本發(fā)明屬于微生物保藏
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說，涉及一種高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑保護(hù)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，我國針對一些地區(qū)水環(huán)境質(zhì)量差、環(huán)境隱患多等問題頒布實施了《水污染防治行動計劃》，狠抓工業(yè)污染防治是其中重要的一環(huán)。有機(jī)工業(yè)廢水是較為典型的工業(yè)廢水類型之一，其廢水特征主要包括高有機(jī)污染物、高鹽度、難生物降解，這導(dǎo)致常規(guī)生物處理方法難以對其實現(xiàn)高效處理。針對這一問題，有研究表明通過向工業(yè)廢水生物處理系統(tǒng)中投加從自然界中篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因組合技術(shù)產(chǎn)生的高效菌種，可有效改善生物處理系統(tǒng)的處理效果，因此對有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑的研發(fā)日益增多(如中國專利申請?zhí)?01510719262.8，申請日為2015年10月28日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為：一株青霉素鈉降解菌PC-2及其應(yīng)用，其提供一株青霉素鈉降解菌，可用于青霉素生產(chǎn)廢水的處理)。由于微生物菌劑是活菌制劑，因此菌劑中菌種會出現(xiàn)失活或者衰亡的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其生產(chǎn)使用及銷售運輸，制約了其在工業(yè)廢水處理方面的應(yīng)用。目前，活菌的保藏方法多為真空冷凍干燥法(如中國專利申請?zhí)?01410051136.5，申請日為2014年02月14日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為：一種食品工業(yè)喜鹽菌種的低鹽亞低溫冷藏方法，其提供了一種工業(yè)喜鹽菌種的冷凍干燥保藏方法，其將喜鹽菌種和含有2％的NaCl(即100mL液體中含有NaCl的量為2g)的保藏液放入安瓿瓶中混合均勻，然后置于-60℃冷凍1d，使保存液充分冷凍凝固，再將冷凍后的含菌種的安瓿瓶放入低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)抽真空，待安瓿瓶內(nèi)的保藏液完全干燥，在強火焰下迅速封口，置于8℃條件下保存。中國專利申請?zhí)?00810190852.6，申請日為2008年12月31日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為：一種菌種保藏方法，其提供了一種根霉菌絲的冷凍干燥保藏方法，包括以下步驟：(1)將需要保藏的菌種接種到滅過菌的麩皮培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基配方為50-60％麩皮、35-45％粉碎后的谷殼、1-2％硝酸鈉、1-2％尿素、1-2％米粉、0.2-1％生物素營養(yǎng)添加劑，加入上述混合物相同重量的去離子水，混合均勻即可；(2)當(dāng)菌絲長到需要的菌齡時，不需分離出菌絲制成菌懸液，直接將凍干液立即加入安瓿管中與培養(yǎng)物混合均勻；凍干液配方為10-20克脫脂牛奶、0.2-0.5克瓊脂粉、0.2-0.5克還原型谷胱甘肽、0.1-0.5克阿拉伯膠、0.5-1克叔丁醇，用去離子水定容到100毫升；(3)然后以2℃/分鐘的降溫速率降溫，冷凍干燥；(4)凍干后對盛菌的安瓿管抽真空，然后封口；以及(5)將所得到的管置入低溫下保藏。)，通過這些方法雖然可長時間保藏微生物菌劑，但是方法相對繁瑣，對設(shè)備及技術(shù)要求相對較高，且成本相對偏高。常見的保藏方法還有石蠟油低溫保藏法、甘油管冷凍保藏法、液氮超低溫保藏法等，但仍然是以低溫(冷凍)的方式保藏，微生物菌劑使用過程中需要較長時間的復(fù)蘇期。此外，也有一些微生物菌劑常溫保藏方法，通常都是將微生物菌劑直接裝瓶，或者簡單的通過礦油封面進(jìn)行保藏，這些方法保藏雖然操作方便、成本低廉，但其保藏有效期短，易染菌且性能退化迅速。微生物菌劑的保藏方法直接影響著了其成本和效果，成為推廣應(yīng)用的技術(shù)瓶頸，因此提供一種高效經(jīng)濟(jì)可行的長效保藏技術(shù)與方法顯得尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：1.要解決的問題針對現(xiàn)有的微生物菌劑保藏方法存在方法繁瑣、要求低溫或保藏有效期短、易染菌且性能退化迅速的問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑保護(hù)劑，其由抗氧化劑、緩沖劑、營養(yǎng)劑和抑制劑組成，使得微生物菌劑可以在常溫下進(jìn)行保藏，且保藏的微生物菌劑不易染菌，性能穩(wěn)定。2.技術(shù)方案為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑保護(hù)劑，其由抗氧化劑、緩沖劑、營養(yǎng)劑和抑制劑組成。更進(jìn)一步地，所述的抗氧化劑成分為抗壞血酸和檸檬酸，其中抗壞血酸在保護(hù)劑中的添加濃度為0.003％～0.03％，檸檬酸在保護(hù)劑中的添加濃度為0.005％～0.1％。更進(jìn)一步地，所述的緩沖劑成分為磷酸鹽緩沖液與甘油，其體積配比為(1～4):1，其中磷酸鹽緩沖液濃度為0.05mol/L。更進(jìn)一步地，所述的營養(yǎng)劑成分為有機(jī)工業(yè)廢水特征污染物與復(fù)合營養(yǎng)液，其中特征污染物在保護(hù)劑中的添加濃度為0.02％～0.2％，復(fù)合營養(yǎng)液在保護(hù)劑中的添加濃度為0.1％～0.6％。更進(jìn)一步地，所述的高鹽有機(jī)工業(yè)廢水為鹽度高于1％、COD濃度高于2000mg/L的工業(yè)廢水。更進(jìn)一步地，所述的復(fù)合營養(yǎng)液的組成成分及各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：0.8～3‰氯化鐵、0.08～0.3‰硼酸、0.01～0.03‰硫酸銅、0.09～0.36‰碘化鉀、0.1～0.3‰氯化錳、2.5～10‰氯化鈣、0.03～0.12‰鉬酸鈉、0.06～0.24‰硫酸鋅、0.08～0.3‰氯化鈷、5～20‰硫酸鎂、35～140‰氯化銨、5～20‰EDTA-4Na，余量為水。更進(jìn)一步地，所述的復(fù)合營養(yǎng)液的制備方法為：按比例將各組分物質(zhì)溶入適量水中，在25～40℃條件下超聲溶解，然后定容。更進(jìn)一步地，所述的復(fù)合營養(yǎng)液的pH為6.5～7.8。更進(jìn)一步地，所述的抑制劑成分為硫酸鈉和氯化鈉中的一種或兩種，其中硫酸鈉或氯化鈉在保護(hù)劑中的添加濃度為1％～5％；硫酸鈉和氯化鈉在保護(hù)劑中的添加濃度為1％～5％，兩者的質(zhì)量配比為(1:9)～(9:1)。更進(jìn)一步地，上述的高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑保護(hù)劑在微生物菌劑保藏領(lǐng)域中的應(yīng)用。3.有益效果相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明的高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑保護(hù)劑，其由抗氧化劑、緩沖劑、營養(yǎng)劑和抑制劑等組成，抗氧化劑成分為抗壞血酸與檸檬酸，其可對微生物菌劑快速脫氧，從而減緩菌株衰亡，以維持微生物菌劑長時間保藏后仍有較高活性；緩沖劑成分為磷酸鹽緩沖液與甘油，其可使維持微生物菌劑體系穩(wěn)定，進(jìn)一步提高菌株存活率；營養(yǎng)劑成分為有機(jī)工業(yè)廢水特征污染物與復(fù)合營養(yǎng)液，其可降低微生物菌劑降解性能受環(huán)境變化的影響；抑制劑成分為硫酸鈉或氯化鈉或硫酸鈉和氯化鈉，防止微生物菌劑受到雜菌污染，菌劑保護(hù)劑中有效成分根據(jù)菌劑特性按一定濃度添加至菌劑中，并置于室溫保藏；(2)本發(fā)明的保護(hù)劑可使高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理微生物菌劑在常溫下保藏，相較于冷藏保藏及低溫干燥保藏，本保藏方法成本低廉、使用方便，可有效減少保藏和運輸成本，進(jìn)一步保障微生物菌劑在高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理的實際應(yīng)用；(3)本發(fā)明的保護(hù)劑針對高鹽有機(jī)工業(yè)廢水特征，使用廉價的硫酸鈉或氯化鈉或硫酸鈉和氯化鈉作為抑制劑減少雜菌污染，相較于其他抑制劑而言，成本低廉，保護(hù)效果好，實用價值高；(4)本發(fā)明的保護(hù)劑具有營養(yǎng)劑成分，可有效保持菌劑性能、延長菌劑使用壽命并減少微生物菌劑所需復(fù)蘇時間，可滿足微生物菌劑應(yīng)用于高鹽有機(jī)工業(yè)廢水處理系統(tǒng)的需要，具有較高的實用價值。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。本發(fā)明的微生物菌劑保護(hù)劑主要對針對處理高鹽有機(jī)工業(yè)廢水的微生物菌劑研究的，高鹽一般定義為廢水中鹽度高于1％，高有機(jī)一般定義為廢水中COD濃度高于2000mg/L，高鹽有機(jī)廢水定義即為符合兩者定義的工業(yè)廢水。該類工業(yè)廢水中的特征污染物包括但不僅限于本發(fā)明中指出的青霉素、苯酚、苯二甲酸這些。包含其他特征污染物的高鹽有機(jī)工業(yè)廢水的處理微生物菌劑保護(hù)劑基于的原理與本發(fā)明一致，也適用于本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例1青霉素廢水處理微生物菌劑室溫保藏(1)青霉素廢水處理微生物菌劑存活率按2％(V/V)的比例將青霉素廢水處理微生物菌劑種子液接種至1升發(fā)酵培養(yǎng)液中(發(fā)酵培養(yǎng)液配方為：蛋白胨10g，牛肉膏6g，硫酸鈉40g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至6.5)，在溫度為30℃和震蕩速度為150r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過平板計數(shù)法對穩(wěn)定期發(fā)酵液進(jìn)行活菌數(shù)量測定，并對發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，使其活菌數(shù)量為1010cfu/ml。然后，將稀釋后的發(fā)酵液在5000rpm下離心20分鐘后，棄掉剩余發(fā)酵液，留下菌種，最后將1L微生物菌劑保存劑分別按表1中的配方含量加入菌種中，得到青霉素廢水處理微生物菌劑。通過平板計數(shù)法對菌劑進(jìn)行活菌計數(shù)，比較上述青霉素廢水處理微生物菌劑不同保藏條件和時間下菌種的存活率。配方中的復(fù)合營養(yǎng)液由0.8‰氯化鐵、0.08‰硼酸、0.01‰硫酸銅、0.09‰碘化鉀、0.1‰氯化錳、2.5‰氯化鈣、0.03‰鉬酸鈉、0.06‰硫酸鋅、0.08‰氯化鈷、5‰硫酸鎂、35‰氯化銨、5‰EDTA-4Na、水組成，按比例將各組分物質(zhì)溶入適量水中，在30℃條件下超聲溶解，然后定容至1000mL，pH調(diào)節(jié)至6.5。結(jié)果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)加入保護(hù)劑后，微生物菌劑存活率明顯上升，由29.8～64.8％提高為78.4～98.2％。表1不同保藏條件和時間下菌種的存活率結(jié)果(2)青霉素廢水處理微生物菌劑處理效果將上述保存半年及一年的微生物菌劑用于青霉素廢水處理，按2％(V/V)的比例將青霉素廢水處理微生物菌劑接種于青霉素廢水液體培養(yǎng)基中(硫酸銨2g，磷酸二氫鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，青霉素0.2g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.3)，分別于24h、48h、96h取樣測定青霉素濃度，考察不同保藏條件和時間下微生物菌劑對青霉素廢水的處理效果。結(jié)果如表2所示，可以發(fā)現(xiàn)加入保護(hù)劑后，微生物菌劑仍保持較好的處理效果，96h后青霉素去除率仍能達(dá)到90％。表2不同保藏條件和時間下菌劑的青霉素處理效果(以去除率計，％)序號24h48h96h序號24h48h96h1-0.5Y36.268.892.71-1Y28.958.978.82-0.5Y32.266.291.62-1Y27.654.274.63-0.5Y35.367.992.13-1Y30.456.376.24-0.5Y38.269.693.34-1Y32.363.379.35-0.5Y44.376.296.75-1Y36.772.287.76-0.5Y45.878.897.36-1Y38.273.290.27-0.5Y19.838.254.87-1Y12.324.837.2注：1～7與表1中1～7號保護(hù)劑配方一致，0.5Y表示保存半年的菌劑，1Y表示保存一年的菌劑。(3)青霉素廢水處理微生物菌劑染菌情況按(1)中保護(hù)劑配方配制保存菌劑，將菌劑置于敞口三角瓶中，在溫度為30℃和震蕩速度為150r/min條件下放置7d，通過測定菌劑渾濁度(OD660)觀察菌劑雜菌污染情況，其中不大于0.01為未染菌，0.01～0.1為輕度染菌，0.1～0.5為中度染菌，大于0.5為中度染菌。具體結(jié)果如表3所示，可以發(fā)現(xiàn)加入保護(hù)劑后，微生物菌劑受雜菌污染程度明顯降低。表3微生物菌劑保藏染菌實驗結(jié)果序號1d2d4d7d1未染菌未染菌輕度染菌輕度染菌2未染菌未染菌未染菌輕度染菌3未染菌未染菌未染菌輕度染菌4未染菌未染菌未染菌輕度染菌5未染菌未染菌未染菌未染菌6未染菌未染菌未染菌未染菌7輕度染菌中度染菌重度染菌重度染菌注：1～7與表1中1～7號保護(hù)劑配方一致。根據(jù)上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，6號配方的微生物菌劑保護(hù)劑保藏效果最好，其次為5號。實施例2苯酚廢水處理微生物菌劑室溫保藏按1％(V/V)的比例將苯酚廢水處理微生物菌劑種子液接種至1升發(fā)酵培養(yǎng)液中(發(fā)酵培養(yǎng)液配方為：蛋白胨10g，牛肉膏6g，氯化鈉10g，苯酚0.1g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.3)，在溫度為35℃和震蕩速度為120r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過平板計數(shù)法對穩(wěn)定期發(fā)酵液進(jìn)行活菌數(shù)量測定，并對發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，使其活菌數(shù)量為1010cfu/ml。然后，將稀釋后的發(fā)酵液在8000rpm下離心10分鐘后，棄掉剩余發(fā)酵液，留下菌種，最后在菌種中加入1L配方為5和6號(實施例1的表1中的序號)的微生物菌劑保存劑(與實施例1的表1中的5號和6號配方不同的是，將配方中的青霉素?fù)Q成苯酚)，得到酚廢水處理微生物菌劑。配方中的復(fù)合營養(yǎng)液由3‰氯化鐵、0.3‰硼酸、0.03‰硫酸銅、0.36‰碘化鉀、0.3‰氯化錳、10‰氯化鈣、0.12‰鉬酸鈉、0.24‰硫酸鋅、0.3‰氯化鈷、20‰硫酸鎂、140‰氯化銨、20‰EDTA-4Na、水組成，按比例將各組分物質(zhì)溶入適量水中，在40℃條件下超聲溶解，然后定容至1000mL，pH調(diào)節(jié)至7.0。按1％(V/V)將按上述方法得到的苯酚廢水處理微生物菌劑接種于苯酚廢水液體培養(yǎng)基中(硫酸銨2g，磷酸二氫鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，苯酚0.3g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0)按1％(V/V)的比例將添加5和6號配方保護(hù)劑(實施例1的表1中的序號，與實施例1的表1中的5號和6號配方不同的是，將配方中的青霉素?fù)Q成苯酚)的苯酚廢水處理微生物菌劑接種于苯酚廢水液體培養(yǎng)基中(硫酸銨2g，磷酸二氫鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，苯酚0.3g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0)，分別于24h、48h、96h取樣測定苯酚濃度，考察不同保藏條件和時間下微生物菌劑對苯酚廢水的處理效果。結(jié)果如表4所示，可以發(fā)現(xiàn)加入保護(hù)劑后，微生物菌劑仍保持較好的處理效果，96h后苯酚去除率仍能達(dá)到90％左右。表4不同保藏條件和時間下菌劑的苯酚處理效果(以去除率計，％)注：5.6.7與表1中5.6.7號保護(hù)劑配方基本一致，所不同的是將青霉素替換為苯酚。實施例3苯二甲酸廢水處理微生物菌劑室溫保藏按2％(V/V)的比例將苯二甲酸廢水處理微生物菌劑種子液接種至1升發(fā)酵培養(yǎng)液中(發(fā)酵培養(yǎng)液配方為：蛋白胨10g，牛肉膏6g，氯化鈉10g，苯二甲酸0.3g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.3)，在溫度為35℃和震蕩速度為120r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過平板計數(shù)法對穩(wěn)定期發(fā)酵液進(jìn)行活菌數(shù)量測定，并對發(fā)酵液進(jìn)行稀釋，使其活菌數(shù)量為1010cfu/ml。然后，將稀釋后的發(fā)酵液在5000rpm下離心30分鐘后，棄掉剩余發(fā)酵液，留下菌種，最后在菌種中加入1L配方為5和6號(實施例1的表1中的序號，與實施例1的表1中的5號和6號配方不同的是，將配方中的青霉素?fù)Q成苯二甲酸)的微生物菌劑保存劑，得到苯二甲酸廢水處理微生物菌劑。配方中的復(fù)合營養(yǎng)液由1.5‰氯化鐵、0.15‰硼酸、0.02‰硫酸銅、0.018‰碘化鉀、015‰氯化錳、5‰氯化鈣、0.06‰鉬酸鈉、0.12‰硫酸鋅、0.15‰氯化鈷、10‰硫酸鎂、70‰氯化銨、10‰EDTA-4Na組成，按比例將各組分物質(zhì)溶入適量水中，在25℃條件下超聲溶解，然后定容至1000mL，pH調(diào)節(jié)至7.2。按1％(V/V)將按上述方法得到的苯二甲酸廢水處理微生物菌劑接種于苯二甲酸廢水液體培養(yǎng)基中(硫酸銨2g，磷酸二氫鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.2g，苯二甲酸1g，加生理鹽水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2)，分別于24h、48h、96h取樣測定苯二甲酸濃度，考察不同保藏條件和時間下微生物菌劑對苯二甲酸廢水的處理效果。結(jié)果如表4所示，可以發(fā)現(xiàn)加入保護(hù)劑后，微生物菌劑仍保持較好的處理效果，96h后苯二甲酸去除率仍能達(dá)到90％左右。表5不同保藏條件和時間下菌劑的苯二甲酸處理效果(以去除率計，％)注：5.6.7與表1中5.6.7號保護(hù)劑配方基本一致，所不同的是將青霉素替換為苯二甲酸。當(dāng)前第1頁1 2 3