本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株來(lái)源于蠶沙的菌株Bacillus altitudinis SEM-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

土傳病害是以土壤為媒介進(jìn)行傳播的植物病害的統(tǒng)稱，是指生活在土壤當(dāng)中的病原體在條件適宜時(shí)從根部或莖部侵害作物而引起的病害，常見(jiàn)的土產(chǎn)病害有：辣椒、茄子、黃瓜根腐病、立枯病、猝倒病、疫病、黃枯病，番茄、辣椒的青枯病，棉花的立枯病、線蟲(chóng)病等、紅萎病、黃萎病，小麥全蝕病，大白菜軟腐病，油菜和萵苣的菌核病等。

土傳病害主要危害作物的根部和莖部。作物生長(zhǎng)前期一旦發(fā)生病害，幼苗根腐爛或者莖腐爛，幼苗很快就會(huì)死亡；作物生長(zhǎng)后期發(fā)生病害，造成的減產(chǎn)根據(jù)嚴(yán)重程度不同可達(dá)20％-60％，甚至絕收。土傳病害發(fā)生后，比較難防治，病菌藏在土壤中越冬，很難被殺死，來(lái)年繼續(xù)侵害作物，如此循環(huán)，病害越來(lái)越嚴(yán)重。

土傳病害的防控途徑主要有作物輪作、抗病品種、藥物防治及生物防治等。作物輪作能夠一定程度控制多種土傳病害，但由于大部分病原菌在土壤中能生存很長(zhǎng)一段時(shí)間，一旦病害發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致輪作的有效性受到限制；抗病品種針對(duì)性強(qiáng)，整體防效不高；而且長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)破壞生態(tài)平衡，造成次要病害猖獗、藥劑殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題。

生物防治主要是通過(guò)拮抗微生物土壤定殖，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及生存空間、分泌抑菌物質(zhì)及蛋白酶、激發(fā)植物體的抗性免疫機(jī)制、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、強(qiáng)化抗逆性等綜合作用形成對(duì)土傳病害的預(yù)防與防治效果。近年來(lái)人們對(duì)于食物安全的重視和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng),對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提出了更高的要求，生物防治因其低成本、高效率、環(huán)境友好和無(wú)藥物殘留等特點(diǎn)已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外植物病害防治的研究熱點(diǎn)。

蠶沙是養(yǎng)蠶生產(chǎn)中的主要有機(jī)廢棄物，不但含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的微生物菌群，例如固氮、解磷和解鉀及其病原拮抗的微生物菌群。因此如何分離篩選并有效利用其中的微生物資源，成為本研究的關(guān)注重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一株來(lái)源于蠶沙的菌株Bacillus altitudinis SEM-1。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1在制備土壤微生物菌劑或生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株來(lái)源于蠶沙的菌株Bacillus altitudinis(高地芽孢桿菌)SEM-1，已于2016年5月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC NO.60038。

上述的高地芽孢桿菌是從蠶沙中分離純化后得到，其性狀如下：

菌落形態(tài)：本發(fā)明的高地芽孢桿菌懸液經(jīng)涂板與NA培養(yǎng)基后，30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，觀察其菌落形態(tài)特征，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，本發(fā)明的芽孢桿菌菌落乳白色，圓形，表面光滑，半透明，邊緣整齊。

將本發(fā)明的高地芽孢桿菌按1％比例接種于NB培養(yǎng)基，30℃搖床中培養(yǎng)18h后，取懸液，點(diǎn)樣到載玻片、烤片，經(jīng)革蘭氏染色，油鏡觀察菌株的形態(tài)特征，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，本發(fā)明的高地芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢中生，為橢圓形，菌體為桿狀。

本發(fā)明芽孢桿菌的16srDNA鑒定：菌株懸液為模板，16srDNA通用引物27F/1492R，PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物純化后送樣測(cè)序。

本發(fā)明高地芽孢桿菌SEM-1的16srDNA的部分可變區(qū)序列測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI/blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與高地芽孢桿菌株HN-8同源性最高，達(dá)99％以上，為高地芽孢桿菌。

上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1在制備土壤微生物菌劑或生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。

上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1用于制備高地芽孢桿菌原粉，包括如下制備步驟：

(1)活化菌種

活化高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株，從斜面中挑取菌落并在NA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)條件32℃，待SEM-1在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)18-24h后，挑取單菌落，用于一級(jí)種子液的制備；

(2)一級(jí)種子液的制備

選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級(jí)種子搖瓶中，搖瓶體積為250mL，一級(jí)種子NB液態(tài)培養(yǎng)基(121℃下，滅菌20min)的裝液量100ml，將一級(jí)種子搖瓶在32℃、200r/min下培養(yǎng)12-14h，得到一級(jí)種子液；

(3)二級(jí)種子液的制備

種子罐中的培養(yǎng)基仍為NB液體培養(yǎng)基，121℃下，滅菌20min，將一級(jí)種子液接入種子罐中，接種量為0.5～1％(V/V)；培養(yǎng)條件為：通氣比1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為250～400r/min，培養(yǎng)溫度32℃，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)得到二級(jí)種子液，其活菌含量為1～3×10⁷cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此時(shí)菌種活力強(qiáng)；

(4)高地芽孢桿菌SEM-1的菌液發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，CaCO₃ 0.3-0.6％，K₂HPO₄ 0.02-0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.015-0.025％，MnSO₄·H₂O 0.015-0.025％，(NH₄)₂SO₄ 0.05-0.15％；pH6.5-7.5，121℃滅菌30min；

將高地芽孢桿菌SEM-1的二級(jí)種子液，按照接種量為0.5～1％(V/V)接入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為：接種量為0.5-1％(V/V)，培養(yǎng)條件為：通氣比1:(1-1.5)，攪拌轉(zhuǎn)速為200-400r/min，培養(yǎng)溫度32℃，罐壓0.05MPa，保持5％以上的溶氧條件，培養(yǎng)時(shí)間為48h左右；下罐時(shí)間以取樣鏡檢芽孢90％以上釋放為準(zhǔn)，成熟發(fā)酵液中高地芽孢桿菌SEM-1活芽孢含量為50～80×10⁸cfu/mL，得到發(fā)酵成熟菌劑；

(5)高地芽孢桿菌原粉的制備

步驟(4)所得的發(fā)酵成熟菌劑(活芽孢含量為50～80×10⁸cfu/mL)經(jīng)碟片離心機(jī)或微濾設(shè)備濃縮后，加入輕質(zhì)碳酸鈣，濃縮成熟發(fā)酵菌劑與輕質(zhì)碳酸鈣的重量比為100:3，得到液固混合物，將該液固混合物攪拌30min后，利用輸料泵將液固混合物送入離心式噴霧塔中干燥，得到高地芽孢桿菌SEM-1原粉。

本發(fā)明的高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明的高地芽孢桿菌SEM-1菌株來(lái)源于蠶沙，為蠶沙堆肥過(guò)程中的自生菌，與蠶沙有機(jī)肥的配合性好；

(2)本發(fā)明的高地芽孢桿菌SEM-1菌株耐高溫性好，在60度高溫下培養(yǎng)和運(yùn)輸均可以存活，在土壤微生物菌劑制備方面具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)；

(3)本發(fā)明的高地芽孢桿菌SEM-1菌株耐鹽堿性好，可以在10％的NaCl濃度及PH5-10的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，在鹽堿地改良方面具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)；

(4)本發(fā)明的高地芽孢桿菌SEM-1菌株可以高效抑制鐮刀菌(Fusarium)、青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)等土壤中作物有害病原微生物的生長(zhǎng)，起到防治作物病害和提高作物抗病蟲(chóng)害能力的作用，從而提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)；

(5)本發(fā)明的高地芽孢桿菌SEM-1菌株可以高效分解土壤中礦物質(zhì)鉀，制備成土壤微生物菌劑或添加到蠶沙有機(jī)肥后，具有顯著的解鉀效果，提高土壤肥力，該菌株可用于制備單一微生物菌劑、復(fù)合微生物菌劑、生物有機(jī)肥等。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1的菌落形態(tài)特征圖；

圖2為本發(fā)明高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1的菌株形態(tài)特征圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所得高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1對(duì)四種鐮刀菌的拮抗實(shí)驗(yàn)效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株的分離及鑒定

(1)樣品稀釋：從發(fā)酵腐熟的蠶沙堆肥中取樣，稱取5g溶解到裝有45ml無(wú)菌水的三角瓶中，150rp振蕩器振蕩成均勻的10^-1稀釋液，然后用1ml移液槍吸取該稀釋液1ml至裝有9ml無(wú)菌水的試管中，充分搖勻，即制成10^-2的樣品稀釋液，并依次稀釋至10^-6；

(2)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：

解鉀篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，NH₄NO₃3.0g，NaH₂PO₄1.0g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，鉀長(zhǎng)石1.5g，蒸餾水1000ml，瓊脂20.0g，pH 7.0～7.4，滅菌20min；

馬鈴薯土豆培養(yǎng)基：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水1000毫升、pH 6.8～7.2；

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，PH7.0；121℃滅菌20min，于45℃-55℃傾倒至無(wú)菌的培養(yǎng)皿；

(3)菌種分離、純化與篩選：分別吸取不同稀釋倍數(shù)的稀釋液0.1ml，均勻涂布于冷卻好的解鉀培養(yǎng)基，放置30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5天，觀察并挑選長(zhǎng)勢(shì)良好、解鉀圈顯著的菌落于NA培養(yǎng)基培養(yǎng)；將所挑選出菌于NA培養(yǎng)基多次繼代培養(yǎng)后，通過(guò)平板對(duì)峙法，檢測(cè)與鐮刀菌、青枯菌的拮抗效果，取拮抗效果顯著的一個(gè)菌株，并命名菌株SEM-1；

(5)菌株的鑒定

A、形態(tài)鑒定：高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株的菌落形態(tài)為乳白色，圓形，表面光滑，半不透明，邊緣整齊。革蘭氏染色結(jié)果表明高地芽孢桿菌SEM-1為革蘭氏陽(yáng)性菌，芽飽橢圓形、中生，菌體為桿狀。

B、分子生物學(xué)鑒定：SEM-1的16S rDNA系列分析，具體序列見(jiàn)序列表。

(6)菌株SEM-1鑒定結(jié)論

根據(jù)菌株SEM-1的形態(tài)學(xué)及16rDNA基因系列分析，鑒定SEM-1為高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)，已于2016年5月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC NO.60038。保藏地址：中國(guó)廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，郵政編碼為510075。

本實(shí)施例所得高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1解鉀效果測(cè)定：

采用原子吸收分光光度法在766nm測(cè)定發(fā)酵液上清中有效鉀含量。與對(duì)照菌(解鉀菌，購(gòu)自廣州微元生物技術(shù)有限公司)相比，本發(fā)明的高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1解鉀效果顯著高于解鉀對(duì)照菌。

本實(shí)施例所得高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1拮抗鐮刀菌效果測(cè)定：

采用平板對(duì)峙法，在平板中央分別接種6種鐮刀菌(禾谷鐮刀菌，F(xiàn)usarium sambucinum；雙孢鐮刀菌，F(xiàn)usarium catenulatum；尖孢鐮刀菌，F(xiàn)usarium oxysporum；層出鐮刀菌，F(xiàn)usarium proliferatum；腐皮鐮刀菌，F(xiàn)usarium equiseti；腐皮鐮刀菌，F(xiàn)usarium equiseti)，在距其約1-1.5cm處放置濾紙片(去除表面活性劑，肥皂水浸泡，沖洗干凈，烘干，滅菌)，點(diǎn)5-6ul高地芽孢桿菌SEM-1的發(fā)酵液，待完全吸收后，倒置培養(yǎng)2-3天，觀察，結(jié)果表明：高地芽孢桿菌SEM-1對(duì)所測(cè)六種鐮刀菌(Fusarium)有非常顯著的拮抗效果。圖3列出了SEM-1對(duì)其中四種鐮刀菌的拮抗實(shí)驗(yàn)效果圖。

實(shí)施例2

高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌劑原粉的制備

(1)活化菌種

活化高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株,從斜面中挑取菌落并在NA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)條件32℃，待SEM-1在NA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)18-24h后，挑取單菌落，用于一級(jí)種子液的制備；

(2)一級(jí)種子液的制備

選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級(jí)種子搖瓶中，搖瓶體積為250mL，一級(jí)種子NB液態(tài)培養(yǎng)基(121℃下，滅菌20min)的裝液量100ml，將一級(jí)種子搖瓶在32℃、200r/min下培養(yǎng)12h，得到一級(jí)種子液；

(3)二級(jí)種子液的制備

種子罐中的培養(yǎng)基仍為NB液體培養(yǎng)基，121℃下，滅菌20min，將一級(jí)種子液接入種子罐中，接種量為0.5～1％(V/V)；培養(yǎng)條件為：通氣比1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為250～400r/min，培養(yǎng)溫度32℃，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)得到二級(jí)種子液，其活菌含量為1～3×10⁷cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此時(shí)菌種活力強(qiáng)；

(4)高地芽孢桿菌SEM-1的菌液發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，CaCO₃ 0.3-0.6％，K₂HPO₄ 0.02-0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.015-0.025％，MnSO₄·H₂O 0.015-0.025％，(NH₄)₂SO₄ 0.05-0.15％；pH6.5-7.5，121℃滅菌30min；

將高地芽孢桿菌SEM-1的二級(jí)種子液，按照接種量為0.5～1％(V/V)接入發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件為：接種量為0.5-1％(V/V)，培養(yǎng)條件為：通氣比1:(1-1.5)，攪拌轉(zhuǎn)速為200-400r/min，培養(yǎng)溫度32℃，罐壓0.05MPa，保持5％以上的溶氧條件，培養(yǎng)時(shí)間為48h左右；下罐時(shí)間以取樣鏡檢芽孢90％以上釋放為準(zhǔn)，成熟發(fā)酵液中高地芽孢桿菌SEM-1活芽孢含量為50～80×10⁸cfu/mL，得到發(fā)酵成熟菌劑；

(5)高地芽孢桿菌原粉的制備

步驟(4)所得的發(fā)酵成熟菌劑(活芽孢含量為50～80×10⁸cfu/mL)經(jīng)碟片離心機(jī)或微濾設(shè)備濃縮后，加入輕質(zhì)碳酸鈣，濃縮成熟發(fā)酵菌劑與輕質(zhì)碳酸鈣的重量比為100:3，得到液固混合物，將該液固混合物攪拌30min后，利用輸料泵將液固混合物送入離心式噴霧塔中干燥，得到高地芽孢桿菌SEM-1原粉。

所得高地芽孢桿菌SEM-1原粉中活菌濃度為5～8億/克干粉。

實(shí)施例3

一種添加高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)SEM-1蠶沙微生物菌肥的制備。

該生物有機(jī)肥由蠶沙或堆肥腐熟化處理后的蠶沙、高地芽孢桿菌SEM-1菌劑和貝殼粉混合制備而成。

參照實(shí)施例2的方法得到高地芽孢桿菌SEM-1的干粉，其中活菌濃度在5-8億/克干粉，制備成微生物菌劑。將菌劑按比例與堆肥腐熟后的蠶沙和貝殼粉混勻，獲得蠶沙微生物菌肥。所述蠶沙或堆肥腐熟化處理后的蠶沙、微生物菌劑和貝殼粉的質(zhì)量百分含量分別為70％～90％、1％～10％和10％～30％。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。