本發(fā)明涉及Ho³⁺檢測技術，具體涉及Ho³⁺檢測試劑2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛及其合成方法，以及該檢測試劑用于溶液樣品中和細胞中Ho³⁺的檢測。

背景技術：

鈥離子鹽能促進新陳代謝，但是如果吸入、口服或注射大量的鈥離子鹽，可造成生物體的嚴重損傷。據報道,鈥離子能抑制小鼠的骨髓細胞的增殖,引起氧化應激和抗氧化酶活性降低,導致細胞活性氧化物的異常產生和累積。除此之外,從遺傳毒性來說，鈥離子能誘發(fā)染色體畸變和DNA損傷。彗星試驗表明,鈥離子引起的DNA鏈斷裂的程度具有時間和劑量依賴性,由此可以看出鈥離子充當著染色體毒劑的作用,它被認為是一個潛在的致癌物催化劑。因此，檢測生物體系中鈥離子的濃度具有重要意義。

目前已報道的用于檢測鈥離子的檢測方法有中子活化分析、ICP-MS、ICP-AES、同位素稀釋質譜法等。然而這些檢測方法不能實現在線檢測和無損檢測，而熒光檢測可以實現這一特性，它具有高靈敏度，高選擇性，非損傷性，實時檢測，快速響應，檢測限低等特點?？墒牵瑹晒鈾z測會受到許多因素的影響，比如光轉換，受體濃度和環(huán)境作用，這些都不利于半定量檢測。相反，比率型熒光檢測由于能夠實現雙發(fā)射以及信號分配，克服了這一系列的缺點，更加優(yōu)于熒光檢測。

在本發(fā)明中，設計合成了2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的化合物，通過鈥離子和化合物中羥基和醛基的配位作用前后熒光強度的變化，實現Ho³⁺的檢測。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種Ho³⁺檢測試劑及其合成方法，以及將該檢測試劑用于溶液樣品中和細胞中Ho³⁺的檢測，該檢測試劑檢測過程抗干擾能力強，檢測限低，操作方便。

本發(fā)明提供的一種Ho³⁺檢測試劑，是2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛，英文名：2-butyl-6-hydroxy-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-benzo[de]isoquinoline-5-carbaldehyde，結構式為：

2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的合成方法，步驟為：

1)4-溴-1，8-萘二甲酸酐和正丁胺按照摩爾比1：1完全溶解在乙醇中回流；反應完成后，旋干，干燥，二氯甲烷過柱，得到淺黃色固體N-正丁基-4-溴-1，8-萘二甲酸酐；

2)N-正丁基-4-溴-1，8-萘二甲酸酐和甲醇鈉按摩爾比1：1溶解在甲醇溶液中，并以五水硫酸銅作催化劑回流；反應完成后，旋干，加入鹽酸使之結晶析出，然后二氯甲烷過柱，得到白色固體N-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘二甲酸酐；

3)N-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘二甲酸酐和55％的氫碘酸溶液回流；反應完成后，倒入冰水中攪拌，之后抽濾，水洗，干燥，得到淡黃色固體N-正丁基-4-羥基-1，8-萘二甲酸酐；

4)N-正丁基-4-羥基-1，8-萘二甲酸酐和環(huán)六亞甲基四胺加入到三氟乙酸中，回流反應；反應完成后，倒入三氯甲烷與鹽酸的混合溶液中攪拌過夜；之后三氯甲烷萃取，獲取有機相，旋干，二氯甲烷過柱，得到淺黃色固體，即得到三價鈥離子檢測試劑2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛。

本發(fā)明提供的一種快速檢測Ho³⁺的方法，是基于2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛，在pH為7.4的HEPES緩沖溶液和DMSO混合溶液中定量地檢測Ho³⁺的含量；具體步驟為：

(1)、配制pH＝7.4,濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，配制10mM的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的DMSO溶液；

(2)、將1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和2.5μL 2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的DMSO溶液加入到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣品的加入，512nm的熒光強度逐漸減弱，480nm的熒光強度逐漸增強；

(3)、把1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和2.5μL 2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的DMSO溶液加到另外11個熒光比色皿中，分別再加入體積為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL的鈥離子溶液，在熒光分光光度儀上測定512nm和480nm對應的熒光強度，F為F₄₈₀為1394、1832、2182、2424、2661、3075、3404、3770、4106、4307、4449，F₅₁₂為4130、3970、3897、3812、、3761、3669、3548、3533、3475、3348、3305，以鈥離子濃度為橫坐標，以相應的熒光強度比值I₄₈₀/I₅₁₂為縱坐標繪制圖，得到鈥離子濃度的工作曲線，線性回歸方程為：I₄₈₀/I₅₁₂＝0.00412c+0.3375，c的單位為μM；

(4)、將1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和2.5μL 2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，用微量進樣器吸取Vμl待測樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，將測得的熒光強度代入步驟(3)的線性回歸方程，得到濃度c，待測樣品C_待測樣＝2000μL×c×10^-6/VμL，即可求得Ho³⁺的濃度。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：1、檢測體系成本低廉；2、比率型熒光探針具有抗干擾能力和靈敏度高的優(yōu)勢；3、檢測過程快速，手段簡單，只需要借助熒光分光光度儀即可實現。

附圖說明：

圖1為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的核磁氫譜

圖2為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的核磁碳譜

圖3為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的質譜

圖4為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛與Ho³⁺作用的熒光發(fā)射圖

圖5為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛與各種分析物的熒光柱狀圖

圖6為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛測定Ho³⁺的工作曲線

圖7為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛測定樣品的熒光發(fā)射圖

圖8為實施例1制備的2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛細胞成像圖

具體實施方式：

實施例1

4-溴-1,8-萘二甲酸酐8.31g(30mmol)和正丁胺2.19g(30mmol)完全溶解在60mL乙醇中，回流5h；反應完成后，將溶劑旋干，真空干燥后經硅膠色譜柱分離，洗脫劑為二氯甲烷，得到淺黃色固體N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酸酐8.77g，產率88.0％；

N-正丁基-4-溴-1,8-萘二甲酸酐6.64g(20mmol)和甲醇鈉1.08g(20mmol)溶解到40mL甲醇中，CuSO₄·5H₂O做催化劑，攪拌回流8h，反應完成后，將粗產物溶解到HCl(1mol/L,30mL)中使之結晶析出，抽濾，二氯甲烷過柱，得到白色固體N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酸酐4.93g，產率87.0％；

N-正丁基-4-甲氧基-1,8-萘二甲酸酐4.25g(15mmol)和55％HI溶液140℃回流7h，反應完成后，冷卻至室溫，倒入冰水中攪拌，抽濾，濾餅用蒸餾水洗滌，真空干燥，得到淡黃色固體即為N-正丁基-4-羥基1,8-萘二甲酸酐3.76g，產率93.0％；

N-正丁基-4-羥基1,8-萘二甲酸酐2.69g(10mmol)和環(huán)六四甲基亞胺1.86g(13mmol)加入到20mL攪拌的三氟乙酸中，120℃下回流10h；反應完成好，冷卻至室溫，緩慢倒入50mL三氯甲烷和50mL鹽酸(1mol/L)的混合溶液中攪拌過夜。之后用三氯甲烷萃取，獲取的有機相用無水硫酸鈉干燥，旋干至固體，用乙酸乙酯：石油醚＝1：3過柱，得到淡黃色固體2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛1.66g，產率56.0％。

¹H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ(ppm):10.37(s,1H),8.70(m,2H),8.57(d,J＝7.3Hz,1H),7.87(t,J＝7.8Hz,1H),4.02(t,J＝7.4Hz,2H),1.60(m,2H),1.35(d,J＝14.8,7.5Hz,2H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H)(圖1)；¹³C NMR(DMSO-d6,150MHz):δ(ppm):194.51,165.10,163.69,163.02,134.00,133.21,131.70,130.50,127.43,124.03,122.77,117.59,113.64,30.13,20.27,14.20(圖2)；ESI–MS m/z:[probe-Ho]⁺Calcd.for 757.53,發(fā)現757.83(圖3).

實施例2

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制10mM的試劑溶液；把2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液及2.5μL試劑的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，取鈥離子的溶液，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，加樣并在熒光分光光度儀上檢測，隨著鈥離子的加入，512nm處熒光強度逐漸減弱，480nm處熒光強度逐漸增強。熒光發(fā)射圖見圖4。

實施例3

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制10mM的試劑溶液；在熒光比色皿中，各加入2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和2.5μL的試劑的DMSO溶液，分別加入20倍當量的鈥離子和200倍當量的其它分析物：Cu²⁺,Fe³⁺,Nd³⁺,Er³⁺,Yb³⁺,Eu³⁺,Mn²⁺,Ce³⁺,Pr³⁺,Sn²⁺,Bi³⁺,Pb²⁺,Tb³⁺,Ca²⁺,Cr³⁺和Ho³⁺(從左往右：1-16)，緊接著在加入200倍當量的Ho³⁺，在熒光分光光度儀上檢測，繪制不同分析物對應的在480nm和512nm的熒光強度比值(I₄₈₀/I₅₁₂)柱狀圖，(見圖5)。鈥離子使得試劑的熒光強度比值明顯增強，其它的分析物基本沒有引起試劑熒光強度的比值變化，且在其它離子存在的條件下繼續(xù)加入鈥離子仍然能使熒光強度的比值發(fā)生變化。

經實驗證明，其它分析物不干擾體系對鈥離子的測定。

實施例4

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，并用DMSO配制10mM的試劑溶液，用蒸餾水配制10mM的鈥離子溶液；把1000μL pH 7.4的HEPES緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和2.5μL 2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛的DMSO加到另外11個熒光比色皿中，分別再加入體積為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL的鈥離子溶液，在熒光分光光度儀上測定480nm和512nm對應的熒光強度，F為F₄₈₀為1394、1832、2182、2424、2661、3075、3404、3770、4106、4307、4449，F₅₁₂為4130、3970、3897、3812、3761、3669、3548、3533、3475、3348、3305，以鈥離子濃度為橫坐標，以相應的熒光強度比值I₄₈₀/I₅₁₂為縱坐標繪制圖，得到鈥離子濃度的工作曲線(見圖6)，線性回歸方程為：I₄₈₀/I₅₁₂＝0.00412c+0.3375，c的單位為μM。

實施例5

配制pH＝7.4、濃度為10mM的HEPES緩沖溶液，配制10mM的Ho³⁺水溶液，并用DMSO配制10mM的試劑溶液；把2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和2.5μL試劑的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，取取Ho^3+-的溶液36μL，用微量進樣器加到此比色皿中，同時在熒光光譜儀上測定480nm和512nm對應的熒光強度F為3872、3505，通過實施例4的線性回歸方程，求得c＝186.21×10^-6mol/L，偏差為3.45％，見圖7。

實施例6

用DMSO配制4mM的試劑溶液；將試劑溶液加入A549細胞培養(yǎng)液中，使得其濃度為2μM，與A549細胞在37℃下，反應30min，體系在熒光共聚焦成像儀下顯示黃綠色熒光；將試劑DMSO溶液加入A549細胞培養(yǎng)液中，使得其濃度為2μM，與A549細胞在37℃下，反應30min，再加入外源的Ho³⁺，使其濃度為20μM，在37℃下，反應30min，體系在熒光共聚焦成像儀下顯示藍色熒光；即先進入細胞的試劑與隨后進入細胞的Ho³⁺作用，使其熒光發(fā)生變化。圖8為熒光共聚焦成像儀下與試劑作用后的細胞(顯示黃綠色熒光)以及先與試劑作用再與外源的Ho³⁺作用的細胞(顯示藍色熒光)成像圖。

以上實施例中所述的試劑即為2-丁基-6-羥基-1,3-二氧代-2,3-二氫-1H-苯并[d]異喹啉-5-甲醛。