本發(fā)明涉及用于組織填充的一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。
背景技術(shù)：
：透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，ha）為一種線性多糖，由β-1,3-葡萄糖乙酰胺（β-1,3-n-acetylglucosamine）和β-1,4-葡萄糖酸（β-1,4-glucuronicacid）以β-1，4糖苷鍵形成的重復(fù)二糖單元，此二糖重復(fù)單元再以β-1,3糖苷鍵重復(fù)連接，形成直鏈高分子聚合物。透明質(zhì)酸能夠吸收相對(duì)自身分子量500倍以上的水分，同時(shí)能影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分化、生長(zhǎng)、血管轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)和自由基清除等。此外，透明質(zhì)酸沒(méi)有種屬性差異，具有極其優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和護(hù)膚品中。目前透明質(zhì)酸鈉已經(jīng)在盆腹腔術(shù)后防粘連、眼科手術(shù)用眼科粘彈劑以及膝關(guān)節(jié)潤(rùn)滑液等方面得到廣泛應(yīng)用。而這些透明質(zhì)酸都是天然未經(jīng)過(guò)修飾的，在體內(nèi)存在時(shí)間較短，經(jīng)過(guò)體內(nèi)自由基或透明質(zhì)酸鈉酶降解，一般為兩周至一個(gè)月左右。然而，部分領(lǐng)域可能需要透明質(zhì)酸鈉凝膠在體內(nèi)的存在周期更長(zhǎng)（如：組織填充需要達(dá)到六個(gè)月以上），未經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸鈉由于降解較快限制了其應(yīng)用。因此，需要將天然的透明質(zhì)酸鈉經(jīng)過(guò)化學(xué)交聯(lián)形成致密的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，限制自由基或透明質(zhì)酸鈉酶對(duì)透明質(zhì)酸鈉的降解能力，進(jìn)而延長(zhǎng)其體內(nèi)存在周期。透明質(zhì)酸鈉的線性分子鏈上含有多個(gè)羥基和多個(gè)羧基，可通過(guò)選擇合適的交聯(lián)劑（如：戊二醛、環(huán)氧醚、碳化二亞胺等）進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)交聯(lián)劑的使用量較少時(shí)，交聯(lián)密度不夠，所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在體內(nèi)的存在周期較短；而當(dāng)交聯(lián)劑的使用量較多時(shí)，雖然形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)十分緊密，延長(zhǎng)了體內(nèi)降解時(shí)間，但所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠質(zhì)地偏硬，溶脹能力較差，降低了其注射性。同時(shí)，透明質(zhì)酸鈉在交聯(lián)完成后，可能殘留部分未反應(yīng)（包括：?jiǎn)味宋存I合和兩端均未鍵合）的交聯(lián)劑被包覆在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，影響其生物相容性，對(duì)人體造成排斥反應(yīng)。目前市面上的產(chǎn)品，基本是將透明質(zhì)酸鈉經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)形成凝膠后，通過(guò)透析、純化等繁瑣步驟來(lái)達(dá)到控制殘留交聯(lián)劑的目的，這樣的工藝方式不僅生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高，而且殘余量的控制也不太理想。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn101502677（申請(qǐng)?zhí)?00810009194.6）公開(kāi)了一種注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。首先，將透明質(zhì)酸鈉與交聯(lián)劑1,4-丁二醇二縮水甘油基醚（bdde）反應(yīng)制備水不溶性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠；然后，將得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠置于去離子水中充分溶脹后過(guò)篩，通過(guò)擴(kuò)散達(dá)到降低殘留交聯(lián)劑的目的；最后，提高溶液的離子強(qiáng)度使凝膠顆粒收縮，收集含水凝膠顆粒，滅菌后得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)品。該方案中，將交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠先溶脹后收縮，整個(gè)生產(chǎn)工藝繁瑣、效率低下、生產(chǎn)成本偏高，同時(shí)難以保證所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠顆粒滲透壓平衡。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn102731801（申請(qǐng)?zhí)?01210245094.x）公開(kāi)了一種外科整形用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。首先，將透明質(zhì)酸鈉干粉分散在由10wt%～20wt%的氫氧化鈉和丙酮組成的混合溶液中，加入交聯(lián)劑反應(yīng)制備水不容許交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉粉末；然后，用丙酮洗滌得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉粉末，控制交聯(lián)劑的殘留量；最后，過(guò)篩分級(jí)后溶脹并滅菌，制備得到外科整形用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。該方案中，由于透明質(zhì)酸鈉干粉在丙酮和氫氧化鈉的混合溶液中不溶，而交聯(lián)劑可溶，形成非均相反應(yīng)系統(tǒng)。交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉干粉接觸面積小，反應(yīng)不夠充分，所制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠偏軟、塑形能力較差、降解快。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn102863631（申請(qǐng)?zhí)?01210372786.0）公開(kāi)了一種外科整形用組織填充劑交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。該專(zhuān)利技術(shù)方案在采用環(huán)氧醚交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)的同時(shí)，引入適量含環(huán)氧基的長(zhǎng)鏈烷烴（長(zhǎng)鏈烷烴的碳原子數(shù)目在6～18），同時(shí)表明：利用長(zhǎng)鏈烷烴的疏水性和疏水締合產(chǎn)生自黏附自聚集功能而形成的團(tuán)簇來(lái)增加抗酶降解的效果。但引入6～18個(gè)碳原子數(shù)的長(zhǎng)鏈烷烴對(duì)人體造成的長(zhǎng)期影響還值得商榷，且單端交聯(lián)并不能形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)而暴露更多的酶解位點(diǎn)，對(duì)體內(nèi)抗酶降解效果提升并不明顯。綜上所述，本發(fā)明提出一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。首先，通過(guò)相轉(zhuǎn)移催化劑增大交聯(lián)反應(yīng)的接觸面積，在堿性條件下充分交聯(lián)制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，然后將得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠置于酸性條件下進(jìn)行第二次交聯(lián)，使包覆在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的殘留交聯(lián)劑進(jìn)行第二次反應(yīng)，檢測(cè)交聯(lián)劑殘留量低于2ppm，即：不需要經(jīng)過(guò)透析、純化等工藝便可注入人體，體外抗酶降解能力優(yōu)異且具有良好的注射性能。因此，本發(fā)明優(yōu)化了現(xiàn)有的制備工藝，提高了其生產(chǎn)效率，具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠及其制備方法，包括以下步驟：①將透明質(zhì)酸鈉干粉均勻分散到氫氧化鈉和丙酮的混合溶液中得到透明質(zhì)酸鈉丙酮堿性溶液，向上述透明質(zhì)酸鈉丙酮堿性溶液中加入交聯(lián)劑和相轉(zhuǎn)移催化劑，攪拌混合均勻15min后，置于30℃～70℃下保溫催化反應(yīng)2h～8h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉a粉；②將交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉a粉轉(zhuǎn)移至ph值為2～5.5的環(huán)境下繼續(xù)反應(yīng)72h后過(guò)濾，得到酸性條件下雙交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉粉末；③將步驟②中得到的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉粉末經(jīng)磷酸鹽緩沖液和純化水洗滌、干燥、收集過(guò)篩粉末過(guò)80mesh不銹鋼鋼篩，加入注射用水并在101kpa～303kpa下充分溶脹，收集溶脹后的凝膠顆粒即為交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)高壓溶脹滅菌后灌裝得到一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。上述步驟①中的相轉(zhuǎn)移催化劑為：芐基三甲基氫氧化銨、四丁基溴化銨和十四烷基三甲基氯化銨中的一種。上述步驟①中的交聯(lián)劑為含有環(huán)氧基團(tuán)的1,4-丁二醇二縮水甘油基醚（bdde）。上述步驟①中的氫氧化鈉與丙酮的體積比為（2:8）～（6:4）。上述步驟①中的透明質(zhì)酸鈉干粉分子量分布在800kda～2200kda之間。上述步驟①中的交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉干粉的質(zhì)量比為（1:10）～（1:1）。上述步驟②中的ph值為2～5.5的環(huán)境為稀鹽酸、醋酸或檸檬酸中的一種，反應(yīng)條件為常溫。本發(fā)明的技術(shù)效果是：通過(guò)相轉(zhuǎn)移催化劑增大交聯(lián)反應(yīng)的接觸面積，在堿性條件下充分交聯(lián)制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，然后將得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠置于酸性條件下進(jìn)行第二次交聯(lián)，使包覆在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的殘留交聯(lián)劑進(jìn)行第二次反應(yīng)，檢測(cè)交聯(lián)劑殘留量低于2ppm，即：不需要經(jīng)過(guò)透析、純化等工藝便可注入人體。本發(fā)明同時(shí)發(fā)現(xiàn)，再經(jīng)過(guò)相轉(zhuǎn)移催化交聯(lián)后，利用透明質(zhì)酸鈉的其他修飾位點(diǎn)進(jìn)行酸性條件下的二次交聯(lián)，使得本發(fā)明的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在體外的抗酶降解能力增加了兩倍以上，延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的保留時(shí)間且效果穩(wěn)定。例外，本發(fā)明制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)高壓溶脹后質(zhì)地柔軟，多次注射試驗(yàn)結(jié)果表明可注射能力優(yōu)異，較為容易通過(guò)30g的一次性無(wú)菌不銹鋼注射針頭。附圖說(shuō)明圖1為多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的1h-nmr譜圖（a）、未經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸鈉凝膠的1h-nmr譜圖（b）、交聯(lián)密度隨bdde含量的變化曲線（c）。圖2為多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的體外抗酶降解能力（xha45、xha67、xha90和xha112分別表示實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5）。圖3為水和pbs溶液中的溶脹性能（xha45、xha67、xha90和xha112分別表示實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5）。圖4為透明質(zhì)酸鈉的分子鏈上的可修飾位點(diǎn)圖。圖5為多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的交聯(lián)示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不僅限于此。實(shí)施例1①將1g透明質(zhì)酸鈉干粉（平均分子量為180w）均勻分散到90ml0.5m的氫氧化鈉和210ml丙酮的混合溶液中得到透明質(zhì)酸鈉丙酮堿性溶液，向上述透明質(zhì)酸鈉丙酮堿性溶液中加入0.22g的1，4-丁二醇二縮水甘油基醚和2.3g的相轉(zhuǎn)移催化劑芐基三甲基氫氧化銨，攪拌混合均勻15min后，置于45℃下保溫催化反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉a粉；其中，透明質(zhì)酸鈉：1，4-丁二醇二縮水甘油基醚：芐基三甲基氫氧化銨的質(zhì)量比為1:0.22:2.3，氫氧化鈉與丙酮的體積比為3：7；②向上述交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉a粉加入30ml0.25m的稀鹽酸，25℃繼續(xù)反應(yīng)72h后過(guò)濾，得到酸性條件下雙交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉粉末。③將步驟②中得到的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉粉末經(jīng)磷酸鹽緩沖液和純化水洗滌至ph值為中性，干燥、收集過(guò)篩粉末過(guò)80mesh不銹鋼鋼篩，加入注射用水并在303kpa下充分溶脹，收集溶脹后的凝膠顆粒即為交聯(lián)的透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)高壓溶脹滅菌后灌裝得到一種多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。實(shí)施例2～實(shí)施例7具體步驟與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于：實(shí)施例1中的步驟①中透明質(zhì)酸鈉：1，4-丁二醇二縮水甘油基醚：芐基三甲基氫氧化銨的質(zhì)量比為1:0.22:2.3，而實(shí)施例2～實(shí)施例6中，透明質(zhì)酸鈉：1，4-丁二醇二縮水甘油基醚：芐基三甲基氫氧化銨的質(zhì)量比按表一所示進(jìn)行添加，獲得在不同相轉(zhuǎn)移催化劑含量及交聯(lián)劑比例下的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。表一實(shí)施例中透明質(zhì)酸鈉、bdde、芐基三甲基氫氧化銨的投料比檢測(cè)實(shí)施例1至實(shí)施例7制得的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的交聯(lián)密度、酶降解率、水和pbs溶液中的溶脹度、可注射性能（一次性使用30g無(wú)菌不銹鋼注射針頭）以及細(xì)胞毒性。具體檢測(cè)方法如下：多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的交聯(lián)密度的檢測(cè)將交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在ph=2、70℃下處理，然后用磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)ph為中性，過(guò)濾后再用d2o溶解，用h-nmr進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)譜圖如說(shuō)明書(shū)附圖1所示，通過(guò)比較o-ch2ch2的峰面積計(jì)算交聯(lián)度。說(shuō)明書(shū)附圖11h-nmr譜圖中，實(shí)施例1經(jīng)化學(xué)交聯(lián)后在化學(xué)位移1.6ppm處相對(duì)于實(shí)施例7新增加一個(gè)峰，表明經(jīng)多次化學(xué)交聯(lián)后，透明質(zhì)酸鈉環(huán)上-ch2oh與環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)形成醚鍵。通過(guò)峰面積對(duì)比得到交聯(lián)密度，繪制交聯(lián)密度隨bdde含量的變化曲線（圖3）,從實(shí)施例1到實(shí)施例5表明：交聯(lián)密度與bdde含量呈正相關(guān)。而相轉(zhuǎn)移催化劑芐基三甲基氫氧化銨的含量在反應(yīng)過(guò)程中并未損失，故對(duì)交聯(lián)密度影響不大。多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠抗體外酶降解能力的檢測(cè)。取0.5g經(jīng)多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，加入2ml濃度為30u/ml的透明質(zhì)酸鈉牛睪丸酶溶液，加入ph值為7的pbs緩沖液3ml，于37℃酶解，酶解時(shí)間為0～13天。酶解完成后用超速離心機(jī)在轉(zhuǎn)速15000rpm下離心10min，取上清液1ml，加入4mlph值為7的pbs緩沖液。采用改良咔唑法（參考bitter.t.amodifiedhyaluronicacidcarbarbozolereaction.1962.4,330～333）測(cè)定葡萄糖醛酸含量，乘以系數(shù)2.07后為酶解透明質(zhì)酸鈉含量，除以交聯(lián)凝膠中透明質(zhì)酸鈉含量即可得到體外抗酶降解率。從說(shuō)明書(shū)附圖4中可以看出，實(shí)施例2體外約1天即降解完全，隨著交聯(lián)劑bdde使用量的增加，實(shí)施例5體外抗酶降解性能可延長(zhǎng)至13天。多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在水和pbs溶液中的溶脹性能研究采用經(jīng)典稱(chēng)量法，精密稱(chēng)取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠1g，在純化水或pbs溶液中溶脹48h平衡后，用濾紙輕輕拭去表面水分后稱(chēng)取溶脹后的凝膠質(zhì)量m1，然后將凝膠在70℃烘箱中烘干稱(chēng)得質(zhì)量m2，多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的溶脹性等于m1/m2×100。說(shuō)明書(shū)附圖5中結(jié)果表明，從實(shí)施例2到實(shí)施例5，隨著交聯(lián)劑含量的增加，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠在純化水和pbs溶液中的溶脹度逐漸減小，且由于pbs溶液中含有一定的離子強(qiáng)度，所以在pbs溶液中的溶脹度相對(duì)于純化水要小。而實(shí)施例7可以與任意比例的水互溶，實(shí)施例6（溶脹率為82）相對(duì)于實(shí)施例3偏高，在同樣的透明質(zhì)酸鈉和交聯(lián)劑使用量下，不加相轉(zhuǎn)移催化劑，交聯(lián)反應(yīng)效率明顯偏小。多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠可注射性能研究將封裝在玻璃預(yù)灌封注射器中的多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠裝上一次性使用30g無(wú)菌不銹鋼注射針和推柄，用手推動(dòng)推桿將凝膠以正常使用方式擠出，用手判斷可注射難以程度。表二多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠可注射性能組別實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7可注射性容易容易容易容易困難容易容易從表二中可以看出，除實(shí)施例5具有一定的推擠難度外，其他實(shí)施例均推擠比較容易，因此，在推擠容易的條件下選擇交聯(lián)度更大的多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，可有效延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存在周期。多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的細(xì)胞毒性研究根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《gb/t16886.5-2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第五部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》，通過(guò)檢測(cè)多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的細(xì)胞增值率進(jìn)行細(xì)胞毒性研究。將多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與質(zhì)量體積濃度為0.2g/mlrpmi1640進(jìn)行混合并浸提72h，經(jīng)0.22μm的聚醚砜濾膜過(guò)濾后，將10w/ml的l929細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種后培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后除去上清液；將對(duì)照組加入rpmi1640培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入50%上述浸提的rpmi1640培養(yǎng)液，將兩組置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)完畢后每孔加入5mg/ml的mtt溶液0.02ml,繼續(xù)培養(yǎng)5h后停止培養(yǎng)；每孔加入0.2ml的dmso溶液后用酶標(biāo)儀測(cè)定630nm下的吸光度，細(xì)胞相對(duì)增值率即為實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值除以對(duì)照組平均吸光度值，然后根據(jù)表三進(jìn)行分級(jí)處理。表三細(xì)胞相對(duì)增值率rcr與細(xì)胞毒性的關(guān)系細(xì)胞相對(duì)增值率rcr細(xì)胞毒性≥100%0級(jí)75%≤rcr≤99%1級(jí)50%≤rcr≤74%2級(jí)25%≤rcr≤49%3級(jí)1%≤rcr≤24%4級(jí)05級(jí)實(shí)施例1～實(shí)施例7的體外細(xì)胞毒性研究結(jié)果如表四所示：表四多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的細(xì)胞毒性研究組別實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7細(xì)胞毒性1級(jí)1級(jí)1級(jí)1級(jí)2級(jí)1級(jí)1級(jí)結(jié)果表明：經(jīng)多相催化雙交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠滿足生物相容性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12