技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及抗人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)抗體檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是指一種用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原及相關(guān)免疫檢測試劑盒，尤其可用于國內(nèi)流行的高危險型人乳頭瘤病毒(HPV)亞型HPV16和HPV18。
背景技術(shù)：
：子宮頸癌是第二位常見女性惡性腫瘤，人乳狀瘤病毒(HPV)是其發(fā)生的必要條件。盡管人群HPV感染很普遍，如：宮頸癌高發(fā)區(qū)婦女35歲以后感染率仍高達20.8％。但超過80％的HPVDNA陽性婦女不會進展為癌癥或癌前病變。因此HPVDNA檢測缺陷是無法分辨一過性感染和可引起宮頸病變的感染，導(dǎo)致較高假陽性率。大量研究顯示，HPV致癌基因表達產(chǎn)物(癌蛋白oncoprotein)有很高的致癌活性，因此這些生物標志物有可以作為比HPVDNA更為準確有特異性的宮頸癌預(yù)測指標。高危HPVE2、E6、E7癌蛋白(oncoprotein)的表達水平和宮頸癌前病變不同階段直接相關(guān)。利用這一特性可以構(gòu)建全新的宮頸癌分子篩查指標。對HPV致癌機理的研究表明，高危型HPV的早期表達蛋白E6，E7蛋白在宮頸癌的發(fā)生中起著重要作用。在宮頸高度病變和癌癥患者的宮頸上皮細胞中HPVE6及E7蛋白一般呈過度表達，持續(xù)表達和過量表達的E6，E7致癌蛋白可與宿主細胞調(diào)控蛋白(如，P53和Rb蛋白等)相互作用，使腫瘤抑制因子失活，導(dǎo)致細胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化。除了HPVDNA檢測和HPV致癌蛋白檢測，血液(體液)中HPV抗體也證明對HPV感染及宮頸癌發(fā)病史有很大的相關(guān)性。HPVL1血液抗體可用標準ELISA方法檢測,提供HPV感染信息。隨著HPV感染時間的延長，HPV誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗HPV抗體，故可檢測到血清中抗HPV抗體。Wikstrom等檢測了47例男性現(xiàn)癥尖銳濕疣患者和32例曾有尖銳濕疣病史患者的男性對HPV6型和HPV11型衣殼蛋白的血清IgG抗體，并與205例無生殖器尖銳濕疣病史的男性比較，結(jié)果，血清中抗HPV6型的IgG抗體在曾有尖銳濕疣病史的男性中為35％，在現(xiàn)癥尖銳濕疣中為27％，而在對照組為10％。這表明抗HPV6IgG抗體的出現(xiàn)發(fā)生在尖銳濕疣病期的晚些時候，同時IgG陽性也反映曾感染過這種病毒。Stone等報道了利用此方法對于美國普通人群7218例HPV-16的感染率研究，結(jié)果表明女性陽性率17.9％，男性陽性率7.9％(Stone，K.M.,etal.,SeroprevalenceofHumanPapillomavirusType16InfectionintheUnitedStates.2002.TheJournalofInfectiousDiseases2002；186:1396–402)。HPVL1抗體ELISA方法在配合HPV疫苗(Merck公司Gardasil預(yù)防性疫苗)的研發(fā)及臨床試驗過程中曾被廣泛采用。Luevano等用蛋白芯片例宮頸癌病人的血清樣品進行了高通量檢測分析(Luevano,M.,etal.,High-ThroughputProfilingoftheHumoralImmuneResponsesAgainstThirteenHumanPapillomavirusTypesbyProteomeMicroarrays.2010.Virology.2010；405(1):31–40)，分析13個HPV型的總共54604種蛋白的抗體profiling，結(jié)果表明了血液中致癌蛋白的抗體與宮頸癌、高度病變、低度病變、及無癥狀普通人有較強的相關(guān)性(Luevano,M.,etal.,High-ThroughputProfilingoftheHumoralImmuneResponsesAgainstThirteenHumanPapillomavirusTypesbyProteomeMicroarrays.2010.Virology.2010；405(1):31–40)。因此，為了實現(xiàn)HPV抗體檢測的高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性，需要提供新的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原及相關(guān)免疫檢測試劑盒，該用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原可以高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性地檢測血液或唾液中的HPV抗體，從而可以為醫(yī)生準確診斷病人宮頸上皮內(nèi)瘤變和子宮頸癌帶來依據(jù)，進而及時采取治療，以防止癌癥發(fā)生，或癌癥擴散，及時減輕病人痛苦，由其制成的免疫檢測試劑盒可以快速簡單準確地檢測血液或唾液中的HPV抗體，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原，其特點是，所述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原選自如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列、與SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列以及與SEQIDNO:5所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列中的一種或幾種。較佳地，所述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原的第m+2位、第m+3位、第m+5位、第m+6位以及第m+8-m+12位氨基酸依次是Asp、Ser、Glu、Glu、Asp、Glu、Ile、Asp和Gly，其中m≥0。較佳地，所述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原采用化學(xué)合成或生物工程方法獲得。例：重組蛋白，融合蛋白。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫檢測試劑盒，其特點是，包括上述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原。較佳地，所述免疫檢測試劑盒還包括載體，所述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原包被在所述載體上。較佳地，所述免疫檢測試劑盒還包括標記的抗人乳頭瘤病毒抗體的二抗。二抗用來檢測人血清中的抗體IgG，IgM，或IgA.所用標記物可以是辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，熒光分子FITC(或其它熒光標記)，化學(xué)發(fā)光檢測。檢測方法可以是顯色法，熒光方法，化學(xué)發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光法進行定性、定量分析。更佳地，所述的標記的抗人乳頭瘤病毒抗體的二抗是辣根過氧化物酶標記的抗人乳頭瘤病毒抗體的二抗。在本發(fā)明的第三方面，提供了上述的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原或上述的免疫檢測試劑盒在檢測人體液中抗人乳頭瘤病毒抗體中的應(yīng)用。較佳地，所述體液是血液或唾液。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原選自如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列、與SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列、與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列以及與SEQIDNO:5所示的氨基酸序列具有80％同源性的氨基酸序列中的一種或幾種，病人在被病毒感染后，可在血清和口腔唾液中高特異性、高靈敏度、高特異性地地檢測出現(xiàn)的特異性的抗體IgM，IgA或IgG分子，從而可以為醫(yī)生準確診斷病人宮頸上皮內(nèi)瘤變和子宮頸癌帶來依據(jù)，進而及時采取治療，以防止癌癥發(fā)生，或癌癥擴散，及時減輕病人痛苦，以此制成的免疫檢測試劑盒，可以快速簡單準確地檢測血液或唾液中的HPV抗體，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。具體實施方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特列舉以下具體實施例詳細說明。然而，具體實施例僅僅是用于舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制。一、材料與方法1、試劑和藥品辣根過氧化物酶標記羊抗人(GoatAnti-HumanIgG,FC)，購自PrieceProduct#31413。氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。Tween-20購自AMRESCO。胎牛血清購自北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司。2、儀器和耗材電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；85-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市杰瑞爾電器有限公司)；MULTISKANMK3酶標儀(Thermo公司)；超純水制備裝置(美國MILLPORE公司)；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；WellWASK4MK2洗板機(購自Thermo公司)；酶標板(COSTAR公司)；單道、多道移液器(德國eppendorf公司)。3、主要溶液系統(tǒng)·包被緩沖液(PBS磷酸鹽溶液)：磷酸二氫鉀0.2g，12水磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，加蒸餾水至1L，4度保存?！は礈炀彌_液(PBS-Tween20，0.1％)：Tween-201mL，加入到1L稀釋緩沖液(PBS)中，攪拌混勻，調(diào)pH值到7.0～7.2之間?！し忾]液：5％milk-PBS-Tween·血清稀釋液：10％FBS-PBS-Tween·TMB顯示液：Amresc，CATNO.64285730，用前TMB底色顯色A液和B液等體積混合。o底物顯色A液：乙酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，雙氧水(30％)0.3ml，蒸餾水加至500ml。o底物顯色B液：乙二胺四乙酸二鈉0.2g檸檬酸0.95g甘油50ml四甲基聯(lián)苯胺0.2g蒸餾水加至500ml?！そK止液(2mol/LH2SO4)：雙蒸水178.3mL，滴加濃硫酸(98％)21.7mL。4、間接ELISA方法的建立1)用PBS稀釋HPV多肽抗原HPV16-1/HPV16-2/HPV16-3/HPV18-1/HPV18-2濃度為4ug/ml，包被costar板條100ul/孔，4℃過夜。2)PBS洗滌一次，拍干。3)加入5％奶粉-PBS封閉，250ul/孔，37度3小時。4)PBST洗滌一次，拍干。5)10％FBS-PBST稀釋血清1：50稀釋，振蕩器混勻。6)加入稀釋好的血清，空白對照，陰性對照以及陽性對照，50ul/孔，37度孵育1小時。7)0.1％tween-PBS洗滌5次，拍干。8)加入辣根過氧化物酶標記羊抗人，用10％FBS-PBST稀釋(1：40000)，100ul/孔，37度孵育30分鐘。9)0.1％tween-PBS洗滌5次，拍干。10)TMB顯色:TMBA液和B液等體積混合，100ul/孔，37度20min。11)2MH2SO4，50ul/孔終止，用酶標儀450nm讀數(shù)。5、試劑盒組成：本試劑盒由以下幾個部分組成：1.包被本發(fā)明的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原的costar酶標板一塊2.辣根過氧化物酶標記羊抗人一管(10ul)3.10*PBST一瓶(10ml)4.TMB顯色液A液一瓶(6ml)，B液一瓶(6ml)5.終止液一瓶(6ml)6、包被抗原多肽抗原如下HPV16-1KCDSTLRLCVQSTHVDIRTLESEQIDNO：1HPV16-2PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEESEQIDNO：2HPV16-3LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHSEQIDNO：3HPV18-1IDGVNHQHLPARRAEPQRSEQIDNO：4HPV18-2SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHSEQIDNO：5二、檢測結(jié)果試劑盒選擇5條多肽(SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5)作為包被選擇，通過ELISA方法檢測血清。1、用包被抗原并封閉過的酶標板通過ELISA方法檢測健康人血清，檢測的原始數(shù)據(jù)結(jié)果如下；表一：HPV血液ELISA檢測正常人血清結(jié)果表2、選擇2條多肽(SEQIDNO：3，SEQIDNO：5)作為包被選擇并封閉過的酶標板通過ELISA方法檢測正常人血清，檢測的原始數(shù)據(jù)結(jié)果如下；表二：HPV血液ELISA檢測正常人血清結(jié)果表3、選擇5條多肽(SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5)作為包被選擇包被并封閉過的酶標板通過ELISA方法檢測病人血清，病人的病理診斷結(jié)果如表三中所示，其中部分病人經(jīng)過HC2病理檢驗，結(jié)果如下：表三：HPV血液ELISA檢測病人血清結(jié)果表4、選擇3條多肽(SEQIDNO：1，SEQIDNO：3，SEQIDNO：5)作為包被選擇包被并封閉過的酶標板通過ELISA方法檢測病人血清，病人的病理診斷結(jié)果如表四中所示，其中部分病人經(jīng)過HC2病理檢驗，結(jié)果如下：表四：HPV血液ELISA檢測病人血清結(jié)果表三、數(shù)據(jù)分析1、根據(jù)正常人檢測值，計算出平均值，標準方差，CUTOFF值。分別將表一中的44例正常人血清在HPVE7多肽上的反應(yīng)OD值取平均數(shù)，并計算標準方差SD，本試劑盒在確定CUTOFF值時選擇正常人平均值加上兩倍的標準方差作為HPV陰陽性的判斷標準，結(jié)果如下：Cutoff計算公式為：cutoff＝平均值OD+2*SD標準方差1.1根據(jù)表一結(jié)果，HPVE7(SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：5)5條多肽檢測正常人血清結(jié)果統(tǒng)計分析得出，結(jié)果如下表：表五：HPVE7的5條多肽血清ELISA檢測數(shù)據(jù)表SEQIDNO：1SEQIDNO：2SEQIDNO：3SEQIDNO：4SEQIDNO：5平均值0.2920.2790.3820.3010.383標準方差0.0980.1000.1110.0760.111cutoff0.4870.4800.6040.4520.6051.2根據(jù)表二結(jié)果，HPVE7(SEQIDNO：3和SEQIDNO：5)2條多肽檢測正常人血清結(jié)果統(tǒng)計分析得出，結(jié)果如下表：表六：HPVE7的2條多肽血清ELISA檢測數(shù)據(jù)表1.3根據(jù)表五和表六的結(jié)果，對比分析得出SEQIDNO：3和SEQIDNO：5這2條多肽在不同實驗時得出的cutoff值一致。2、通過cutoff值，判斷檢測的病人血清HPV的陰性、陽性，超過這個cutoff值的即認為是陽性，且只要一個多肽檢測為陽性，即認為有HPV感染，同時與HC2診斷結(jié)果對比。2.1在檢測的病人血清中291例血清有HC2診斷結(jié)果，有病理診斷陽性的病例84例.在病理陽性病人組(臨床診斷”金標準”),血清抗體檢測結(jié)果與HC2分子檢測結(jié)果相對比(見表7)，將其與本試劑盒檢測HPV結(jié)果進行對比如下表：(本檢測結(jié)果中統(tǒng)計為陽性的包括：(i)兩個抗原檢測結(jié)果有任何一個是陽性結(jié)果，(ii)兩個抗原檢測結(jié)果都是陽性結(jié)果)表七：根據(jù)表三的結(jié)果，對于病人的血清ELISA診斷結(jié)果與HC2診斷結(jié)果對比表(“+”表示檢測結(jié)果陽性；“-”表示檢測結(jié)果陰性)表八：根據(jù)表四的結(jié)果，對于病人的血清ELISA診斷結(jié)果與HC2診斷結(jié)果對比表(“+”表示檢測結(jié)果陽性；“-”表示檢測結(jié)果陰性)將表七結(jié)果的HC2結(jié)果和血液ELISA檢查結(jié)果進行人數(shù)統(tǒng)計分析，結(jié)果如下表：表九：HC2結(jié)果與血液ELISA檢測準確率人數(shù)及比例對比表其他婦科疾病主要為盆腔炎，卵巢囊腫，子宮肌瘤等婦科疾病。將表八結(jié)果的HC2結(jié)果和血液ELISA檢查結(jié)果進行人數(shù)統(tǒng)計分析，結(jié)果如下表：表十：HC2結(jié)果與血液ELISA檢測準確率人數(shù)及比例對比表其他婦科疾病主要為盆腔炎，卵巢囊腫，子宮肌瘤等婦科疾病。2.2檢測病人血清中有10例血清為沒有HC2檢測報告，但病理報告為CIN和宮頸癌，本試劑盒檢測HPV結(jié)果，病人數(shù)及血液檢測陽性率對比結(jié)果如表。表十一：對于沒有HC2診斷結(jié)果，但有病理結(jié)論的病人與HPV血液ELISA檢測結(jié)果總結(jié)(“+”表示檢測結(jié)果陽性；“-”表示檢測結(jié)果陰性)表十二：無HC2結(jié)果的CIN，宮頸癌及宮頸病變的病人血液ELISA檢測的人數(shù)表病理人數(shù)(10)SEQIDNO：1陽性SEQIDNO：3陽性SEQIDNO：5陽性CINⅠ2211CINⅡ，Ⅲ7455宮頸癌10112.3將所有CINⅠⅡⅢ和宮頸癌的病人血液ELISA檢測結(jié)果統(tǒng)計人數(shù)及陽性比例結(jié)果如表十三。表十三：所有CIN，宮頸癌及宮頸病變的病人血液ELISA檢測的人數(shù)及準確率比例表本發(fā)明的上述多肽是經(jīng)過發(fā)明人的選擇并在病人樣品及正常人樣品中進行了檢測驗證，而直接采用GST-HPV16-E7和GST-HPV118E7全長融合蛋白(分別為SEQIDNO：6、SEQIDNO：7所示序列)檢測血清，效果不佳，請參見下列實驗數(shù)據(jù)。或四、實驗材料和ELISA方法同前面第一點，只是采用多肽(SEQIDNO：3，SEQIDNO：5)檢測的同時，還采用GST-HPV16-E7和GST-HPV118E7全長融合蛋白作為檢測抗原，在用PBS稀釋GST-HPV16-E7、GST-HPV18-E7全長融合蛋白時，濃度均為2ug/ml，檢測結(jié)果如下：1.根據(jù)上面實驗步驟，檢測部分病人血清和普通人血清，檢測結(jié)果和病人病理報告如下表所示：五.實驗分析1.將使用全長蛋白的檢測結(jié)果與之前采用HPV多肽SEQID:3和SEQID:5兩種多肽聯(lián)合檢測結(jié)果對比，對比如下表：總結(jié)：總結(jié)：HPV16-E7，HPV18-E7全長融合蛋白在檢測CIN，宮頸癌病人時有一定的陽性病人漏檢，靈敏性比多肽檢測差。在檢測普通婦科炎癥病人和普通人群時有一定的假陽性率，敏感性比多肽檢測略差。所以，HPV16-E7和HPV18-E7全長蛋白對于檢測CIN，宮頸癌等不是很適合。本發(fā)明的血液酶標免疫分析法(ELISA)以免疫生化原理為基礎(chǔ)，提供高靈敏度，高特異性和高穩(wěn)定性的抗原-抗體檢測方法。病人在被病毒感染后，可在血清和口腔唾液中出現(xiàn)特異性的抗體IgM,IgA或IgG分子。用酶標免疫分析法ELISA檢測病人血清或唾液中特異性抗HPV的抗體分子。本發(fā)明通過對HPV病毒高危型HPV16，HPV18基因序列的分析，用生物信息學(xué)分析對抗原性的理論預(yù)測，并用實驗方法篩選、證明臨床應(yīng)用的意義。通過制備多個高純度的抗原多肽，并以國內(nèi)人群健康者血清和感染者血清對制備抗原進行反復(fù)篩選、驗證，獲得了有高靈敏度，高特異性和高穩(wěn)定性的目的抗原HPV16-1、HPV16-2、HPV16-3、HPV18-1、HPV18-2。并證明用這些多肽抗原結(jié)合到某種固相載體表面，能保持其免疫反應(yīng)活性。在測定時，使受檢標本與固相載體表面的抗原起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原、抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后是結(jié)合在固定載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，然后通過顯色來檢測，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺作定性或定量分析。本發(fā)明的血液ELISA檢測試劑盒與DNA檢測(HC2,CareHPV)相比,取樣均勻，非侵略性，操作更為快速，簡單；費用便宜，容易推廣，更適合中國市場；可避免PCR方法帶來的假陽性和假陰性，大大提高了檢測結(jié)果的精確度和準確度；與傳統(tǒng)的巴氏涂片、醋酸染色VIA，陰道鏡檢查相比，更為準確、容易、快速。ELISA檢測方法經(jīng)各種參數(shù)和實驗程上的優(yōu)化，可作為大規(guī)模篩選的工具用于宮頸癌的早期篩查。綜上，本發(fā)明的用于檢測抗人乳頭瘤病毒抗體的抗原可以高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性地檢測血液或唾液中的HPV抗體，從而可以為醫(yī)生準確診斷病人宮頸上皮內(nèi)瘤變和子宮頸癌帶來依據(jù)，進而及時采取治療，以防止癌癥發(fā)生，或癌癥擴散，及時減輕病人痛苦，由其制成的免疫檢測試劑盒可以快速簡單準確地檢測血液或唾液中的HPV抗體，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書應(yīng)被認為是說明性的而非限制性的。當(dāng)前第1頁1 2 3