本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法。
背景技術(shù)：
里氏木霉是一種真核微生物，屬于絲狀真菌。里氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，加之其工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵條件已比較成熟，這些都促進了對里氏木霉的遺傳改造研究，其可作為表達外源蛋白的宿主。但是對里氏木霉轉(zhuǎn)化外源DNA非常困難，制約了其發(fā)展。
基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建DNA分子，然后導(dǎo)入細胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品（比如將某個具有重要經(jīng)濟價值的酶基因，導(dǎo)入到里氏木霉細胞內(nèi)，做酶蛋白高表達，生產(chǎn)該酶）。這一領(lǐng)域中，很重要的一個環(huán)節(jié)，就是把外來的DNA，導(dǎo)入到細胞內(nèi)部。針對不同物種和不同狀態(tài)的細胞，需要不同的導(dǎo)入方法，才可以讓外來的DNA跨過細胞壁和細胞膜，運送到細胞內(nèi)部。
目前用于絲狀真菌領(lǐng)域（包括里氏木霉）的主要DNA轉(zhuǎn)化方法包括：
1．原生質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（protoplast-mediated transformation）：該方法使用各種酶水解真菌菌絲體的細胞壁，暴露出細胞膜，在一定的化學(xué)條件下，細胞膜可以吸收外源DNA。但是由于真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜，而且不同物種、甚至同一物種的不同亞種的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分都不一樣，因此，無法統(tǒng)一原生質(zhì)體制備的方法，而且，很多真菌，尤其是里氏木霉，原生質(zhì)體制備非常困難，步驟極其繁瑣，而且需要特殊的、昂貴的細胞壁水解酶。
2.根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）：根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性菌，能夠侵染植物愈傷組織和絲狀真菌，將能在細胞中穩(wěn)定遺傳的環(huán)狀質(zhì)粒Ti-DNA插入到宿主的基因組中。但是該方法步驟很繁瑣，耗時長，而且農(nóng)桿菌對宿主有選擇性，并非所有真菌都適合用這種方法。此外，外源DNA插入宿主基因組的位置是隨機的，無法預(yù)判。外源DNA只能插入宿主基因組，不能夠游離地存活在宿主的細胞質(zhì)中。
3．基因槍轉(zhuǎn)化法（Biolistic Transformation）：該方法將DNA吸附在特種金屬顆粒的表面，用火藥爆炸或者高壓氣體加速，將吸附了DNA的金屬顆粒直接送入完整的組織或者細胞。這種方法需要非常昂貴的特殊實驗設(shè)備，而且所用的金屬顆粒耗材常常需要使用黃金材料。此外，該方法轉(zhuǎn)化效率并不高，而且宿主細胞在金屬顆粒轟擊下死亡率高，再生較困難，因此其使用范圍受到限制。
4，電擊轉(zhuǎn)化（Electroporation）：這是一種用電脈沖短暫作用于接觸了外源DNA的細胞，使外源DNA進入細胞，從而使細胞遺傳特性發(fā)生改變的方法。與農(nóng)桿菌法需要農(nóng)桿菌作為介質(zhì)、基因槍法需要金屬顆粒作為介質(zhì)不同，這種方法不需要介質(zhì)來攜帶外源DNA。傳統(tǒng)的電擊法，包括指數(shù)衰減波電擊和方波電擊。指數(shù)衰減波電擊的能量特別大，對細胞的損傷也很大，而微生物細胞由于結(jié)構(gòu)簡單，有細胞壁，細胞抗逆性強，生命力強，而且很多微生物細胞的外殼堅硬，能夠耐受大能量電擊，因此指數(shù)衰減波電擊一般僅用于微生物細胞。而哺乳動物細胞（比如人類細胞系），相對微生物而言，比較脆弱，容易死亡，因此，方波電擊常用于哺乳動物細胞。此外，方波電擊還廣泛應(yīng)用于小動物（如小鼠）的活體電轉(zhuǎn)化。
2013年面世的HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)（high-density distributed electrode network），是一種專門針對哺乳動物細胞的特性，而開發(fā)的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，其開發(fā)目的是為了提高向哺乳動物細胞內(nèi)傳送外源DNA和藥物的效率。該技術(shù)包含3大部分內(nèi)容，一是施加于細胞樣品的電波形式，二是細胞樣品在電擊時的溶液環(huán)境，三是細胞樣品的培養(yǎng)方法和電擊前預(yù)處理方法。由于該技術(shù)是專門針對哺乳動物細胞開發(fā)的，因此，上述3大部分內(nèi)容，都是針對哺乳動物細胞的特性而設(shè)計。
在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，微生物細胞的特性和培養(yǎng)方法，與哺乳動物細胞相比，千差萬別。哺乳動物細胞和微生物細胞的結(jié)構(gòu)不同，哺乳動物細胞沒有細胞壁，微生物細胞（比如絕大部分真菌、包括里氏木霉）有細胞壁。哺乳動物細胞的細胞膜和微生物的細胞膜也不一樣。
因此，任何應(yīng)用于哺乳動物細胞的技術(shù)，都很難直接應(yīng)用于微生物細胞?，F(xiàn)有文獻報道了HDEN技術(shù)在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳動物細胞中的應(yīng)用。目前尚未有該技術(shù)在哺乳動物細胞以外的物種中應(yīng)用的案例報道。因此，HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)能不能應(yīng)用于哺乳動物細胞以外的物種，也是一個未知數(shù)。
絲狀真菌（包括里氏木霉）是一類真核微生物，很多類型的真菌的基因組是多倍體。對生命個體做基因工程改造時，最困難的就是面對多倍體現(xiàn)象。因為對多倍體的改造，常常效率低下（比如基因打靶可能只命中一條染色體，而脫靶另外一條或幾條同源染色體），而且多倍體在分裂繁殖時，同源染色體分離，也很難把改造位點遺傳給所有子代。這在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。
真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠狀態(tài)且可以生存很長時間。孢子在適宜的外界條件下，能夠蘇醒并萌發(fā)，形成菌絲而進行分裂繁殖。最為重要的是，很多類型真菌的孢子，是天然的單倍體，直接對單倍體孢子進行基因工程改造，效率遠遠高于操作多倍體。
但是，由于孢子一般處于休眠狀態(tài)，其細胞壁非常厚實，休眠孢子的細胞壁、細胞膜的狀態(tài)，與萌發(fā)孢子、與菌絲體是不同的。且休眠孢子細胞內(nèi)的生命活動也處于最不旺盛的狀態(tài)，因此，本領(lǐng)域公知，休眠孢子的細胞通透性不如萌發(fā)孢子和菌絲，休眠孢子幾乎不與外界交流物質(zhì)，閉關(guān)鎖國，一般處于睡眠狀態(tài)。而萌發(fā)孢子或菌絲體，需要從外界吸收各種營養(yǎng)分子供給生命活動，因此細胞壁和細胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常難以將外源DNA分子直接導(dǎo)入到睡眠孢子的內(nèi)部。
現(xiàn)有的幾大成熟技術(shù)中：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，作為宿主細胞的原生質(zhì)體的來源，一般是真菌的菌絲體（多倍體）。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，把農(nóng)桿菌和真菌孢子在固體培養(yǎng)基表面共培養(yǎng)數(shù)天，可以把外源DNA導(dǎo)入真菌細胞。但是這種做法并非是直接對孢子進行轉(zhuǎn)化，因為在共培養(yǎng)過程中，真菌孢子會萌發(fā)，然后農(nóng)桿菌侵襲萌發(fā)孢子，才能導(dǎo)入外源DNA。而且農(nóng)桿菌法，需要農(nóng)桿菌作為介導(dǎo)的介質(zhì)，需要先做一個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，才能做后續(xù)的真菌轉(zhuǎn)化，因此操作非常復(fù)雜和繁瑣，且周期長。
傳統(tǒng)的電擊轉(zhuǎn)化法（使用的是指數(shù)衰減波電擊），宿主細胞采用的是萌發(fā)的真菌孢子。例如Ozeki等創(chuàng)立的針對真菌孢子的電擊方法，必須要讓孢子萌發(fā)后，才能電擊轉(zhuǎn)化（該方法披露了讓孢子萌發(fā)的具體實驗步驟和細節(jié)）。該方法是行業(yè)內(nèi)首創(chuàng)的經(jīng)典技術(shù)，目前為止無顯著改進，一直被本領(lǐng)域人員沿用至今。本申請發(fā)明人也嘗試過用該方法轉(zhuǎn)化未萌發(fā)孢子，沒有成功，目前，也沒有任何成功的文獻報道。Ozeki等創(chuàng)立的方法見文獻1：OZEKI K, KYOYA F, HIZUME K, KANDA A, HAMACHI M, NUNOKAWA Y. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(12): 2224-2227.
目前，尚未有任何方法、任何報道，可以做到直接把外源DNA分子在無介質(zhì)介導(dǎo)的情況下，導(dǎo)入休眠的（未萌發(fā)）真菌孢子內(nèi)部。這也是本行業(yè)內(nèi)一直沒有攻克的技術(shù)難題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法，該方法繞過真菌孢子萌發(fā)這個步驟，采用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)，直接用休眠的孢子，來導(dǎo)入外源DNA。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步驟：
1）里氏木霉培養(yǎng)和孢子收集
在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種里氏木霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿里氏木霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的里氏木霉孢子，吸出孢子懸液并過濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；
2）里氏木霉孢子預(yù)處理
用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為104—1011個/ml的里氏木霉孢子懸液；
所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0-9.5；
3）使用HDEN法電擊里氏木霉孢子
在細胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的里氏木霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，混勻，得到孢子與質(zhì)?；旌衔铮瑢⒓毎囵B(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后將孢子和質(zhì)?；旌衔镂觯玫綄?dǎo)入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
所述里氏木霉懸液與待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的比例為：6-600000μl的里氏木霉孢子懸液：0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；
所述電擊參數(shù)如下：電壓1—6000V，脈寬2-2000000ms，重復(fù)1-100次，每次間隔5-50000ms。
進一步，所述步驟1）的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基，優(yōu)選為PDA培養(yǎng)基的效果最好，產(chǎn)孢子最快最多。
所述步驟1，）里氏木霉的培養(yǎng)條件為：溫度16-40℃，濕度15-85%，培養(yǎng)3-15日。
優(yōu)選的，所述步驟1），里氏木霉的培養(yǎng)條件為：溫度24℃，濕度50-60%，培養(yǎng)7日。
進一步，所述步驟2），電擊緩沖液由終濃度為1-10mmol/L的HEPES和終濃度為50-100mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為5.0-7.0；
優(yōu)選的，所述步驟2），電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的HEPES和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。
所述步驟2）的里氏木霉孢子懸液在電擊前，于顯微鏡下觀察，確認孢子懸液中無菌絲體混雜污染并且孢子均未萌發(fā)，然后再進行電擊。
進一步，所述步驟3），待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為重組質(zhì)粒AnEp8-hygro， 所述重組質(zhì)粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8質(zhì)粒構(gòu)建而成，所述電擊采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀。
優(yōu)選的，里氏木霉懸液與重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的比例為：60μl的里氏木霉孢子懸液：1μg的重組質(zhì)粒 AnEp8-hygro。
進一步，所述步驟3），電壓300-3000V，脈寬200-1000000ms，重復(fù)1-50次，每次間隔500-5000ms；優(yōu)選為：電壓600V，脈寬2000ms，重復(fù)3次，每次間隔500ms。
進一步，為了驗證外源DNA已導(dǎo)入里氏木霉休眠孢子，所述步驟3），電擊、再次冰浴后還包括如下步驟：將孢子和質(zhì)粒混合物吸出，涂布在含有終濃度為400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，于溫度16-40℃，濕度15-85%下培養(yǎng)（優(yōu)選為溫度28℃，濕度50-60%下培養(yǎng)），直至形成單菌落，并進行菌落計數(shù)。
所述潮霉素B（hygromycin B，CAS編號：31282-04-9）用滅菌高純水溶解，制備高濃度母液，使用前，按照濃度比例添加到培養(yǎng)基中。
在進行上述實驗步驟的同時，需要制備對照組：將未電擊的、相同的“孢子和質(zhì)?；旌衔铩?，涂布在另外一塊含有400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，相同條件下培養(yǎng)。當此對照組不形成單菌落時，可判斷實驗組的單菌落為陽性克隆。
當實驗組形成單菌落后，提取實驗組單菌落的DNA，使用PCR擴增DNA中可能含有的外源潮霉素B抗性基因，擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳判斷條帶大小，當條帶大小符合預(yù)期后，使用Sanger DNA測序法，確定其DNA序列是否與外源潮霉素B抗性基因吻合。如果吻合，則可以準確判斷陽性克隆是成功的轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明所述里氏木霉為里氏木霉CICC 13052，所述電擊采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀，購買自蘇州壹達生物公司。
本發(fā)明收集未萌發(fā)的孢子，以及后續(xù)的電轉(zhuǎn)實驗過程，若無特殊說明，實驗操作均在不高于23攝氏度的恒溫實驗室中操作，離心步驟均為4℃冷凍離心，接觸未萌發(fā)孢子的各種液體均事先在冰上預(yù)冷。未萌發(fā)孢子嚴禁接觸到任何含有可促使其萌發(fā)的因素和物質(zhì)（比如以YEPD等為代表的萌發(fā)培養(yǎng)基），以保證孢子的休眠狀態(tài)。
本發(fā)明里氏木霉培養(yǎng)過程，當里氏木霉表面長滿孢子（可通過顏色和形態(tài)來判斷）后，向培養(yǎng)基表面倒入無菌水，洗下培養(yǎng)基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過的擦鏡紙（或者砂芯漏斗、濾紙等）過濾，去除菌絲，保留孢子，如果沒有過濾步驟，那么孢子懸液中會混雜有菌絲，后續(xù)步驟得到的轉(zhuǎn)化子，無法判斷究竟是由孢子轉(zhuǎn)化DNA后形成的陽性克隆，還是菌絲轉(zhuǎn)化DNA后形成的假陽性。得到的孢子還要用染色體染色法對其染色體染色，并觀察和確認孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。
本發(fā)明制備固體瓊脂培養(yǎng)基的水應(yīng)該是MillQ級別的分子生物學(xué)用高純水或雙蒸水，水的電阻率不低于18.2MΩ-cm。
使用HDEN法電擊里氏木霉孢子時，在細胞培養(yǎng)板的孔中加入適當比例的里氏木霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，混合勻勻，將容器置于冰上進行冰浴。例如在96孔細胞培養(yǎng)板的孔中（NUNC公司的Nunclon Surface 96孔細胞培養(yǎng)板，貨號Cat.No.167008），加入60μl的里氏木霉孢子懸液，及1μg重組質(zhì)粒AnEp8-hygro。所述細胞培養(yǎng)板也可以是384孔板、24孔板、6孔板、或者其它更大、更小的容器，然后按照容器體積大小比例，放大或縮小孢子和質(zhì)?；旌衔矬w系。
本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，用未萌發(fā)的孢子來作為導(dǎo)入外源分子的起始材料，非常簡便，因為可以省去做孢子萌發(fā)這一復(fù)雜的步驟，更重要的是，萌發(fā)的孢子，可能已經(jīng)產(chǎn)生了多倍體，而未萌發(fā)的孢子，可以保證是單倍體，很多基因工程的應(yīng)用，要求宿主細胞必須是單倍體，才能達到預(yù)想的結(jié)果或者效率。同時，本發(fā)明應(yīng)用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入里氏木霉休眠孢子。HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)采用了高密度矩陣式電極，它能產(chǎn)生高度均勻且強度足夠的電場，電場內(nèi)每個細胞接受電擊的條件幾乎完全一致，操作時，只要把細胞放在通用容器中，比如細胞培養(yǎng)板，再把帶有矩陣式電極的電擊頭插入容器中，通電即可。而傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)技術(shù)一般是使用專用電擊杯，在兩塊平行放置的金屬板之間放置細胞，并對金屬板加電，形成電場電擊。因此，二者的放電方式完全不同，前者的電極插入細胞懸液內(nèi)部，在內(nèi)部產(chǎn)生電場，而后者是在細胞懸液整體的外部產(chǎn)生電場；前者的電極頭由許多金屬針組成，在針與針之間產(chǎn)生電壓，而后者只有兩塊金屬板，一塊正極，一塊負極，在二者之間產(chǎn)生電壓。HDEN技術(shù)還基本消除了傳統(tǒng)電擊技術(shù)的陰極效應(yīng)，避免產(chǎn)生大量氫氧根離子，避免殺傷細胞，提高電擊后的細胞存活率。而傳統(tǒng)電擊技術(shù)很難消除陰極效應(yīng)。另外，傳統(tǒng)的電擊方法一般只電擊1次，因為傳統(tǒng)電擊方法如果電擊多次，那么細胞死亡率會大大增加，而本發(fā)明的HDEN法可以電擊多次，可以疊加多次電擊的效果，并且不會大幅度地增加細胞死亡率。
HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種專門針對哺乳動物細胞的特性而開發(fā)的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，其開發(fā)目的是為了提高向哺乳動物細胞內(nèi)傳送外源DNA和藥物的效率。而在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，微生物細胞的特性和培養(yǎng)方法，與哺乳動物細胞相比，千差萬別。哺乳動物細胞和微生物細胞的結(jié)構(gòu)不同，哺乳動物細胞沒有細胞壁，微生物細胞（比如絕大部分真菌、包括里氏木霉）有細胞壁。哺乳動物細胞的細胞膜和微生物的細胞膜也不一樣。即便是同一種生物，它的不同組織、不同器官或不同的細胞類型，各自的細胞膜、細胞壁的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、化學(xué)成分，也都不一樣。哪怕是同一種生物的同樣的組織、同樣的器官、同樣的細胞類型，在不同的生長發(fā)育階段，或者在不同的外界環(huán)境中，各自的細胞膜、細胞壁的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、化學(xué)成分，也都不一樣。而細胞壁和細胞膜，是阻擋外源分子進入細胞的屏障，屏障不同（結(jié)構(gòu)不同，化學(xué)成分不同），決定了突破屏障的方法也是不同的。此外，不同的外源分子，因為具有不同的結(jié)構(gòu)、分子量、體積和化學(xué)成分，面對相同的屏障時，不同外源分子突破屏障的方法也是不一樣的。如果面對不同的屏障，那么不同外源分子突破不同屏障的方法和機制，更是千差萬別了。
因此，任何應(yīng)用于哺乳動物細胞的技術(shù)，都很難直接應(yīng)用于微生物細胞。目前尚未有HDEN技術(shù)在哺乳動物細胞以外的物種中應(yīng)用的案例報道。本發(fā)明針對里氏木霉細胞的特性，采用HDEN技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入里氏木霉休眠孢子，該方法確定了細胞樣品的培養(yǎng)方法和電擊前預(yù)處理方法，細胞樣品在電擊時的溶液環(huán)境，以及施加于細胞樣品的電波形式。采用本發(fā)明方法非常簡便快速，直接使用野生孢子作為原材料，無需對孢子進行感受態(tài)制備處理，無需用各種繁瑣的方法（如酶水解法）去除孢子的細胞壁，只要把野生孢子洗干凈，再重懸于電擊緩沖液即可，步驟最簡便。傳統(tǒng)方法中的原生質(zhì)體法，需要特殊的細胞壁水解酶，需要復(fù)雜的制備和再生原生質(zhì)體的步驟；傳統(tǒng)的電擊法，需要先把孢子萌發(fā)處理，待其萌發(fā)后才可以電擊轉(zhuǎn)化，而且轉(zhuǎn)化率低;傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌法，需要先做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，才能做后續(xù)的里氏木霉轉(zhuǎn)化；傳統(tǒng)的基因槍法，需要昂貴的耗材，且轉(zhuǎn)化率低。
本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化率高，每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，至少可以達到不少于6000個陽性轉(zhuǎn)化子的效果，例如實施例1用的AnEp8-hygro質(zhì)粒體積是12.4 kb，用1μg 質(zhì)粒（約124.26 fmol 個質(zhì)粒分子），電擊6×106個里氏木霉未萌發(fā)的休眠孢子，能產(chǎn)生不少于8000個陽性轉(zhuǎn)化子。
眾所周知，質(zhì)粒的體積和轉(zhuǎn)化率成反比，體積越大的質(zhì)粒，越不容易穿過細胞壁和細胞膜，本發(fā)明所用的12.4kb的質(zhì)粒屬于超大型質(zhì)粒，現(xiàn)有文獻報道的里氏木霉轉(zhuǎn)化（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化）用的質(zhì)粒體積大部分都在8kb以下。
目前本領(lǐng)域有多種關(guān)于轉(zhuǎn)化率高低的描述方法，包括：多少μg質(zhì)粒能產(chǎn)生多少個陽性轉(zhuǎn)化子；多少個質(zhì)粒（摩爾數(shù)，DNA分子個數(shù)）能產(chǎn)生多少個陽性轉(zhuǎn)化子；多少個宿主細胞能產(chǎn)生多少個陽性轉(zhuǎn)化子，等等。本專利披露了宿主細胞個數(shù)，質(zhì)粒的質(zhì)量，質(zhì)粒的分子個數(shù)，質(zhì)粒的分子量等等各種指標，無論如何評價、用什么方式評價一個轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化率高低，都可以使用本專利披露的這些指標進行計算和換算。
附圖說明
圖1為實施例1使用PCR擴增驗證樣品中是否含有潮霉素抗性基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
以下的實施例便于更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
實驗過程的所有操作均要遵循微生物實驗的無菌操作原則，器皿、耗材、試劑均要滅菌處理。
實施例1
一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步驟：
1）里氏木霉培養(yǎng)和孢子收集
在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種里氏木霉CICC 13052，溫度24℃，濕度50-60%，培養(yǎng)7日，讓培養(yǎng)基表面長滿里氏木霉孢子。
向培養(yǎng)基表面倒入無菌水，洗下（震蕩，或者用光滑的無菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭）培養(yǎng)基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過的擦鏡紙（或者砂芯漏斗、濾紙等）過濾，去除菌絲，保留孢子，濾過的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對其染色體染色，并觀察和確認孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。
2）里氏木霉孢子預(yù)處理
用電擊緩沖液重懸孢子沉淀（加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管），再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認孢子懸液中無菌絲體混雜污染，以及確認孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持里氏木霉孢子懸液中孢子濃度為108個/ml。
所述電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的HEPES和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。
3）使用HDEN法電擊里氏木霉孢子
在96孔細胞培養(yǎng)板的孔中加入60μl的里氏木霉孢子懸液，及1μg重組質(zhì)粒AnEp8-hygro，混勻，得到孢子與質(zhì)?；旌衔?，將容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)粒混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10min，然后將孢子和質(zhì)?；旌衔镂觯玫綄?dǎo)入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本實施例電擊參數(shù)如下：電壓600V，脈寬2000ms，重復(fù)3次，每次間隔500ms。
4）驗證實驗
將上述吸出的孢子和質(zhì)?；旌衔?，涂布在含有終濃度為400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，于溫度28℃，濕度50-60%下培養(yǎng)，直至形成單菌落，并進行菌落計數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。
在進行上述實驗步驟的同時，需要制備對照組：將未電擊的、相同的“孢子和質(zhì)?；旌衔铩?，涂布在另外一塊含有400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，相同條件下培養(yǎng)。對照組不形成單菌落時，因此判斷實驗組的單菌落為陽性克隆。
當實驗組形成單菌落后，提取實驗組單菌落的DNA，使用PCR擴增DNA中可能含有的外源潮霉素B抗性基因，擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳判斷條帶大小，電泳結(jié)果如圖1所示，電泳泳動方向為從下向上，Marker為takara 250bp DNA ladder marker，泳道1是陰性對照，泳道2在1kb左右可見清晰的條帶，該條帶與潮霉素B抗性基因條帶一致，說明轉(zhuǎn)化成功，即泳道2是被擴增的潮霉素B抗性基因條帶。然后使用Sanger DNA測序法，結(jié)果顯示其DNA序列與外源潮霉素B抗性基因吻合，因此可以準確判斷本實施例的陽性克隆是成功的轉(zhuǎn)化子。
本實施例AnEp8-hygro質(zhì)粒體積是12.4 kb，用1μg 質(zhì)粒（約124.26 fmol 個質(zhì)粒分子），電擊6×106個里氏木霉未萌發(fā)的休眠孢子，產(chǎn)生了不少于8000個陽性轉(zhuǎn)化子。
本實施例的重組質(zhì)粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8質(zhì)粒構(gòu)建而成，重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的構(gòu)建方法如下：
潮霉素B抗性基因如SEQ ID NO.1所示。
所編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO.2所示。
使用下述引物，PCR擴增上述潮霉素B抗性基因：
F：CATTAGCTAGCATGAAAAAGCCTGAACTCACCG
R：TCTGGCGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGG
PCR體系（50μL）：模板3μL，引物F（10μM）2μL，引物R（10μM）2μL，2X Taq PCR mix 25μL ，ddH2O補至50μL。
PCR程序：94℃10min，（94℃30s，61.8℃30s，72℃90s）X 35個循環(huán)，72℃10min
對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測無誤后，使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收PCR產(chǎn)物。
AnEp8質(zhì)粒由美國FGSC菌種中心贈送，AnEp8質(zhì)粒的公開見文獻2： STORMS R, ZHENG Y, LI H, SILLAOTS S, MARTINEZ-PEREZ A, TSANG A. Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger [J]. Plasmid, 2005, 53(3): 191-204.
使用文獻2中的AnEp8質(zhì)粒。AnEp8質(zhì)粒序列如SEQ ID NO.3所示。AnEp8質(zhì)粒使用上海生工質(zhì)粒提取試劑盒提取，將AnEp8質(zhì)粒和純化后的潮霉素B抗性基因PCR產(chǎn)物都用Fermentas公司Fastdigest系列限制性內(nèi)切酶Nhe 1和Asc 1內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后（使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收），用T4 DNA連接酶（Fermentas公司產(chǎn)品），將潮霉素B基因和AnEp8質(zhì)粒連接，上述酶切和連接操作均嚴格按照廠家說明書進行。之后再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建重組質(zhì)粒Anep8-hygro。重組質(zhì)粒Anep8-hygro用Sanger測序法測序驗證、以及雙酶切驗證無誤后，大量培養(yǎng)大腸桿菌，用Qiagen公司的質(zhì)粒提取試劑盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit）提取重組質(zhì)粒（按照廠家說明書操作）。
實施例2
一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步驟：
1）里氏木霉培養(yǎng)和孢子收集
在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基），在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種里氏木霉CICC 13052，在溫度16℃，濕度15-50%下，培養(yǎng)15日，讓培養(yǎng)基表面長滿里氏木霉孢子。
向培養(yǎng)基表面倒入無菌水，洗下（震蕩，或者用光滑的無菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭）培養(yǎng)基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過的擦鏡紙（或者砂芯漏斗、濾紙等）過濾，去除菌絲，保留孢子，濾過的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對其染色體染色，并觀察和確認孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。
2）里氏木霉孢子預(yù)處理
用電擊緩沖液重懸孢子沉淀（加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管），再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認孢子懸液中無菌絲體混雜污染，以及確認孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持里氏木霉孢子懸液中孢子濃度為1011個/ml。
所述電擊緩沖液由終濃度為0.01mmol/L的HEPES和終濃度為0.5mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0。
3）使用HDEN法電擊里氏木霉孢子
在96孔細胞培養(yǎng)板的孔中加入6μl的里氏木霉孢子懸液，及0.1μg重組質(zhì)粒AnEp8-hygro，混勻，得到孢子與質(zhì)粒混合物，將容器置于冰上冰浴15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴15min，然后將孢子和質(zhì)?；旌衔镂觯玫綄?dǎo)入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本實施例電擊參數(shù)如下：電壓1V，脈寬2000000ms，重復(fù)100次，每次間隔5ms。
4）驗證實驗
將上述吸出的孢子和質(zhì)?；旌衔?，涂布在含有終濃度為400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，于溫度16℃，濕度15-50%下培養(yǎng)，直至形成單菌落，并進行菌落計數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。
同樣的，在進行上述實驗步驟的同時，需要制備對照組（同實施例1）。
當實驗組形成單菌落后，提取實驗組單菌落的DNA，按照實施例1的方法驗證本實施例的陽性克隆是成功的轉(zhuǎn)化子。
本實施例AnEp8-hygro質(zhì)粒體積是12.4 kb，用0.1μg 質(zhì)粒（約 12.426 fmol 個質(zhì)粒分子），電擊6×108個里氏木霉未萌發(fā)的休眠孢子，產(chǎn)生了不少于6000個陽性轉(zhuǎn)化子。
本實施例的重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的構(gòu)建方法同實施例1 。
實施例3
一種不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法，包括以下步驟：
1）里氏木霉培養(yǎng)和孢子收集
在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種里氏木霉CICC 13052，在溫度40℃，濕度60-85%下，培養(yǎng)3日，讓培養(yǎng)基表面長滿里氏木霉孢子。
向培養(yǎng)基表面倒入無菌水，洗下（震蕩，或者用光滑的無菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭）培養(yǎng)基表面的里氏木霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過的擦鏡紙（或者砂芯漏斗、濾紙等）過濾，去除菌絲，保留孢子，濾過的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對其染色體染色，并觀察和確認孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。
2）里氏木霉孢子預(yù)處理
用電擊緩沖液重懸孢子沉淀（加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管），再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認孢子懸液中無菌絲體混雜污染，以及確認孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持里氏木霉孢子懸液中孢子濃度為104個/ml。
所述電擊緩沖液由終濃度為100mmol/L的HEPES和終濃度為5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。
3）使用HDEN法電擊里氏木霉孢子
在96孔細胞培養(yǎng)板的孔中加入600000μl的里氏木霉孢子懸液，及10000μg重組質(zhì)粒AnEp8-hygro，混勻，得到孢子與質(zhì)粒混合物，將容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部，通電，使得孢子與質(zhì)?；旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場，電擊之后再將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10min，然后將孢子和質(zhì)?；旌衔镂?，得到導(dǎo)入外源DNA的休眠的里氏木霉孢子；
本實施例電擊參數(shù)如下：電壓6000V，脈寬2ms，重復(fù)1次，間隔50000ms。
4）驗證實驗
將上述吸出的孢子和質(zhì)粒混合物，涂布在含有終濃度為400μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上，于溫度40℃，濕度60-85%下培養(yǎng)，直至形成單菌落，并進行菌落計數(shù)，計算轉(zhuǎn)化率。
同樣的，在進行上述實驗步驟的同時，需要制備對照組（同實施例1）。
當實驗組形成單菌落后，提取實驗組單菌落的DNA，按照實施例1的方法驗證本實施例的陽性克隆是成功的轉(zhuǎn)化子。
本實施例AnEp8-hygro質(zhì)粒體積是12.4 kb，用10000μg 質(zhì)粒（約1242600 fmol 個質(zhì)粒分子），電擊6×106個里氏木霉未萌發(fā)的休眠孢子，產(chǎn)生不少于 7000個陽性轉(zhuǎn)化子。
本實施例的重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的構(gòu)建方法同實施例1 。
實施例4
本實施例電擊參數(shù)為：電壓30V，脈寬1000000ms，電擊50次，間隔5000ms，其它同實施例1，產(chǎn)生了不少于6500個陽性轉(zhuǎn)化子。
實施例5
本實施例電擊參數(shù)為：電壓3000V，脈寬100ms，電擊5次，間隔25000ms，其它同實施例1，產(chǎn)生了不少于7200個陽性轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明提供的將外源DNA導(dǎo)入里氏木霉休眠孢子的方式，可以在里氏木霉孢子休眠狀態(tài)下導(dǎo)入任一質(zhì)粒，不僅限于重組質(zhì)粒AnEp8-hygro。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大學(xué)
<120> 不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入里氏木霉休眠孢子的方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaatag 1026
<210> 2
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Glu
340
<210> 3
<211> 6638
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtcttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 60
gctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 120
ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 180
cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 240
cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 300
gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 360
ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 420
cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 480
cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc 540
aggtccgcga atattccgga gatcctgatc atccgtgaga atgaagagga agttgggttt 600
gcgtgcagag accgatggct cctcatccag cagtacctgc tgctgcacag cgagggcatc 660
gcatcccacg aatagggcca acaaagccgg caagaacatc atgatgggag cgacaattcc 720
gtatcaatct cccttgcacg atgttggttg tcactcaccg acactccgtc accaagatca 780
ctattaaaac aagagtgagt tcaaggttgc gatcaagata gcgattgcgc agcaacggca 840
cgggataacg ccatagctct gatggagccg atcagaccag taggtaaact agtcagtcag 900
cgttggactg gagctgcaga gagagttgaa cctggacgcc gcgcaaaaag caaagacgcg 960
cctcgtgggc ggtggatcaa tgatcggatt tagtggcaga tggcatcaca ggcggccaat 1020
gaccaccggg ccaactggcc ccgacattcc agcaatactg cctaattgac tccaccatgc 1080
atctcggcta ttattgaact gggtttgatg gatggggacc ctcttggaat tgtcaaagat 1140
tttgaagcga agacgatcta ttggacggta gagatatact cttgatttag tcgttgggag 1200
gcccctgggg aaagcaatga tggggaatgt tgctgctcca ctgtggacct cggctatgga 1260
attacgtgct tggatctaag atgagctcat ggctatgcat tgaatgacag tgatatcagc 1320
agagcaagca gagaaggatg gaatgctaat tttctagtgc tttgtgcaag ggtaaatcag 1380
ggactgtctg tctggtcttc tacacgaagg gaagaccatg gctttcacgg tgtctgtatt 1440
tccggatatc ctcaattccg tcggtcgatt acaatcacat gacttggctt ccatttcact 1500
actattatgc acacccacta catacatgat catataacca attgccctca tccccatcct 1560
ttaactatag cgaaatggat tgattgtcta ccgccaggtg tcagtcaccg tcgcggtcgg 1620
gccggccggc gcgccgttta aacttaatta agctagctga ttgatctcta ctgaaccggg 1680
ggggaagaca gaagagaagg gattgatgaa gatgggagaa agaatggagg gagagaaggg 1740
aggagaagag ggagagataa tagggaagga aaagacgggg ccggtgagcg agagaagaga 1800
gagatggtgg actagaggag gggtgcccgg gaaggaaaaa tgttggcggc ggtgattggc 1860
tggatcggcc ctttttggtg ggattcctgc tttgggacgc ttttttctgt cggtcggttc 1920
cccgcgggtt gagagctggc ttgttagttg tgcctccagc tacggagtag ttacaatcac 1980
acttcccatc gcctacataa ttcccattat taatgacttt ttctcccccc cggcactatc 2040
gctgggtatc aaaactcaat tatttgctgg gtgatccacc tttcactgct ttgctactat 2100
tctttgatcg tagatacacc tgctgcctcc gtccgctctt ttcactggtc agccaagggt 2160
ttccgcccag cgatcagcag catttgtcca ctacatcctc aggcaccttc cctccgcgca 2220
tctcaggcat tcatacgccg catgcaataa taattggttg ggaagaccaa aagcaattca 2280
cgcccaagcc acaatcagac acccacacaa cattctgcga agtatctggc aggaccacat 2340
gataccctct cactctgtcc agttgacccc acatcgtcgc ggatccattc tctcctagcg 2400
aggtggattt ggatgctttg tcggtgctga attttctcct cgcaaaaaag cccaatgccc 2460
ttcgcaagaa ctatttccct gactccatcg gaacccataa ggctgaattt tgctctgctc 2520
ggacggaccc agttgccagt tatggagaag ctgtctccct ttttattttt attttatttt 2580
atttttttgt ccagtgggta attaatcata gtaatgagga cgagactctg gccagtagac 2640
agggacccta agtaagtact cggaggtttt ctcttccatt tacgcgtggt atatgccctt 2700
cattaatatg gctagtacta ttatgatccc catatatcct tttccgaggc cagacacgtc 2760
catcattcat ctcataaggc taagttcctg accgtccgga cccctccgcc aatggcatca 2820
gatgtgggac gtcccctttt agtcaatacc gttacacatt tccactcaca ctcaaagtcc 2880
aactcttttc tcgtaagctt tccagccttc ctcccggtac ctctgaaccg cctcgactgg 2940
atcgtccgcc ttatagatgc ccctacccgc aatgataaag tccgcacctc gcccaaccgc 3000
cgacccaggt gtctgatact gctgccccag cttatccccc ttatccgaca gattcacccc 3060
agtcgtaaag acgacaaaat cctcgctctc ctctttctgt tcgggcagca cctcactcaa 3120
cgcccttgta ctcacgaatc ccatcacaaa ccccttatac ttccgcgcgt actcaaccga 3180
gcgtgccgtg tactcccctg tcgcaagaga tcccttactc gtcatctcgg caagaatcag 3240
gagacctcgt tgattcgcgt ctttaaagtc aggagacttg gttgtctgtg cgagggcctc 3300
gacgatccct tcgcccggca ggatggcgca gttgatgatg tgtgcccatt cggagatgcg 3360
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