本發(fā)明屬于植物熊果酸的提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種以金露梅為原料制備高純度熊果酸的方法。
背景技術(shù)：
金露梅又名金老梅藥，藥王茶，金臘梅等，有效成份豐富，種類繁多。具有很好的藥理作用，在開花盛期月直接采集花、葉，去掉老枝，陰干，即可入藥。味微甘，性涼。具有清暑熱，益腦清心，健胃消食，健脾化濕，調(diào)經(jīng)等功能。主治消化不良，浮腫，赤白帶下，乳腺炎等。
熊果酸(Ursolid acid)又名烏索酸，烏蘇酸，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜化合物，純品為白色針狀結(jié)晶，分子式為C30H18O3，不溶于水和石油醚，易溶于二氧六環(huán)、醇和甲醇，可溶于苯、氯仿。熊果酸具降低血脂，血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)它具有抗致癌、抗促癌、誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞分化和抗血管生成作用，極有可能成為低毒高效的新型抗癌藥物。另外，熊果酸具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料。
針對熊果酸的開發(fā)現(xiàn)狀和藥用前景，本發(fā)明將目標(biāo)定位于從金露梅中分離純化熊果酸的工藝技術(shù)研究，為工業(yè)化生產(chǎn)提供較為詳盡的技術(shù)方案和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。因此，尋找流程短、成本低、適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的工藝流程是本研究的重點(diǎn)。新工藝具有產(chǎn)品純度高、工藝收率高和生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，確保了金露梅中熊果酸開發(fā)的高效益和強(qiáng)競爭力，為金露梅的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種從金露梅中制備高純度熊果酸的工業(yè)化方法。本發(fā)明先采用微波逆流提取技術(shù)對金露梅進(jìn)行提取，再利用超濾膜超濾進(jìn)行除雜，然后利用堿化和酸性水溶液沉降的方法對熊果酸進(jìn)行富集，采用弱極性大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，最后采用重結(jié)晶的方法獲得高純度的熊果酸產(chǎn)品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的，它包括以下步驟：
(1)微波逆流提取
將金露梅干葉粉碎，過篩60～80目，加入80-95％乙醇溶液，在400～600W，時間60～120min，6～10倍料液比條件下微波逆流提取，正向進(jìn)料，反向進(jìn)水，物料與水的流動為逆向連續(xù)動態(tài)流動，得到含有熊果酸的提取液；
(2)超濾膜超濾
提取液溫度冷至室溫后，分別用截留分子量4000，6000，10000，20000道爾頓的聚醚砜超濾膜，在操作壓差為0.1MPa時，進(jìn)行超濾，有效地去除去除提取液中的固形物、色素和大分子物質(zhì)；
(3)堿化
超濾后的提取液，以1％NaOH調(diào)溶液的pH分別為10～12，50℃水浴加熱10min，冷卻至室溫后，有紅棕色沉淀析出，過濾，取上清液；
(4)酸性水溶液沉降
上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝2～4，再用1，1.5，2，2倍溶液體積的PH＝2～4的酸性水溶液稀釋，50℃水浴加熱20imn，室溫靜置2h，使熊果酸析出并沉降，過濾，所得沉淀經(jīng)水洗至中性后，減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥得熊果酸粗產(chǎn)品；
(5)樹脂純化
取經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂，采用濕法裝柱，柱溫25℃，將熊果酸粗品配制成濃度3mg/mL樣品上樣，控制它的上樣流速為1.0～3.0BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，樣品溶液經(jīng)過水以4-6BV/h流速洗去水溶性雜質(zhì)，采用梯度洗脫方式，采用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇，以1～3BV/h流速逐步將雜質(zhì)洗脫下來。
(6)重結(jié)晶
由洗脫劑組合洗脫后，將收集的90％乙醇(pH＝11)洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，余液用5％的H2SO4調(diào)節(jié)至pH＝4，析出沉淀過濾后水洗至中性，得白色粉末，用無水乙醇重結(jié)晶三次得白色針狀晶體。
所述步驟(1)中，提取溫度為70～90℃，原料∶提取液＝1∶10～1∶14(m/v)，提取時間為60～120min，連續(xù)提取2次；
所述步驟(4)中，真空冷凍干燥預(yù)凍溫度-30℃，工作壓力20Pa，升華溫度55℃，解析溫度60℃；
所述步驟(5)中，大孔樹脂分別為BS-101、AB-8和X-5；
所述步驟(5)中，水洗洗脫體積為5-7BV，洗脫劑洗脫體積為4-6BV；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
金露梅干葉粉碎至60目，加入80％乙醇溶液，在600W，時間120min，10倍料液比條件下微波逆流提取，正向進(jìn)料，反向進(jìn)水，物料與水的流動為逆向連續(xù)動態(tài)流動，收集提取液；將收集到的提取液冷至室溫，用截留分子量6000道爾頓的聚醚砜超濾膜，在操作壓差為0.1MPa時進(jìn)行超濾；超濾后的提取液，以1％NaOH調(diào)溶液的pH＝10，50℃水浴加熱10min，冷卻至室溫后，過濾，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝2，再用1倍溶液體積的PH＝2的酸性水溶液稀釋，50℃水浴加熱20imn，室溫靜置2h，使熊果酸析出并沉降，過濾，所得沉淀經(jīng)水洗至中性后，減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥得熊果酸粗產(chǎn)品；將熊果酸粗品配制成濃度3mg/mL樣品上樣，采用BS-101型大孔吸附樹脂對其純化，控制它的上樣流速為1BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，樣品溶液經(jīng)過水以4BV/h流速洗去水溶性雜質(zhì)，水洗洗脫體積為5BV，采用梯度洗脫方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以1BV/h流速洗脫逐步將雜質(zhì)洗脫下來，洗脫劑洗脫體積為4BV；由洗脫劑組合洗脫后，將收集的90％乙醇(pH＝11)洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，余液用5％的H2SO4調(diào)節(jié)至pH＝4，析出沉淀過濾后水洗至中性，得白色粉末，用無水乙醇重結(jié)晶三次得白色針狀晶體。
實(shí)施例2
金露梅干葉粉碎至70目，加入85％乙醇溶液，在500W，時間90min，12倍料液比條件下微波逆流提取，正向進(jìn)料，反向進(jìn)水，物料與水的流動為逆向連續(xù)動態(tài)流動，收集提取液；將收集到的提取液冷至室溫，用截留分子量10000道爾頓的聚醚砜超濾膜，在操作壓差為0.1MPa時進(jìn)行超濾；超濾后的提取液，以1％NaOH調(diào)溶液的pH＝11，50℃水浴加熱10min，冷卻至室溫后，過濾，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝3，再用1.5倍溶液體積的PH＝3的酸性水溶液稀釋，50℃水浴加熱20imn，室溫靜置2h，使熊果酸析出并沉降，過濾，所得沉淀經(jīng)水洗至中性后，減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥得熊果酸粗產(chǎn)品；將熊果酸粗品配制成濃度3mg/mL樣品上樣，采用AB-8型大孔吸附樹脂對其純化，控制它的上樣流速為2BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，樣品溶液經(jīng)過水以5BV/h流速洗去水溶性雜質(zhì)，水洗洗脫體積為6BV，采用梯度洗脫方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以2BV/h流速洗脫逐步將雜質(zhì)洗脫下來，洗脫劑洗脫體積為5BV；由洗脫劑組合洗脫后，將收集的90％乙醇(pH＝11)洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，余液用5％的H2SO4調(diào)節(jié)至pH＝4，析出沉淀過濾后水洗至中性，得白色粉末，用無水乙醇重結(jié)晶三次得白色針狀晶體。
實(shí)施例3
金露梅干葉粉碎至80目，加入90％乙醇溶液，在400W，時間60min，14倍料液比條件下微波逆流提取，正向進(jìn)料，反向進(jìn)水，物料與水的流動為逆向連續(xù)動態(tài)流動，收集提取液；將收集到的提取液冷至室溫，用截留分子量20000道爾頓的聚醚砜超濾膜，在操作壓差為0.1MPa時進(jìn)行超濾；超濾后的提取液，以1％NaOH調(diào)溶液的pH＝12，50℃水浴加熱10min，冷卻至室溫后，過濾，取上清液；上清液采用4％H2SO4酸化至pH＝4，再用2倍溶液體積的PH＝4的酸性水溶液稀釋，50℃水浴加熱20imn，室溫靜置2h，使熊果酸析出并沉降，過濾，所得沉淀經(jīng)水洗至中性后，減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥得熊果酸粗產(chǎn)品；將熊果酸粗品配制成濃度3mg/mL樣品上樣，采用X-5型大孔吸附樹脂對其純化，控制它的上樣流速為3BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附，樣品溶液經(jīng)過水以6BV/h流速洗去水溶性雜質(zhì)，水洗洗脫體積為7BV，采用梯度洗脫方式，以20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、90％乙醇以3BV/h流速洗脫逐步將雜質(zhì)洗脫下來，洗脫劑洗脫體積為6BV；由洗脫劑組合洗脫后，將收集的90％乙醇(pH＝11)洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，余液用5％的H2SO4調(diào)節(jié)至pH＝4，析出沉淀過濾后水洗至中性，得白色粉末，用無水乙醇重結(jié)晶三次得白色針狀晶體。