本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可特異結(jié)合cd19蛋白的單克隆抗體umab103、產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞株及應(yīng)用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術(shù)：

b細(xì)胞惡性腫瘤是常見的血液惡性腫瘤，盡管多數(shù)患者對目前的一線治療有反應(yīng)，但復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，仍然是難治的惡性腫瘤之一。cd19主要表達(dá)于b淋巴細(xì)胞及濾泡樹突狀細(xì)胞表面的蛋白，屬于免疫球蛋白(ig)超家族成員，是正常和惡性b淋巴細(xì)胞特異性表面蛋白，在b細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化以及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。因cd19在b淋巴細(xì)胞表達(dá)的特異性和惡性腫瘤表達(dá)的廣泛性，使其成為一個頗具潛力的b淋巴細(xì)胞惡性腫瘤免疫治療的分子靶點。目前臨床上常用免疫組織化學(xué)(ihc)病理實驗檢測腫瘤細(xì)胞中蛋白的表達(dá)狀況，然而ihc實驗的核心為特異性結(jié)合蛋白的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對cd19蛋白的單克隆抗體對ihc檢測cd19表達(dá)水平具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合特異性較高的cd19蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測cd19蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，保藏日期為2016年4月27日，保藏編號為cgmccno.12285。

本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合cd19蛋白的單克隆抗體umab103，由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)cd19orf核苷酸序列(cd19orf核苷酸序列如seqidno.1所示，1671bp；cd19氨基酸序列如seqidno.2所示)

設(shè)計引物pcr擴(kuò)增cd19orf第1bp位到第1668bp位序列，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點sgfi和mlui，插入表達(dá)載體pcmv6-entry，構(gòu)建cd19氨基酸序列第1位到第556位的重組表達(dá)質(zhì)粒pcmv6-rcd19；上游擴(kuò)增引物序列，seqidno.3:cacgcgatcgcatgccacctcctcgcctcctct下游擴(kuò)增引物序列seqidno.4:accgacgcgtcctggtgctccaggtgcc

(2)cd19重組蛋白的表達(dá)與純化：將cd19重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化hek293t細(xì)胞，裂解離心獲得上清，ddk親和層析柱純化，獲得純化的cd19重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的cd19重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗cd19特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為umab103，亞型鑒定為igg1；通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得cd19單克隆抗體umab103。分別通過westernblot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進(jìn)一步采用origene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進(jìn)行驗證：origene高密度蛋白芯片上包含10,000個hek293t細(xì)胞蛋白過表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。

本發(fā)明將所述單克隆抗體umab103與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結(jié)果顯示本發(fā)明所述單克隆抗體umab103特異性結(jié)合cd19蛋白，而與其他蛋白無交叉反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab103在制備用于檢測cd19蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體umab103，可檢測組織細(xì)胞中cd19的表達(dá)狀況。

本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。其中所述腫瘤具體是指腫瘤細(xì)胞的增殖與cd19的表達(dá)密切相關(guān)的腫瘤，包括但不限于b淋巴細(xì)胞惡性腫瘤。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保藏編號為cgmccno.12285)，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體umab103。本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab103在制備用于檢測cd19蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用，含單克隆抗體umab103的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體umab103在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與cd19蛋白特異性結(jié)合，而與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白無交叉反應(yīng)，顯著提高了cd19蛋白免疫檢測的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，真實反映腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞內(nèi)cd19蛋白表達(dá)水平，可應(yīng)用于b淋巴細(xì)胞惡性腫瘤。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株umab103的分類命名為：cd19鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；

保藏單位簡稱：cgmcc；

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2016年4月27日；

保藏編號：cgmccno.12285。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例1克隆位點設(shè)計如圖，其中底紋部分為orf區(qū)；

圖2示實施例2重組cd19蛋白westernblot檢測結(jié)果圖，以anti-ddk檢測重組cd19蛋白在hek293t細(xì)胞中的表達(dá)，其中左側(cè)泳道為轉(zhuǎn)染空載體的hek293t細(xì)胞裂解液為抗原的檢測結(jié)果、右側(cè)泳道為轉(zhuǎn)染pcmv6-rcd19質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液抗原的檢測結(jié)果；

圖3示實施例2重組cd19蛋白sds-page結(jié)果圖，用抗ddk親和層析柱純化重組cd19蛋白，純化后的蛋白通過sds-page膠電脈、考馬斯亮藍(lán)染色；

圖4示實施例3以單克隆抗體umab103識別完整的cd19(fulllengthcd19,cd19-fl)蛋白的westernblot檢測結(jié)果圖。泳道1為轉(zhuǎn)染pcmv6-entry的細(xì)胞裂解液；泳道2為轉(zhuǎn)染pcmv6-cd19-fl的細(xì)胞裂解液；

圖5示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人2免疫組化結(jié)果圖(一抗為cd19單克隆抗體umab103)；

圖6示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人扁桃體免疫組化結(jié)果圖(一抗為cd19單克隆抗體umab103)；

圖7示實施例5origene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖(一抗為cd19單抗umab103，1:100；二抗為dylight649-conjugatedaffinipurefragmentgoat-anti-mouseigg，1:400)。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例1、cd19重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以從美國傲銳東源生物科技有限公司獲得的質(zhì)粒rc202922(含cd19orf1671bp)為模板，設(shè)計兩條引物并分別引入酶切位點sgfi和mlui，克隆入表達(dá)載體pcmv6-entry，建立cd19重組表達(dá)質(zhì)粒。克隆位點設(shè)計如圖1所示。

實施例2、cd19重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞：hek293t細(xì)胞以1:3傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取7.5mldmem(無血清及抗生素)至50ml管中，加入300μlpeimegatran1.0混勻；加入75μgcd19重組表達(dá)質(zhì)粒dna至混勻液中，混勻并靜置30分鐘；分別取515μl至各培養(yǎng)皿中于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24小時后，每皿細(xì)胞添加25μl2m丁酸鈉至終濃度5mm。

2、裂解細(xì)胞：轉(zhuǎn)染48小時后，進(jìn)行細(xì)胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入1mlpbs進(jìn)行漂洗，吸去pbs。加入1ml裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑pi和pmsf。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4℃離心，收集上清。取少量上清采用wb鑒定重組cd19的表達(dá)，結(jié)果圖2。

3、ddk親和層析柱純化：以0.45μm，33mmpvdf膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉(zhuǎn)入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混勻器中，于4℃結(jié)合2小時；取出15ml管，將裂解液倒入bio-rad層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣wb檢測；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用tbst沖洗beads3次，滴盡后用0.1mglycineph3.5洗脫，第一次200μl，滴盡不收集，第二、三次各500μl，第三次250μl，收集至一個1.5ml離心管中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至終濃度為10％，tween-80至終濃度為0.1％。純化后的重組cd19蛋白用sds-page鑒定，見圖3。

由圖2結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染pcmv6-rcd19質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液中wb檢測后在約60-90kd處有明顯的特異條帶，與cd19的實際分子量～90kd基本相符。表明細(xì)胞中重組cd19蛋白特異表達(dá)。

由圖3結(jié)果可見，純化的蛋白在page膠60-90kd處有明顯的特異條帶，與cd19蛋白的實際分子量基本相符。表明已獲得了純度較好的cd19重組蛋白。

實施例3、cd19單克隆抗體的制備與篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的cd19蛋白片段用于對balb/c小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動物免疫：經(jīng)過純化的cd19抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測定血清效價；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時處于對數(shù)生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用cd19純化重組蛋白進(jìn)行elisa測試。標(biāo)記細(xì)胞株號。對陽性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至elisa測定96孔板全板結(jié)果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應(yīng)融合板細(xì)胞株為umab103。

4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射經(jīng)pbs洗滌重懸的單克隆細(xì)胞懸液，細(xì)胞用量為5×10⁶/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進(jìn)行腹水純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株umab103產(chǎn)生的單抗為igg1，采用proteing進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、wb檢測、分裝、凍存在-20℃。其中wb檢測結(jié)果見圖4。

由圖4結(jié)果可見，泳道2在分子量約約60-90kd處有特異的條帶，表明單克隆抗體umab103能特異地westernblot檢測完整的全長cd19蛋白。

實施例4、單克隆抗體umab103為一抗的免疫組化檢測

(1)、實驗方法：

1、取福爾馬林固定的成人淋巴結(jié)組織與人扁桃體組織塊進(jìn)行石蠟包埋，使用finesse組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為6μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(0.01m，ph6.0枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)3min，待高壓鍋溫度降至約90℃時，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入cd19單抗(umab103)，稀釋比：1:150，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加polink-試劑盒2(catlogno.d37-15)試劑1，37℃孵育10-20分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。滴加polink-2試劑盒(catlogno.d37-15)試劑2，37℃孵育10-20分鐘，使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖5-6。

(2)、實驗結(jié)果：

由圖5-6結(jié)果可見，在成人淋巴結(jié)組織與人扁桃體組織中可見到特異性膜染色。結(jié)果與cd19在細(xì)胞內(nèi)的定位及組織表達(dá)特異性一致，表明單克隆抗體umab103可用于免疫組織化學(xué)檢測cd19蛋白的水平。

實施例5、單克隆抗體umab103的特異性檢測

origene高密度蛋白芯片上包含10,000個hek293t細(xì)胞蛋白過表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片進(jìn)行umab103抗體鑒定實驗的實驗方法：

1、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進(jìn)行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗umab103，稀釋比列為1:100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗cd19蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

<211>1671

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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61gaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaag

121gggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaaccc

181ttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggcatcc

241tggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccgggg

301cccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggag

361ctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcc

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<211>556

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

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