本發(fā)明涉及農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法。
背景技術(shù)：
除蟲菊(Py rethrum cinerariifolium Trev .) 原產(chǎn)歐洲，對(duì)它的研究和利用已有近百年歷史(Casida，1973)，本世紀(jì)初除蟲菊在世界各地廣泛栽培，40 年代起曾在我國(guó)華東、新疆、貴州和云南等省區(qū)引種，近期出現(xiàn)品種退化，直接影響干花的產(chǎn)量和質(zhì)量。在50 年代至70 年代世界除蟲菊干花的主產(chǎn)國(guó)一度受到人工合成殺蟲劑的沖擊，80 年代以來隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，除蟲菊的應(yīng)用研究又重新得到親睞，利用除蟲菊的頭狀花序(簡(jiǎn)稱花頭) 經(jīng)抽提和加工后獲得的除蟲菊酯，因除蟲菊酯對(duì)人體(包括哺乳動(dòng)物) 無毒、無積累，而使得除蟲菊干花再次贏得市場(chǎng)，但近期世界原除蟲菊干花生產(chǎn)國(guó)，因受多種因素干擾產(chǎn)量直線下降(Casida , 1973)，重新尋找新的生產(chǎn)基地已勢(shì)在必行。
除蟲菊一般以種子、扦插繁殖為主，但目前品種分化嚴(yán)重，含量降低，同時(shí)如果植株受根結(jié)線蟲及病毒的侵染，還會(huì)成為帶毒植株，不能使用，綜合上述原因，目前依靠除蟲菊干花抽提和加工獲得的除蟲菊酯的方法已不能滿足生產(chǎn)需要。
除蟲菊酯的提取方法，主要有超臨界萃取、微波萃取，沙氏提取法和超聲波法等。超臨界萃取和微波萃取現(xiàn)已成功廣泛應(yīng)用于工業(yè)除蟲菊酯的提取，如云南紅河森菊生物有限公司利用超臨界 CO2萃取，其產(chǎn)品純度高達(dá) 75%。除蟲菊花在超聲波法萃取過程中，使細(xì)胞內(nèi)部的壓力增大，當(dāng)內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁可承受的能力時(shí)，細(xì)胞壁破裂，于是位于除蟲菊花細(xì)胞內(nèi)的除蟲菊酯Ⅰ、除蟲菊酯Ⅱ、瓜葉菊酯Ⅰ、瓜葉菊酯Ⅱ、茉酮菊酯Ⅰ、茉酮菊酯Ⅱ的有效成分自由流出，進(jìn)入萃取溶劑而被溶解，過濾去殘?jiān)?，即可達(dá)到從除蟲菊花內(nèi)萃取除蟲菊酯的目的。用超聲波協(xié)助萃取技術(shù)應(yīng)用于天然除蟲菊花中提取殺蟲活性成分，具有快速安全、節(jié)省能源、降低勞力消耗、降低溶劑用量的優(yōu)點(diǎn)，因此，開發(fā)一種結(jié)合超聲波萃取技術(shù)快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法是極有必要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法，直接利用除蟲菊花蕾培養(yǎng)出愈傷組織，再從愈傷組織中提取出除蟲菊酯，該方法可快速、高效地獲得除蟲菊酯，且除蟲菊酯的品質(zhì)少受種植環(huán)境和病蟲害的影響。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
一種快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法，包括以下步驟：
（1）選無性系個(gè)體為母株，取其花蕾作外植體，當(dāng)花蕾長(zhǎng)至長(zhǎng)度為0.4~0.8 cm時(shí)，將花蕾用70~80%的乙醇水溶液浸泡20~60s，取出再放入0.1~0.3wt%的消毒水浸泡15min，再用無菌水沖洗3~5次；
（2）在無菌條件下，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ幗臃N于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，先在20~25 ℃暗培養(yǎng)13~16 d，然后在20~28℃下進(jìn)行光照培養(yǎng)13~16d，光照14 ~16h/d，光強(qiáng)2000 ~3000lx；
（3）待愈傷組織長(zhǎng)到花藥重量的50~100倍時(shí)，取出愈傷組織搗碎，加入正己烷作為提取劑，渦旋振蕩40~120s，靜置25~60min，超聲萃取10~30 min，離心，取上清液，加入2~3%的硫酸鈉水溶液，振搖，收集上層有機(jī)相，經(jīng)吸水的干燥劑干燥后，濃縮，濃縮液加入PSA和C18渦旋振蕩，離心，取上清液，獲得除蟲菊酯產(chǎn)品。
進(jìn)一步的，所述步驟（1）中，消毒水為升汞水溶液。
進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS +2,4-D 1.0 mg/ L +BA 1.0 mg/ L+IAA 0.5 mg/ L+NAA0.25 mg/L +蔗糖50 g/L +瓊脂7 g/L，pH值為5.4~5.6。
進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，先在25 ℃暗培養(yǎng)14 d，然后在28℃下進(jìn)行光照培養(yǎng)14d，光照16h/d，光強(qiáng)2000 lx。
進(jìn)一步的，所述步驟（3）中，所述吸水的干燥劑為無水硫酸鈉。
進(jìn)一步的，所述步驟（3）中，所述愈傷組織、PSA和C18的質(zhì)量比為100:2~5:2~5。
以上所述的快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）本發(fā)明以長(zhǎng)度為0.4~0.8 cm的除蟲菊花蕾為原料，取其花藥培養(yǎng)出愈傷組織，使得最終獲得的除蟲菊酯少受除蟲菊生長(zhǎng)過程中種植環(huán)境和病蟲害的影響，且除蟲菊花蕾含有較多地除蟲菊酯這一有效成分，通過其花藥的培養(yǎng)獲得除蟲菊酯，可有效保證除蟲菊酯的產(chǎn)量。
（2）本發(fā)明選用適宜的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件來誘導(dǎo)愈傷組織，使得愈傷組織生長(zhǎng)速度快，加快除蟲菊酯的生產(chǎn)速度。
（3）本發(fā)明以正己烷作為提取劑，通過渦旋振蕩、超聲萃取，快速獲得了目標(biāo)產(chǎn)物除蟲菊酯，與其他工藝相比，本發(fā)明萃取工藝時(shí)間短，避免了其他工藝長(zhǎng)時(shí)間萃取，引起除蟲菊酯殺蟲活性的分解，有利于除蟲菊酯的穩(wěn)定獲取。
（4）本發(fā)明培養(yǎng)速度快，萃取時(shí)間短，可快速、高效地生產(chǎn)除蟲菊酯，獲得的除蟲菊酯純度達(dá)到95%以上，且本方法只需一種溶劑進(jìn)行萃取，萃取溶劑用量少，有利于降低生產(chǎn)成本和保護(hù)環(huán)境。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下實(shí)施例：
一種快速生產(chǎn)除蟲菊酯的方法，包括以下步驟：
（1）選無性系個(gè)體為母株，取其花蕾作外植體，當(dāng)花蕾長(zhǎng)至長(zhǎng)度為0.4~0.8 cm時(shí)，即花藥處于單核中后期時(shí)，將花蕾用75 %的乙醇水溶液浸泡30 s，取出再放入0.1 wt%的升汞水溶液15min，再用無菌水沖洗4次；
（2）在無菌條件下，從花蕾中剝?nèi)?g花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS +2,4-D 1.0 mg/ L +BA 1.0 mg/ L+IAA 0.5 mg/ L+NAA0.25 mg/L +蔗糖50 g/L +瓊脂7 g/L，常規(guī)高壓滅菌，pH值為5.4~5.6，先在25 ℃下暗培養(yǎng)14 d，然后在28 ℃下進(jìn)行光照培養(yǎng)14 d，光照16 h/d，光強(qiáng)2000lx；
（3）待愈傷組織長(zhǎng)到7.5g時(shí)，稱取5 g愈傷組織置于150 ml 具塞三角瓶中，加入30 ml正己烷作為提取劑，渦旋振蕩60s后，靜置30min，超聲萃取15min，5000r/min離心5min，取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至125 ml分液漏斗中，向分液漏斗中加入50 ml 2%硫酸鈉水溶液并振搖200次，收集上層有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 ml，將濃縮液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，加入各PSA和C18各150mg渦旋振蕩1min，5000r/min離心2min，取上清液，獲得除蟲菊酯產(chǎn)品。
上述獲得的除蟲菊酯的檢測(cè)方法：
色譜柱為DB-5MS (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)，檢測(cè)器為電子捕獲檢測(cè)器ECD，柱前壓為50 kPa，載氣為99.999%高純氮?dú)?，流?0 ml/min，進(jìn)樣口和檢測(cè)器的溫度分別為270 ℃和320 ℃，一級(jí)升溫程序：初始溫度210 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至285 ℃，保持285 ℃溫度10 min；進(jìn)樣方式采用恒壓方式，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μl。
經(jīng)檢測(cè)，獲得的除蟲菊酯純度為95%。