1.一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述方法包括以下步驟:
1)尼琦青霉培養(yǎng)和孢子收集
在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種尼琦青霉,培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿尼琦青霉孢子,洗下培養(yǎng)基表面的尼琦青霉孢子,吸出孢子懸液并過(guò)濾去除菌絲,收集含有孢子的濾液,將濾液離心,收集沉淀的休眠孢子;
2)尼琦青霉孢子預(yù)處理
用電擊緩沖液重懸孢子,離心并收集孢子沉淀,重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后,將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中,得到孢子濃度為104-1011個(gè)/ml的尼琦青霉孢子懸液;
所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成,電擊緩沖液的pH為3.0-9.5;
3)使用HDEN法電擊尼琦青霉孢子
在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的尼琦青霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒,混勻,得到孢子與質(zhì)?;旌衔?,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊,將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)粒混合物內(nèi)部,通電,使得孢子與質(zhì)?;旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng),電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后將孢子和質(zhì)粒混合物吸出,得到導(dǎo)入外源DNA的休眠的尼琦青霉孢子;
所述尼琦青霉懸液與待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的比例為:6-600000μl的尼琦青霉孢子懸液:0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒;
所述電擊參數(shù)如下:電壓1-6000V,脈寬2-2000000ms,重復(fù)1-100次,每次間隔5-50000ms。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟1)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟1,)尼琦青霉的培養(yǎng)條件為:溫度16-40℃,濕度15-85%,培養(yǎng)3-15日。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟1),尼琦青霉的培養(yǎng)條件為:溫度25℃,濕度50-60%,培養(yǎng)8日。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟2),電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成,電擊緩沖液的pH為7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟2)的尼琦青霉孢子懸液在電擊前,于顯微鏡下觀察,確認(rèn)孢子懸液中無(wú)菌絲體混雜污染并且孢子均未萌發(fā),然后再進(jìn)行電擊。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為重組質(zhì)粒AnEp8-hygro,所述重組質(zhì)粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8質(zhì)粒構(gòu)建而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),尼琦青霉懸液與重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的比例為:60μl的尼琦青霉孢子懸液:1μg的重組質(zhì)粒 AnEp8-hygro。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于: 所述步驟3),電擊參數(shù)如下:電壓450V,脈寬2500ms,重復(fù)3次,每次間隔400ms。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種直接轉(zhuǎn)化外源DNA進(jìn)入尼琦青霉未萌發(fā)孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),還包括如下處理:將孢子和質(zhì)粒混合物吸出,涂布在含有終濃度為600μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上,于溫度16-40℃,濕度15-85%下培養(yǎng),直至形成單菌落,并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。