本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因降解煙葉中葉綠素方法的專利申請。

背景技術(shù)：

葉綠素是高等植物進行光合作用、吸收光能和光能轉(zhuǎn)化的主要色素類物質(zhì)，包括葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素等幾種類型；葉綠素也是煙草生長過程中煙葉進行碳氮代謝的基礎(chǔ)。

一般而言，在煙葉成熟和調(diào)制過程中，煙葉中所含葉綠素會大量降解，其降解率可達99%，通常僅以痕量存在。但受限于煙草處理方式的工藝差別，煙葉中葉綠素降解不夠充分的現(xiàn)象也偶有存在。當煙葉中葉綠素降解不完全時，煙葉烤后易形成不同程度的“青黃煙”，這種煙葉在燃吸時，會產(chǎn)生明顯的青雜氣，進而嚴重影響煙葉的外觀品質(zhì)與內(nèi)在品質(zhì)。由于葉綠素降解是否充分對煙草品質(zhì)具有十分重要的潛在影響，因而極有必要采取適當措施以確保煙葉中葉綠素降解充分。

葉綠素酶是一種普遍存在于高等植物中，介導葉綠素降解反應的關(guān)鍵酶之一，主要位于植物葉綠體內(nèi)膜上，質(zhì)體外也有所分布。該酶由葉綠素酶基因編碼，目前已經(jīng)克隆出的葉綠素酶基因共有4種，分別是藜葉綠素酶基因CaCLH、柑桔葉綠素酶基因CHLASE1和擬南芥葉綠素酶基因AtCLH1、AtCLH2。但現(xiàn)有研究中，尚未見到較好的商品化的葉綠素酶產(chǎn)品，及將相關(guān)葉綠素酶基因用于降解煙草中葉綠素的有關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于通過合理利用擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因，從而確保煙葉中的葉綠素降解完全，進而確保煙葉品質(zhì)的穩(wěn)定。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種降解煙葉中葉綠素的方法，該方法利用擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因進行煙葉中葉綠素的降解，其技術(shù)思路為：

該方法首先將該基因整合進入大腸桿菌基因組中構(gòu)建重組菌株，然后擴增該重組菌株制備處理菌劑，再將該菌劑噴施于煙葉表面，并適當發(fā)酵即可，具體包括如下步驟：

（1）克隆獲得擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因，具體為：

取新鮮擬南芥葉，Trizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

設(shè)計引物，并以上制備的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因擴增產(chǎn)物；

（2）構(gòu)建重組表達載體，具體為：

利用EcoRI和XhoI酶對步驟（1）中擴增所得擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因的擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；

利用EcoRI和XhoI酶對pET28a質(zhì)粒進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；

利用T4 DNA連接酶將AtCLH1基因和pET28a質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物進行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-AtCLH1；

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后涂布進行抗性篩選；

挑取單菌落進行菌落PCR鑒定與雙酶切驗證后，篩選驗證正確的陽性克隆進行質(zhì)粒提取獲得大量的構(gòu)建正確的重組表達載體pET28a-AtCLH1，備用；

（3）構(gòu)建重組工程菌，具體為：

將步驟（2）中所提取重組表達載體pET28a-AtCLH1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選、鑒定后獲得轉(zhuǎn)化正確的重組工程菌；

（4）菌株擴增與誘導表達，具體為

將步驟（3）中構(gòu)建正確的重組工程菌轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6左右；

然后加入終濃度為0.5 mM/L的IPTG，30℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)12 h；

離心收集菌體，并加入離心前等體積LB液體培養(yǎng)基進行重懸，此時即可作為煙葉處理用菌劑；

（5）煙葉處理，具體為：

將步驟（4）中所制備菌劑按煙葉質(zhì)量0.7%~1.0%的比例，均勻噴灑與煙葉表面，然后在37℃、60%濕度條件下貯藏10d，即可快速和有效的降解煙葉中葉綠素。

本發(fā)明中所述煙葉為新鮮采摘或經(jīng)烘烤、晾曬、發(fā)酵的煙葉，尤其適用于青黃煙、微帶青煙等葉綠素含量較高的低次煙葉。

從另一個角度而言，本申請主要涉及擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因在降解煙葉中葉綠素方面的應用的專利申請，利用該基因可有效降解煙葉中的葉綠素成分。

本發(fā)明采用分子生物學方法，將擬南芥葉綠素酶基因AtCLH1進行克隆，構(gòu)建了表達載體pET28a-AtCLH1，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，從而獲得了特定表達葉綠素酶的重組工程菌株。將該重組工程菌株擴增并誘導表達后，即可用于處理煙葉。實驗表明，供試煙葉經(jīng)處理后，煙葉中的葉綠素得以快速降解，葉綠素含量得到了明顯降低，降解率可達20%以上，使煙葉化學成分更為協(xié)調(diào)。由于該處理方法技術(shù)較為成熟，處理成本較低，且處理周期較短，而對煙葉質(zhì)量改善較為明顯，能夠明顯提升煙葉品質(zhì)（尤其是低次煙葉品質(zhì)提升較為明顯），因而在煙草制備領(lǐng)域具有較好的應用前景。

附圖說明

圖1為AtCLH1基因片段的PCR產(chǎn)物電泳圖；其中M: Trans DNA marker III；1為AtCLH1基因片段的擴增產(chǎn)物；

圖2為表達載體pET28a-AtCLH1的鑒定圖；其中M: Trans DNA marker III；A為菌落PCR鑒定結(jié)果；B為雙酶切鑒定結(jié)果；

圖3為目的蛋白AtCLH1的SDS-PAGE電泳圖；其中M：Marker，蛋白標準分子量；1：對照組，為含有空載體pET28a的大腸桿菌（E. coli）全細胞液；2~6：為含有表達載體pET28a-AtCLH1的E. coli全細胞液，其中2~6的IPTG濃度依次為0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、2.5 mmol/L；

圖4為不同處理時間下煙葉葉綠素降解率變化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中所涉及部分物料、實驗試劑、實驗設(shè)備等背景情況簡要介紹如下。

生物材料：

擬南芥為Columbia 0野生型，由上海交通大學生命科學技術(shù)學院許平教授惠贈；

質(zhì)粒pET28a、 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21等均購自天根生化科技有限公司；

煙葉樣品為2014年河南南陽GY1（青黃煙1級），由河南中煙工業(yè)有限責任公司提供；

相關(guān)引物合成及測序由上海博尚生物技術(shù)有限公司進行。

實驗試劑：

LB液體培養(yǎng)基配方為：每1000 mL 去離子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液調(diào)pH為7.0；

LB固體培養(yǎng)基配方為：每1000 mL 去離子水中含有：瓊脂粉15 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液調(diào)pH為7.0；

培養(yǎng)基在使用前于121℃滅菌15 min。

Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、EcoRI、XhoI酶等均購自寶生物工程有限公司。

實驗設(shè)備：

5417R高速冷凍離心機，為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；

UV-2550紫外分光光度計，為Shimadzu公司產(chǎn)品；

DYCZ-20F電泳儀，為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；

VeritiDX96 PCR儀，為AppliedBiosystems公司產(chǎn)品。

實施例1

由于利用擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因構(gòu)建重組菌株是本申請的關(guān)鍵過程，因而本實施例就該重組菌株的構(gòu)建過程簡要介紹如下。

（1）克隆獲得擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因，具體為：

取生長10~15d的新鮮擬南芥葉片約100 mg，放入液氮預冷過的研缽中，迅速將葉片研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，采用Trizol法進行總RNA的提取，并對提取的擬南芥總mRNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

從基因數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥葉綠素酶基因AtCLH1全長CDS序列（堿基序列如SEQ ID NO.1所示），以此為基礎(chǔ)，設(shè)計如下引物對，

引物1：5'-GCGGAATTCATGGCGGCGATAGAGGACAG-3'（加EcoR I酶切位點），

引物2：5'-CCGCTCGAGCTAGACGAAGATACCAGAAG-3'（加Xho I酶切位點）；

以上述所制備的擬南芥全cDNA為模板進行PCR擴增，50 μL擴增體系設(shè)計如下：

10×高保真PCR buffer，5 μL；

dNTP mix，10 mmol/L、1 μL；

MgSO₄ ，50 mmol/L、2 μL；

引物1，10 μmol/L、1.5 μL；

引物2，10 μmol/L、1.5 μL；

cDNA ，2.0 μL；

Pfu DNA polymerase，0.2 μL；

ddH₂O，36.8 μL；

PCR程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火40 s，68℃延伸75 s，35個循環(huán)；68℃延伸10 min；PCR擴增產(chǎn)物進行檢測分析或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測后，結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出，其在目標位置有很清晰的條帶，回收后送至上海博尚生物技術(shù)有限公司進行進一步測序驗證。

（2）構(gòu)建重組表達載體，具體為：

利用EcoRI和XhoI酶對步驟（1）中擴增所得擬南芥葉綠素酶AtCLH1基因的擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；利用EcoRI和XhoI酶對pET28a質(zhì)粒進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；具體50 μL酶切反應體系設(shè)計如下：

EcoR I，1μL；

Xho I，1μL；

10xH buffer，5μL；

pET28a，5μL；（酶切pET28a質(zhì)粒時，采用20μL）

ddH₂O加至50μL；

37℃水浴中雙酶切3~4 h，之后對酶切后的pET28a質(zhì)粒和AtCLH1基因片段分別進行回收。

利用T4 DNA連接酶將酶切后的AtCLH1基因片段和pET28a質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-AtCLH1；10 μL連接體系設(shè)計如下：

10x Ligase buffer，1 μL；

AtCLH 1酶切產(chǎn)物，5 μL；

pET28a 質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，3 μL；

Ligase Mix，1 μL；

16℃恒溫水浴中，連接過夜。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，具體步驟為：

-80℃冰箱中取出200 μL DH5α感受態(tài)細胞懸液，冰上解凍；

將過夜連接產(chǎn)物放入解凍后的感受態(tài)細胞中，充分混勻；

置于冰上30 min后，42℃水浴熱激30 s，冰浴2 min；

加入200 μL的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)l h；

取80 μL培養(yǎng)物涂布于含有kan (卡那霉素，100 μg mL^-1)的LB平板上進行抗性篩選，于37℃條件下下倒置培養(yǎng)過夜。

在kan⁺抗性LB平板上挑取幾個生長良好的單菌落進行菌落PCR鑒定與雙酶切驗證，菌落PCR鑒定方法參考步驟（1）中基因片段PCR擴增方法，雙酶切驗證方法參考上述步驟（2）中pET28a質(zhì)粒雙酶切方法。

結(jié)果表明，篩選得到的陽性克隆可在目標位置擴增出明顯條帶，且在目標位置雙酶切出正確大小的條帶（如圖2），將篩選驗證正確的陽性克隆進行質(zhì)粒提取，獲得重組表達載體pET28a-AtCLH1，備用。

（3）構(gòu)建重組工程菌，具體為：

將步驟（2）中所提取重組表達載體pET28a-AtCLH1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，方法參考步驟（2）中DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化方法，經(jīng)篩選、鑒定后獲得轉(zhuǎn)化正確的重組工程菌落，菌落篩選與鑒定方法參考步驟（2）中的單菌落篩選、鑒定方法。

實施例2

針對實施例1中所制備的重組工程菌株，在將其用于降解煙葉中葉綠素時，尚需適當誘導重組表達載體pET28a-AtCLH1以充分表達葉綠素酶，才能較為有效降解煙葉中所含葉綠素。為確定較佳的誘導條件，發(fā)明人進一步進行了有關(guān)實驗，簡要介紹如下。

挑取實施例1中所制備的重組工程菌，置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6時，分別加入不同終濃度梯度的IPTG（0.2 mM/L、0.5 mM/L、1.0 mM/L、2.0 mM/L、2.5 mM/L），30℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)12 h，12000 rpm離心5 min，收獲菌體；將菌體用LB液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整菌液OD₆₀₀=2.0；然后沸水浴與冰浴交替處理5次，用SDS-PAGE電泳檢測特異蛋白的表達情況。結(jié)果如如圖3所示。

對圖3分析可以看出，當IPTG濃度為0.5 mM/L時，重組蛋白AtCLH1的表達量最高，分子量為35 kDa，說明構(gòu)建的工程菌株能很好的表達目的基因AtCLH1。

基于上述誘導表達結(jié)果，在將實施例1中所構(gòu)建重組工程菌具體用于處理煙葉時，菌劑具體制備步驟如下：

（1）菌種活化，首先將實施例1中所構(gòu)建的重組菌株置于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)15 h；

（2）制備種子液，挑取步驟（1）中單菌落置于5 mL、LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm搖床振蕩培養(yǎng)過夜；

（3）制備發(fā)酵液，將步驟（2）中種子液按1:150的體積比，接種于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6左右；

（4）誘導表達，在步驟（3）培養(yǎng)結(jié)束后菌液中加入終濃度為0.5 mM/L的IPTG，30℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)12 h，12000 rpm離心5 min，收獲菌體，棄上清；

LB液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，12000 rpm離心5 min，收獲菌體，棄上清；重復此步驟數(shù)次（一般為3次），最后用LB液體培養(yǎng)基重懸后即獲得處理用菌劑。

進一步地，發(fā)明人對于所獲得菌劑中的葉綠素酶活性進行了檢測，具體檢測過程簡介如下。

（1）首先制備酶作用的葉綠素底物

用刀片將剛從大田中采收的新鮮煙葉（品種為中煙100）葉片切成直徑小于1 mm的細絲，取3.0 g切好的葉絲加入30 mL無水乙醇中，用鋁箔紙將其包裹，以防葉綠素見光分解；

黑暗條件下浸泡提取過夜，離心后取上清液與蒸餾水混合（比例為1:1），作為酶作用的葉綠素底物溶液。

（2）測定葉綠素酶活性

取1 mL上述所制備的處理用菌劑，加入到2 mL葉綠素底物溶液中，混勻后立即用分光光度計檢測720 nm處吸光值，讀取起始數(shù)據(jù)記錄為A；準確計時20 min后，讀取并記錄OD₇₂₀值B；

對照樣品為相同處理條件下含有空載體pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21感受態(tài)轉(zhuǎn)化菌株（制備方法參考實施例1及本實施例中相關(guān)步驟）；

實驗組與對照組分別測量6次，取平均值。

葉綠素酶的酶活定義為單位時間內(nèi)（1 min）反應體系的OD₇₂₀值變化0.001為1個酶活力單位，定義為1 U；

酶活力通過計算公式：E(U) = N(A-B)×1000/20得到，其中N為樣品稀釋倍數(shù)。

測定結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組工程菌株具有較高的葉綠素酶活（24.9 U/mL），具體結(jié)果如下表所示：

。

實施例3

將實施例2中所制備菌劑處理煙葉樣品時，按煙葉一定質(zhì)量比例（0.7%~1.0%），均勻噴灑于煙葉表面后，37℃、60%濕度條件下作用10~15d即可。為確定較佳處理工藝及處理后煙葉品質(zhì)改善效果，發(fā)明人進行了進一步的實驗，具體過程簡介如下。

（一）煙草預處理

采用2014年河南南陽GY1（青黃煙1級）的青黃煙葉，抽取煙梗后，將煙葉分割成片狀（3 cm×3 cm），然后均勻分成2組，1組為待處理組，另1組為對照組（CK），每組處理均為300 g。

（二）降解處理

將實施例2中所制備的處理用菌劑按煙葉質(zhì)量0.8%的比例，均勻噴灑于煙葉上，對照組噴灑同等質(zhì)量（0.8%的比例）的蒸餾水作為對照；

噴灑后，將處理組和對照組均置于37℃、60%濕度條件下貯藏12d，其中每2d取樣一次，對其葉綠素含量進行測定，同時分別取樣，將煙葉按現(xiàn)有煙支制備工藝制備成成品卷煙進行感官質(zhì)量評價，以確定葉綠素降解效果。

葉綠素降解率測定

葉綠素降解率測定及計算方法如下：

（1）取煙葉樣品，烘干后過40目篩，制成煙末，稱取0.5 g煙末，加入30 mL 無菌水，于70℃避光浸泡處理4 h，之后抽濾，充分洗滌殘渣，將殘渣轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入25 mL 、90%體積比例的丙酮，超聲處理20 min，抽濾取濾液；

（2）對步驟（1）中濾液，分別測定646 nm、663 nm處吸光值；按照下述公式計算煙葉中葉綠素含量，最后與初始對照對比換算獲得葉綠素降解率；

Ca（mg/L）=12.21OD₆₆₃-2.81OD₆₄₆；

Cb（mg/L）=20.16 OD₆₄₆-5.03 OD₆₆₃；

式中，Ca：葉綠素a，Cb：葉綠素b；葉綠素含量（mg/L）= Ca+ Cb。

不同處理時間時煙葉中葉綠素降解率測定結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，煙葉經(jīng)菌液制劑處理后，葉綠素降解率隨處理時間延長逐漸增高，當處理10天時，煙葉中葉綠素降解率可達最高值（23%），之后趨于穩(wěn)定。

煙葉感官質(zhì)量評價

對所制備的煙支，經(jīng)恒溫恒濕箱平衡后，由專業(yè)評委對香氣質(zhì)（A）、香氣量（B）、濃度（C）、柔細度（D）、余味（E）、雜氣（F）、刺激性（G）等指標進行評定，每項指標均按9分制打分，感官評吸總分（T）=（A+B）× 2.3 + C × 1.5 + D + E + F + G。

對不同處理時間時煙葉的感官評吸進行統(tǒng)計，結(jié)果如下表所示：

。

對上表數(shù)據(jù)進行分析，可以看出，經(jīng)過菌液制劑處理過的煙葉，在處理10天時評吸總分達到最高值，總分相比對照增加了1.13分，但與處理12天時評吸總分相差不大，結(jié)合上述煙葉葉綠素降解率結(jié)果，可確定菌液制劑的最佳處理時間為10天，此時可使煙葉葉綠素降解23%，評吸總分相比對照提高1.13分，使煙葉整體提高了一個等級，因而本發(fā)明在快速高效降解煙葉葉綠素，改善煙葉（尤其是青黃煙葉、微帶青煙葉等低次煙葉）整體質(zhì)量方面具有良好的應用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南中煙工業(yè)有限責任公司

<120> 一種降解煙葉中葉綠素的方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1003

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

gcaaacagac cccataatcc ttaaaagaga gctgtaatga atatgtctta cacaatctcc 60

attggtggtg cttcctaatc taccactgaa gaacttatca cagtagcaaa ccacaattct 120

gcatataaac aaacagaatg tgaacttcga atcagagcca ttataataca tagaggtgaa 180

ggcagagacc tcaaaatcta acgcagaaat catcaatgga acggaattaa agtaaataca 240

atagatgatt ctaaaatccg ggggttcacc agggactcac cagagcaact agggttccgc 300

aggattgaaa cgaggtatat gaagatgcgg cggaattcga atccaacggc tgagagagat 360

ttcaattact cgacggagat ggccgccgat ctgagagaga gagagacgga ggttgggtgc 420

gtcgcaggga aattgtgcca cgtcaccctt cctctcttct ttttctgttc tctgtttttc 480

ttgtgctact atttgttttt ggtcaaattt tacttttttg gtcaatttgt ttcttttttt 540

tttacataac aatttttttt ttttttttac tgaacaaaca taacaaaatg ttttttttaa 600

caaacataac aatatgtttc ctaatgcaat ttgattatat tttttagtag tacttagtaa 660

gtcttggtat gtgtttatgg acacatcgtt ttcgggaaac gaattaaatt gtactccgaa 720

aatgataaat gcatggagta attgtatacc aactaacttg taataatttg aatcaacaca 780

tgctcttttg tttacgcagc ccatgcattt atcgttttcg aaagtattta attcattttg 840

ttataactac gatgagaagc cgagagaacc acagaattat aatgaatcgg ataagaaaaa 900

tcaacattct ccccctataa atacaaaaca actagctaaa gttcgaagga ttcatacata 960

aatcttcaac acaactcttt aattatctag tttaatacaa atg 1003