本發(fā)明涉及電化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

發(fā)展至今，生物傳感器已發(fā)展了三代，其中第三代生物傳感器是以氧化還原蛋白質(zhì)和酶與電極間發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移為特征，它不僅簡化了傳感器的裝置，而且克服了第一代與第二代生物傳感器在生物組分檢測方面的局限性，從而提高了傳感器的性能。具有生物兼容性的新型材料在構(gòu)造第三代生物傳感器中的應(yīng)用不僅為在體檢測提供了可能，同時也為生物體內(nèi)各復(fù)雜物質(zhì)之間的相互作用和電子傳遞機制的探究提供了有利平臺。然而，第三代生物傳感器在研制中也遇到了一些障礙：比如酶和蛋白質(zhì)的活性中心通常深埋于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，和電極表面之間存在較遠的距離，受酶和蛋白質(zhì)的定位、構(gòu)象等因素的影響，酶和蛋白質(zhì)的活性中心與電極間的直接電子傳遞（DET）較難實現(xiàn)。另外一點，酶與蛋白質(zhì)非常容易變性甚至失活，固載到電極表面后通常難以保持長期穩(wěn)定性。為了構(gòu)造具有良好性能的生物傳感器來實現(xiàn)酶和電極間有效的DET，一個有效的方法就是構(gòu)造一個溫和、適宜的生物傳感界面，而在構(gòu)筑生物傳感界面的過程中，修飾材料與構(gòu)造方法的選擇至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有的電化學(xué)生物傳感器存在的不足，本發(fā)明在原有多孔海藻酸鈣（CA）膜修飾電極的基礎(chǔ)上通過引入新物質(zhì)，探究了肌紅蛋白（Mb）如何更加穩(wěn)定的通過薄膜固定在電極表面，構(gòu)造出一種含水率高、穩(wěn)定性好、電化學(xué)性能優(yōu)良的電化學(xué)生物傳感器。

對第三代新型電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)造及優(yōu)化是本發(fā)明研究的主要內(nèi)容，選用合適的新材料用于構(gòu)造更加新穎且實用的電化學(xué)生物傳感界面，使蛋白質(zhì)、酶在修飾電極表面的電化學(xué)方面的性質(zhì)得以更好地研究。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料的制備方法的具體步驟如下：

配制濃度為0.01-0.05g/ml的海藻酸鈉溶液，濃度為0.01-0.05g/ml的聚乙二醇溶液，濃度為0.01-0.05g/ml的聚乙烯醇溶液，濃度為0.1-0.5g/ml的CaCl₂溶液；將配制好的海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液和聚乙烯醇溶液混合，然后滴入CaCl₂溶液中，海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液，聚乙烯醇溶液和CaCl₂溶液的體積比為1-3:5-10:3-9:10-20，在室溫下輕微攪動10min使之發(fā)生交聯(lián)，得到本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料。

優(yōu)選：配制濃度為0.02g/ml的海藻酸鈉溶液，濃度為0.02g/ml的聚乙二醇溶液，濃度為0.02g/ml的聚乙烯醇溶液，濃度為0.1g/ml的CaCl₂溶液；海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液，聚乙烯醇溶液和CaCl₂溶液的體積比為2:8:6:16。

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料可以用于制備Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

具體步驟如下：

將本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料均勻涂布在打磨干凈的玻碳電極表面，將電極罩起，使修飾電極薄膜中含有的水分在密閉的室溫條件下進行緩慢蒸發(fā)，薄膜充分晾干之后，用二次水將多余的CaCl₂洗掉，然后室溫條件下晾干，便形成了聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜；然后，在聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜上涂布Mb溶液，干燥后便可獲得Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

Mb溶液的濃度為0.5-2mg/ml，權(quán)利要求1或2制備的復(fù)合材料與Mb溶液的體積比為5-20:5。優(yōu)選：Mb溶液的濃度為1mg/ml，權(quán)利要求1或2制備的復(fù)合材料與Mb溶液的體積比為10:5。

本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明制備的Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合薄膜具有更加穩(wěn)定均勻的微球結(jié)構(gòu)和更高的含水率，為Mb提供了一個更加穩(wěn)定、溫和的多水緩沖環(huán)境，促進了電子的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明制備的Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極具有含水率高、穩(wěn)定性好、電化學(xué)性能優(yōu)良的優(yōu)點。

附圖說明

圖1為聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜的SEM圖。

圖2為Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜的SEM圖。

圖3圖為不同電極EIS譜的Niquist圖；

（a）空白GCE，（b）Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極，（c）多孔CA膜修飾電極。實驗溶液：含有5.0 mM L-1 [Fe(CN)₆]₃-/4-的pH為7.0的緩沖溶液。插圖為Randles等效電路圖。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。

實施例1

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料的制備方法的具體步驟如下：

配制濃度為0.01g/ml的海藻酸鈉溶液，濃度為0.05g/ml的聚乙二醇溶液，濃度為0.01g/ml的聚乙烯醇溶液，濃度為0.5g/ml的CaCl₂溶液；將配制好的海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液和聚乙烯醇溶液混合，然后滴入CaCl₂溶液中，海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液，聚乙烯醇溶液和CaCl₂溶液的體積比為1: 10:3: 20，在室溫下輕微攪動10min使之發(fā)生交聯(lián)，得到本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料。

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料可以用于制備Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

具體步驟如下：

將本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料均勻涂布在打磨干凈的玻碳電極表面，將電極罩起，使修飾電極薄膜中含有的水分在密閉的室溫條件下進行緩慢蒸發(fā)，薄膜充分晾干之后，用二次水將多余的CaCl₂洗掉，然后室溫條件下晾干，便形成了聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜；然后，在聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜上涂布Mb溶液，干燥后便可獲得Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

Mb溶液的濃度為0.5mg/ml，復(fù)合材料與Mb溶液的體積比為20:5。

實施例2

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料的制備方法的具體步驟如下：

配制濃度為0.05g/ml的海藻酸鈉溶液，濃度為0.01g/ml的聚乙二醇溶液，濃度為0.05g/ml的聚乙烯醇溶液，濃度為0.1g/ml的CaCl₂溶液；將配制好的海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液和聚乙烯醇溶液混合，然后滴入CaCl₂溶液中，海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液，聚乙烯醇溶液和CaCl₂溶液的體積比為3:5: 9:10，在室溫下輕微攪動10min使之發(fā)生交聯(lián)，得到本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料。

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料可以用于制備Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

具體步驟如下：

將本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料均勻涂布在打磨干凈的玻碳電極表面，將電極罩起，使修飾電極薄膜中含有的水分在密閉的室溫條件下進行緩慢蒸發(fā)，薄膜充分晾干之后，用二次水將多余的CaCl₂洗掉，然后室溫條件下晾干，便形成了聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜；然后，在聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜上涂布Mb溶液，干燥后便可獲得Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

Mb溶液的濃度為2mg/ml，復(fù)合材料與Mb溶液的體積比為5:5。

實施例3

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料的制備方法的具體步驟如下：

配制濃度為0.02g/ml的海藻酸鈉溶液，濃度為0.02g/ml的聚乙二醇溶液，濃度為0.02g/ml的聚乙烯醇溶液，濃度為0.1g/ml的CaCl₂溶液；將配制好的海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液和聚乙烯醇溶液混合，然后滴入CaCl₂溶液中，海藻酸鈉溶液，聚乙二醇溶液，聚乙烯醇溶液和CaCl₂溶液的體積比為2:8:6:16，在室溫下輕微攪動10min使之發(fā)生交聯(lián)，得到本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料。

本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料可以用于制備Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

具體步驟如下：

將本發(fā)明的聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈉復(fù)合材料均勻涂布在打磨干凈的玻碳電極表面，將電極罩起，使修飾電極薄膜中含有的水分在密閉的室溫條件下進行緩慢蒸發(fā)，薄膜充分晾干之后，用二次水將多余的CaCl₂洗掉，然后室溫條件下晾干，便形成了聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜；然后，在聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜上涂布Mb溶液，干燥后便可獲得Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極。

Mb溶液的濃度為1mg/ml，權(quán)利要求1或2制備的復(fù)合材料與Mb溶液的體積比為10:5。

不同薄膜的表面形貌可以通過SEM來進行觀察，由電鏡分析能夠清楚地知道Mb加入前后薄膜表面形貌的差異，從而有助于分析電子轉(zhuǎn)移受表面形貌特征的影響。

圖1為聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜的SEM圖。圖2為Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜的SEM圖。由圖可以看出，形成了穩(wěn)定的微球結(jié)構(gòu)，而在加入Mb后，Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜表面明顯變得光滑，表明將Mb涂布于聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜表面后兩者間發(fā)生了相互作用，該種相互作用很可能有利于Mb固載于該薄膜中并保持其原有的結(jié)構(gòu)。另外一點，復(fù)合微球薄膜中各物質(zhì)具有良好的生物相容性，這也為Mb提供了較好的微環(huán)境。

圖3圖為不同電極EIS譜的Niquist圖；（a）空白GCE，（b）Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極，（c）多孔CA膜修飾電極。實驗溶液：含有5.0 mM L-1 [Fe(CN)₆]₃-/4-的pH為7.0的緩沖溶液。插圖為Randles等效電路圖。

EIS是一種非常有效的獲得修飾電極表面詳細信息的方法。實驗中三種不同電極EIS譜的Niquist圖形如上圖所示，其中橫坐標（Z^'）表示EIS譜的實部，縱坐標（Z^''）表示EIS譜的虛部。EIS是在0.17 V（vs SCE）的式電位下進行測試，探針分子為[Fe(CN)₆]^3-/4-，掃描時頻率從0.01 Hz到100 kHz。

Niquist圖中電極表面R_ct的數(shù)值大小可通過半圓的直徑反映出來，直徑越大，修飾薄膜對電子傳遞的阻礙作用就越大。R_ct值由Randles等效電路（插圖）模型擬合得到。由擬合結(jié)果可知空白GCE、多孔CA膜修飾電極以及Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極的R_ct值分別為1689 Ω、5528 Ω和3514 Ω。雖然裸電極R_ct值最小，但裸電極不能很好的固載蛋白質(zhì)。為了將Mb更好固載于電極上，選擇合適多孔薄膜來修飾電極。與多孔CA膜修飾電極相比，Mb-聚乙烯醇-聚乙二醇-海藻酸鈣微球復(fù)合膜修飾電極的R_ct下降了近2000 Ω。說明PVA的加入促進了Mb活性中心與電極之間的DET。這主要是歸因于更加穩(wěn)定、均勻、多水的微球結(jié)構(gòu)更好起到了電子通道或?qū)Ь€的作用，使電子轉(zhuǎn)移更加容易進行。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。