siRNA,如SEQ NO:2、3所示；

SEQ NO:2

si-Linc00673 GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA

SEQ NO:3

si-Linc00673 UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU

一種試劑盒，包括所述引物；

一種包括所述長(zhǎng)鏈非編碼RNA的藥物組合物；

所述引物在制備診斷子癇前期試劑中的應(yīng)用；

所述藥物組合物在制備治療子癇前期藥物中的應(yīng)用。

所述藥物組合物，其中還包括輔料。輔料包括：(lip2000,Opti-mem培養(yǎng)液,PBS磷酸緩沖鹽溶液)

技術(shù)方案

通過(guò)qPCR篩查臨床組織中LincRNA 00673的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在子癇前期孕婦胎盤組織中LincRNA 00673的表達(dá)量較正常孕婦胎盤中表達(dá)量高。猜想：LincRNA 00673是否參與了子癇前期疾病的發(fā)病過(guò)程。

選用國(guó)際認(rèn)可的正常滋養(yǎng)細(xì)胞(即HTR-8/SVneo細(xì)胞株)作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，設(shè)計(jì)LincRNA 00673的干擾序列，以lip2000為轉(zhuǎn)染載體將干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后抑制子癇前期疾病疾病的發(fā)生，發(fā)展和預(yù)后過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)在干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞后細(xì)胞的表型功能如增殖，凋亡，遷移和侵襲能力等。從而證明在正常的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中敲低LincRNA 00673的表達(dá)，影響了細(xì)胞的功能，抑制子癇前期疾病的發(fā)病進(jìn)程。

通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)LincRNA 00673的可能參與細(xì)胞功能(如增殖，凋亡或遷移)的相關(guān)下游靶基因，隨后對(duì)LincRNA 00673調(diào)控機(jī)制的初步探討，通過(guò)核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LincRNA 00673更多的存在于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核中，考慮LincRNA 00673可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相應(yīng)的靶基因，通過(guò)RIP和CHIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LincRNA 00673通過(guò)綁定LSD1蛋白抑制下游靶基因JDP2的表達(dá)。

轉(zhuǎn)染過(guò)程所需的各種試劑。

(1)lip2000，一種多用途的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于DNA、RNA和寡核苷酸的轉(zhuǎn)染，對(duì)大多數(shù)真核細(xì)胞具有很高的轉(zhuǎn)染效率。其獨(dú)特的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而將LincRNA 00673干擾序列轉(zhuǎn)進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)。

(2)Opti-mem培養(yǎng)液，含HEPES，2400mg/l碳酸氫鈉，次黃嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸鈉，L-谷氨酰胺，微量元素，生長(zhǎng)因子，以及減量至1.1mg/l的酚紅，作為轉(zhuǎn)染試劑的輔料，其本身對(duì)細(xì)胞無(wú)任何害處，而更好更有效的轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞中，以獲得預(yù)期目的。

(3)PBS磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline)一般作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用。它是生物化學(xué)研究中使用最為廣泛的一種緩沖液，主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它們有二級(jí)解離，緩沖的pH值范圍很廣；而NaCl和KCl主要作用為增加鹽離子濃度。排除其本身對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的影響。

組織收集

我們收集了67對(duì)2014年至2015年在江蘇省人民醫(yī)院，江蘇省婦幼保健院接受剖宮產(chǎn)手術(shù)，診斷患有子癇前期的孕婦胎盤組織和不含有任何基礎(chǔ)疾病的正常孕婦胎盤組織。并記錄臨床的特點(diǎn)：包括孕婦年齡，有無(wú)吸煙史，孕周數(shù)，收縮壓，舒張壓以，蛋白尿以及胎兒體重。組織樣本收集的均為第一時(shí)間液氮或儲(chǔ)存在-80℃,直至RNA提取。該研究經(jīng)過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。獲得所有病人的書面知情同意。

細(xì)胞系

選取滋養(yǎng)細(xì)胞(HTR-8/SVneo)由來(lái)自加拿大女皇大學(xué)提供。HTR-8/SVneo細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的鏈霉素。5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％-90％時(shí)傳代。所有細(xì)胞系被短串聯(lián)重復(fù)序列的DNA分析驗(yàn)證。

RNA提取和定量PCR分析

根據(jù)試劑的使用說(shuō)明，用Trizol試劑分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa Prime Script試劑盒(TaKaRa,大連,中國(guó))。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對(duì)量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ctgene-Ct control。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

Linc00673的干擾序列及亂序?qū)φ?si-NC)均購(gòu)自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。將細(xì)胞HTR-8/SVneo按每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，于轉(zhuǎn)染前6h吸棄原有培養(yǎng)基，換成無(wú)雙抗培養(yǎng)基；取10μL脂質(zhì)體(即lip2000)稀釋于240μL的OPTI-MEM中，溫和吹打混勻室溫下孵育5min；取100pmol siRNA和si-NC分別稀釋于240μL OPTI-MEM中，吹打混勻室溫下孵育5min；將孵育好的脂質(zhì)體與siRNA或質(zhì)粒稀釋液混合，溫和吹打混勻。于室溫下繼續(xù)孵育20min；將上述混合物均勻滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻。37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞提取RNA或蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR或蛋白免疫印跡分析。

細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

MTT實(shí)驗(yàn)，將處理后的細(xì)胞按每孔3000-5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞80％貼壁后，細(xì)胞同步化6h，棄去原有培養(yǎng)基。每個(gè)樣本設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔總反應(yīng)體積為200μl。每孔加入20μl的MTT反應(yīng)液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。棄去上清液，每孔加入150μl二甲亞砜(DMSO)，震蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的吸光度。

EdU實(shí)驗(yàn)，將適量處理后的細(xì)胞中在12孔板中，每孔加入10μM EdU試劑。2h后，用4％多聚甲醛固定30分鐘。清洗，使用Click-iTR Edu試劑盒染色30分鐘，隨后用DAPI染色5分鐘，隨后使用熒光顯微鏡拍攝(奧林巴斯，日本)。最后，使用Image-Pro Plus軟件分析。

流式細(xì)胞術(shù)

凋亡檢測(cè)，用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的HTR-8/SVneo細(xì)胞，隨后根據(jù)FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)及其使用說(shuō)明予以Annexin V-FITC熒光探針和碘化丙錠(PI)染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。

細(xì)胞周期檢測(cè)，根據(jù)說(shuō)明書使用Cycle TESTTM PLUS DNA試劑盒(BD)予以PI染色，隨后用FACScan分析。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

24孔板中放置8μm孔徑大小的Transwell小室。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，用50mg/l BD Matrigel 1:6稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至3x10⁵。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10x10⁴。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。取小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1％結(jié)晶紫將小室外底面的細(xì)胞染色利用倒置顯微鏡對(duì)Transwel小室底膜上下室側(cè)附著的染色的細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)。

亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

根據(jù)使用說(shuō)明書使用PARIS試劑盒(Life Technologies，USA)分離HTR-8/SVneo細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。使用qPCR方法檢測(cè)LincRNA 00673、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。GAPDH為細(xì)胞質(zhì)參照，U1為細(xì)胞核參照。以總RNA百分比呈現(xiàn)Linc00673、GAPDH和U1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)情況。

RNA測(cè)序

將細(xì)胞種植于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％左右后給于10ul的lip2000si-linc00673和si-NC處理，48h后用Trizol處理收集細(xì)胞，送樣，由華大基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)實(shí)施，選用Illumina機(jī)器進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)，得到數(shù)據(jù)并做相應(yīng)的處理。

RNA免疫印跡(RIP)

裂解HTR-8/SVneo細(xì)胞供內(nèi)源性LSD1免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用。將細(xì)胞上清與包被分別識(shí)別LSD1、SNRNP70和對(duì)照IgG的蛋白A/G瓊脂糖磁珠在4℃孵育6個(gè)小時(shí)。隨后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分鐘以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆用SPSS17.0軟件分析，以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異用雙尾Student’s T檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。單因素分析中p<0.05的隨后再使用多因素分析。

附圖說(shuō)明

圖1 lincRNA 00673在子癇前期孕婦胎盤組織(N＝67)中表達(dá)上調(diào)。

1A lincRNA 00673在子癇前期孕婦胎盤組織(N＝67)表達(dá)較正常組織上調(diào)。

圖2 lincRNA 00673對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖能力的影響。

2A MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在敲低lincRNA 00673的表達(dá)后能夠促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力。

2B 克隆形成檢測(cè)敲低lincRNA 00673能夠使HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)。

2C EDU實(shí)驗(yàn)證明，敲低lincRNA 00673后增加HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖(藍(lán)色代表細(xì)胞核，紅色代表處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞)。

圖3 lincRNA 00673對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的影響。

3A 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在敲低lincRNA 00673后較正常組能夠減少細(xì)胞凋亡。

3B Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在敲低lincRNA 00673能夠促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說(shuō)明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來(lái)說(shuō)是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請(qǐng)中提及的細(xì)胞株以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對(duì)本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來(lái)代替。

實(shí)施例1

檢測(cè)lincRNA 00673在胎盤組織中的表達(dá)情況

取0.1g組織，液氮研磨充分(成粉末狀)或1-5×107細(xì)胞棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以無(wú)酶槍頭吹打混勻，靜置5min，將裂解液移入預(yù)先標(biāo)記好的無(wú)酶1.5ml的離心管中。4℃7500g離心5分鐘，取上清加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻30s，靜置2min。4℃，12000g離心，15min。轉(zhuǎn)移水相層至新的1.5ml離心管中。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置5-10min。4℃，12000g離心，10min。吸棄上清，加入1ml 75％的乙醇(現(xiàn)配)，洗滌RNA沉淀。4℃，7500g離心，5min，棄上清。盡量去除75％的酒精，于室溫中晾干，約15min。用無(wú)RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。

實(shí)時(shí)定量PCR

子癇前期孕婦胎盤組織及正常孕婦胎盤組織標(biāo)本，HTR-8/SVneo細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa PrimeScript試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計(jì)引物序列，QPCR應(yīng)用7300PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA樣品采用三部法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)體系：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對(duì)量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量的分析。計(jì)算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

lincRNA 00673的引物如下：

Primer F 5’-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3’，SEQ NO：4，

Primer R 5’-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3’，SEQ NO：5。

我們利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了67對(duì)子癇前期孕婦胎盤組織表達(dá)較正常組織中l(wèi)incRNA 00673的表達(dá)水平，其中選用的lincRNA 00673的引物如下：Primer F 5’-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3’，SEQ NO:4，Primer R 5’-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3’，SEQ NO:5。

結(jié)果表明,與正常孕婦胎盤組織相比，lincRNA 00673在子癇前期孕婦胎盤組織表達(dá)上調(diào)(圖1，P<0.05)。提示lincRNA 00673可能在子癇前期疾病的診斷，發(fā)生發(fā)展及治療中扮演著重要的作用。

Table 1子癇前期孕婦和正常妊娠孕婦的臨床數(shù)據(jù)

實(shí)施例2

為了研究lincRNA 00673對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞功能的影響。

首先，選取正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞系作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，利用lip2000作為轉(zhuǎn)染試劑載體，轉(zhuǎn)染lincRNA 00673干擾序列si-673GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA和si-673UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU以有效的敲低lincRNA 00673的表達(dá)，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),用兩條小干擾RNA在HTR-8/SVneo細(xì)胞中敲低lincRNA 00673表達(dá)后都取得促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，圖中僅列舉一個(gè)結(jié)果(圖2A)。此外,克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明,干擾lincRNA 00673后HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)(圖2B)。此外，EDU染色實(shí)驗(yàn)證明,敲低lincRNA 00673后HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖增強(qiáng)(圖2C)。由此可知，這些數(shù)據(jù)表明,lincRNA 00673可抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力。

實(shí)施例3

lincRNA 00673對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法測(cè)細(xì)胞凋亡：為了研究是否lincRNA 00673對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖影響了細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換,以正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞系作為研究對(duì)象，利用lip2000作為載體，轉(zhuǎn)染lincRNA 00673干擾序列si-673 1#GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA si-673 3#UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU以敲低lincRNA 00673的表達(dá)。

(1)細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中，而貼壁細(xì)胞先用滴管輕輕吹打，凋亡細(xì)胞一經(jīng)吹打可能脫壁，收集到10ml的離心管中，沒脫壁的細(xì)胞用0.02％的EDTA消化使之脫壁，每樣本細(xì)胞數(shù)為(1～5)×10⁶，500～1000r/min離心5min棄去培養(yǎng)液。

2)用孵育緩沖液洗1次，500～1000r/min離心5min。

3)用100μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15min。

4)500～1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次。

5)加入熒光溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。

6)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

如上述方法，將HTR-8/SVneo/si-lincRNA 00673(對(duì)照為HTR-8/SVneo/lnc-NC)細(xì)胞種在6孔板上，3×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染48h后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

結(jié)果測(cè)定：如圖3A所示。

結(jié)果分析：與對(duì)照組HTR-8/SVneo/lnc-NC相比，HTR-8/SVneo/si-lincRNA 00673給予處理均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少，提示降低lincRNA 00673表達(dá)可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。這些數(shù)據(jù)表明,lincRNA 00673可抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖能力。

實(shí)施例4

lincRNA 00673參與HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲

滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移子癇前期發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要方面。我們用transwells研究了lincRNA 00673對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力影響。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染lincRNA00673干擾序列以敲低lincRNA 00673表達(dá)后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo遷移能力,并促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力(圖3B)。這些結(jié)果表明，敲低lincRNA 00673表達(dá)后促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的表型，促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo的遷移和侵襲。

結(jié)論：

近年來(lái)，LncRNAs作為熱點(diǎn)，受到廣泛的關(guān)注與研究，極大推動(dòng)了該領(lǐng)域的飛速發(fā)展。目前，lncRNA研究已顯示出它在人類多種疾病發(fā)病中的重要作用，面對(duì)如此龐大的lncRNAs家族，人們的認(rèn)識(shí)是有限的，已鑒定出其功能的lncRNA并不多。關(guān)于lncRNA與子癇前期相關(guān)聯(lián)的證據(jù)并不多，要想使其成為子癇前期的診斷標(biāo)志物，需要進(jìn)一步確定lncRNA在人群中的表達(dá)水平，以及具有臨床診斷意義的變化程度。在這里，我們首次證實(shí)了lincRNA 00673在子癇前期患者中行使的功能。在滋養(yǎng)細(xì)胞中敲低lincRNA 00673的表達(dá)，表現(xiàn)出滋養(yǎng)細(xì)胞增殖增加，細(xì)胞凋亡減少，血管形成能力增加。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，我們可以利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及動(dòng)物整體等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步來(lái)研究子癇前期發(fā)生發(fā)展過(guò)程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)變化及其作用機(jī)制，為子癇前期早診早治提供新的靶向分子。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省人民醫(yī)院

<120> 一種長(zhǎng)非編碼RNA及在制備診斷子癇前期及靶點(diǎn)藥物治療中的應(yīng)用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2275

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggcgcgca ggcggcgcgg gtgcgcggtg cggcgctggt atccagagga cgcggtcacc 60

gcctctggca tttgtcgttc tgcgcttctc cgcaaggacc ctctgttagg caggcgccca 120

ccgtaagcct cccgggcctt gtgaacctgc aaacccaagt ctgagagacg atccgccttc 180

agcgctttcc agcttggcag agaggctttc ccggcgggga tctttggttg gcgctggcga 240

tgcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgt ccaggctggg tgatgtccca gcacgagtag 300

gcgggatgcg ctcgcttggt cctccgggcg cccggtccct gcccgcgtcg cgcgcccacc 360

cctggggacg agaaggcggc cgcctgagga cccccgcccg cgacctccgc gagtctggag 420

cgcagaggac agggtctggc tgctctttgg ccttggatgg aaagtgggga attgggtggg 480

gggctgcgga ccccttaacg tggattactt ggtgtgtatc agctgggctc agaagaccca 540

cgacctcttc tccatccgtg gattgatttg ttctgcttaa cagctgggtc gccaagctgg 600

aggtattttt ccctctccac cctggtcttc tcctgtaacg tgtggccgcc ttttccagca 660

cggcctcctg ccttcctggt gcactttttg gagaacgtgg tggaatcaga ggtttctggc 720

tgactcggtg ggtgctttga accaggaaag gacaagaaag aggatgggaa ggactgatcc 780

acattcccac caggaagttt agcagaaccc ccgcgtgcca cctggacccc ttggaaggac 840

ctggctcagg ctggaccacc tcttgagagg caggagctct ggatttgatc aagaattctt 900

tgctgagcat ggtgcctcat gcctataatc ccaacacttt gggaggccag tgtgggagga 960

tctcttgagc ccaggagttc aagactagcc tgggcaacac agagagaccc catctctaaa 1020

ataataataa taataaaata aaaaattagc agggcatggt ggcatgtgcc tgtagtccca 1080

gctacccagg aggctgaggc aagaggatgg ctggagcctg ggatgttgag gctgcaatga 1140

actgtgatta ccccactgca ctccagcctg ggcaaaagag cgagagaccc tgtctcaaat 1200

aataataata ataataatct tattttggag aataaagaga cctctggatt tgaggtgcca 1260

tttgggtaga aagaaaagac gtttacaccg agaaatagtc tgtgttgccc tgaaggagca 1320

gagggatgca tcgctggagg tgacctacag ttgaagaaga ctcattatga cagaccttgt 1380

ccttcttcct tgtggaaagt gtttcctctg ctgctactgc tcatgagact cttccccctc 1440

cctgtcccag ggaaccaaag ggctttctac cacacccttt cttgcccccc gcctcccatg 1500

tctgctgtgc ctttgtactc agcaattctt gtttgctcca ttatcttcca gccggataca 1560

gagtgaatag ttaaccacac ttaggtcaaa taggatctaa atttttgttc ctgctccgtg 1620

taaagaggcc agtgtttgtg tgttgcaagc agccttggaa tagtaactct tctcatttgt 1680

ttgggatctg gccaccaagt tccagaatga tacacggatc agtgcagaag ttcatcaggc 1740

tctcggacct tagggctgtt ggagaaggct tcagcagcag aactgatggt gaaggctcgt 1800

gttctccatc ctcaactttc tttgcttcga tcatacacaa gaatacattt ggaagggcaa 1860

aaaatgaaca ctgtcgttca ttgcagccgt gttttgtgac acagatgcac agtctgctgt 1920

gaagaccttc tctcaagtgg catttgggag tccatgccag atcatggtgc ttcatgagag 1980

actgacagct atcaggggtt gtggcactta gtgaggactc tcctccccca gtgtgtgctg 2040

atgacacata cacacctgac aatagcttga gtcttctctg ttccttttac tctgtagcca 2100

acatacacat gatttaaaac cctttctaaa tatctatcat ggttcatcct tgtccaaatg 2160

cagagtcaga gctatttgta cttcattatt atttccaagg cgaatagttg gctttctttt 2220

tgcaaaaata attaaagttt ttgtatgttg cagttgcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2275

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagaaauagu cuguguugcc cugaa 25

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ugugccuuug uacucagcaa uucuu 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taccacaccc tttcttgccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acactggcct ctttacacgg 20