本發(fā)明涉及評價和檢測水處理的消毒方法的有效性，特別涉及一種生活飲用水消毒處理工藝的時效性的評價和檢測方法，屬于水處理領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

有效的消毒工藝是飲用水安全使用的重要保障。近年來，紫外線消毒由于高效、廣譜性好、無消毒副產(chǎn)物等優(yōu)點，漸漸成為一種主流的消毒工藝。與常規(guī)消毒工藝相比，紫外線消毒對部分耐氯性微生物的滅活也體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，從而更有效地保證了水中微生物安全性。評價消毒效果的最重要的指標(biāo)是對微生物去除或是滅活程度的評定。目前，國際通用的對于飲用水微生物檢測的方法是基于平板培養(yǎng)的計數(shù)方法，Siebel等發(fā)現(xiàn)待測自來水中的微生物僅有0.001％～2％的細菌可以通過平板培養(yǎng)得出。同時，傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計數(shù)法檢測時間較長，一般需要兩天至七天。因此，我們需要一種更加快速準(zhǔn)確的檢測手段來解決傳統(tǒng)飲用水微生物檢測方法存在的不足。流式細胞儀應(yīng)用于水環(huán)境微生物的快速檢測可有效避免傳統(tǒng)微生物檢測法存在的弊端。該方法最普通的應(yīng)用是對水中細菌總數(shù)的測定^[7]。采用此方法檢測時間較短，通常僅需要十分鐘，檢測結(jié)果與平板培養(yǎng)計數(shù)法相比高約2個數(shù)量級。

紫外線凈水進行消毒，是采用紫外線照射凈水殺滅凈水中的微生物，在微生物DNA鏈上主要形成嘧啶二聚體等光化學(xué)產(chǎn)物，阻止DNA的復(fù)制，從而使微生物失活，達到消毒的目的。但是形成的嘧啶二聚體可通過多種途徑進行修復(fù)，從而發(fā)生不同程度的復(fù)活，例如通過形成光復(fù)活酶-嘧啶二聚體絡(luò)合物、光復(fù)活酶、修復(fù)好的DNA的釋放等方式導(dǎo)致嘧啶二聚體的解聚，生成嘧啶單體，達到微生物的復(fù)活。光復(fù)活導(dǎo)致的最直接結(jié)果是單位體積水樣中菌數(shù)的增加，凈水消毒效果減弱，凈水消毒的有效性降低。

由于存在光復(fù)活作用，因此紫外線消毒具有時效性。在給水系統(tǒng)中，不僅出廠水要達到水質(zhì)目標(biāo)要求，用戶水也同樣需要達標(biāo)，而自來水一旦離開紫外線消毒區(qū)域，紫外線就不具有對其持續(xù)消毒的效果了，若不進行繼續(xù)消毒，就存在管網(wǎng)二次污染的問題。正是因為這個原因，紫外線消毒方式并未在我國傳統(tǒng)的給水處理中得到大范圍應(yīng)用。

現(xiàn)有評價紫外線處理后光復(fù)活的方法有如下3種：(1)劑量減小因子(Dose Reduction Factor，DRF)法，DRF法不考慮光復(fù)活時微生物達到一定log存活率所需的紫外線照射劑量，僅考慮光復(fù)活時微生物達到同樣log存活率所需的紫外線照射劑量。DRF法已有直接的應(yīng)用，即在考慮光復(fù)活的條件下預(yù)測達到一定消毒效果所需增加的紫外線照射劑量。但是由于不同條件下光復(fù)活發(fā)生與否及發(fā)生的程度均不同，所以該定義還存在模糊的地方，使得不同研究中的結(jié)果不易比較；(2)光復(fù)活率法，光復(fù)活率(％)＝(Npr-N)/(N₀-N)×100％其中，N₀-紫外線照射前的微生物數(shù)；N-紫外線照射后存活的微生物數(shù)；Npr－光復(fù)活后的微生物數(shù)。光復(fù)活率表示光復(fù)活的微生物占紫外線滅活的微生物的百分比。此方法表征了復(fù)活的能力和程度；(3)Log增加法，光復(fù)活的研究中多采用log增加法來定量微生物復(fù)活的程度。Log增加值＝log(Npr/N)；復(fù)活前的存活率為log(N/N₀)；復(fù)活后的存活率為log(Npr/N₀)。

凈水消毒的時效性是指在水樣經(jīng)消毒處理后，水中微生物的含量在一定的停留時間內(nèi)保持不增長的狀態(tài)，使其消毒效能發(fā)揮到最佳水平。

監(jiān)測凈水消毒工藝時效性可以更精確地得到實際待測水樣中的微生物含量的變化，當(dāng)采用紫外-氯聯(lián)合消毒工藝時，可以適當(dāng)調(diào)整加入消毒劑(次氯酸鈉)的時間和投加量，在保證消毒效果的同時也可有效控制及降低氯代消毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生量。若每日消毒劑(次氯酸鈉)的投加量有所降低，則可節(jié)省一定的購置消毒劑費用，從而降低了水廠的運行成本。

目前，現(xiàn)有的關(guān)于凈水消毒工藝時效性監(jiān)測基本只是針對于某些微生物復(fù)活而提出的，而且采用的方法僅限于平板培養(yǎng)計數(shù)法。該方法檢測時間較長，一般需要兩天至七天。另外，微生物的滅活過程存在介于細菌死亡和存活的中間狀態(tài)，這種狀態(tài)下的微生物具有一定的活性但不能被培養(yǎng)出來，若采用平板培養(yǎng)的計數(shù)方法，不能真正反映水體中微生物的含量，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有生活飲用水消毒處理工藝的時效性的評價方法中存在的技術(shù)問題提供一種檢測生活飲用水消毒方法的時效性的方法，本發(fā)明檢測方法利用流式細胞儀檢測給水廠消毒工藝處理后的凈水在一段時間內(nèi)微生物含量；本發(fā)明對生活飲用水消毒方法評價的方法簡單易行，操作簡單，評價監(jiān)測結(jié)果準(zhǔn)確。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種檢測生活飲用水消毒方法時效性的方法，包括采用流式細胞儀檢測給水廠消毒工藝處理后的凈水中的微生物含量。

其中，所述給水廠消毒方法為紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法、氯消毒、二氧化氯消毒方法、次氯酸鈉消毒方法、紫外線-臭氧-氯胺聯(lián)合消毒方法或臭氧-氯胺聯(lián)合消毒方法，優(yōu)選為紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法、次氯酸鈉消毒方法。

特別是，測定給水廠消毒工藝處理后的凈水在消毒處理后48h內(nèi)的微生物含量。

尤其是，測定給水廠消毒工藝處理后的凈水在消毒處理后0、2、4、6、8、24、48h的微生物含量。

本發(fā)明另一方面提供一種檢測生活飲用水消毒方法時效性的方法，包括如下順序進行的步驟：

1)在無菌條件下，精密量取生活飲用水消毒處理后的出水，并置于滅菌后的離心管中；

2)在無菌狀態(tài)下向離心管中加入可以穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合的染料和僅能穿過細胞膜不完整的細胞的染料，混合均勻后，于黑暗狀態(tài)下靜止放置至少5min，進行染色處理，獲得染色水樣；

3)將染色水樣置于流式細胞儀的樣品管內(nèi)，測定水樣在(533±15)nm和>670nm的熒光強度，獲得水樣中微生物的含量。

其中，步驟1)中所述量取的出水水樣的體積為200ul；步驟2)中所述可以穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合的染料選擇染料噻唑橙(TO)或核苷酸膠體染料(SYBR GREEN)；所述僅能穿過細胞膜不完整的細胞的染料選擇染料碘化丙啶(PI)或7-氨基放線菌素D(7-AAD)。

特別是，步驟2)中所述的加入的可以穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合的染料與步驟2)中取出的待檢測水樣的體積之比為4-6：200，優(yōu)選為2.5：100；所述的加入的僅能穿過細胞膜不完整的細胞的染料與步驟2)中取出的待檢測水樣的體積之比為4-6：200，優(yōu)選為2.5：100。

尤其是，步驟2)中加入染料后，黑暗狀態(tài)下靜止放置時間為5min，使得染料與水樣中的微生物充分接觸，染料與微生物細胞DNA結(jié)合。

本發(fā)明中通過細胞熒光標(biāo)記染料與水體中微生物DNA結(jié)合，完成對水體中微生物進行計數(shù)。細胞熒光標(biāo)記染料為TO和PI，其中TO可以標(biāo)記水中所有微生物，包括死的、受損傷的和活性良好的。其可以透過各種狀態(tài)微生物的細胞膜并與DNA進行結(jié)合。其替代染料為SYBR GREEN。通過測定(533±15)nm熒光進行檢測。PI只可以標(biāo)記水中死的或受損傷的微生物。不能標(biāo)記活性良好的微生物。其只可以透過受損傷或死亡的微生物的細胞膜，與DNA進行結(jié)合，不能透過活性良好微生物的細胞膜。其替代染料為7-AAD，通過測定(>670nm)熒光進行檢測。

特別是，還包括對精密量取的生活飲用水消毒處理后的出水進行消氯處理步驟1A)，即向生活飲用水消毒處理后的出水中添加消氯劑，去除水樣中的余氯，對水樣進行消氯處理，將消氯處理后的水樣作為待檢測水樣，然后再在無菌條件下精密量取待檢測水樣于滅菌后的離心管中，再進行后續(xù)染色處理。

尤其是，步驟1)中所述量取的消氯處理后的水樣的體積為200ul，然后置于滅菌的離心管中，再加入所述可以穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合的染料和僅能穿過細胞膜不完整的細胞的染料。

其中，步驟1A)中所述消氯劑選擇濃度為3.5g/L的硫代硫酸鈉溶液。

特別是，所述硫代硫酸鈉溶液按照如下方法配制而成：將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，控制每1L純水中加入3.5gNa₂S₂O₃·5H₂O，即得濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液。

其中，步驟1A)中所述消氯處理包括如下步驟：

1A-1)配制消氯劑

將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，配制成濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液；

1A-2)余氯含量測定

精密移取生活飲用水消毒處理后的出水，作為消氯水樣；接著按照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》中的方法測定生活飲用水消毒工藝處理后精密移取是消氯的水樣中的余氯含量；

1A-3)按照公式(Ⅰ)計算消氯水樣中添加的消氯劑的用量：

向消氯水樣中加入相應(yīng)的消氯劑用量，攪拌均勻，去除水樣中余氯，進行所述的消氯處理。

本發(fā)明再一方面提供一種檢測生活飲用水消毒方法時效性的方法，包括如下順序進行的步驟：

1)采集生活飲用水消毒工藝處理后的出水，并對出水進行消氯處理，獲得消氯水樣；

2)在無菌條件下，精密量取消氯水樣，并置于滅菌后的離心管中；

3)在無菌狀態(tài)下向離心管中加入可以穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合的染料和僅能穿過細胞膜不完整的細胞的染料，混合均勻后，于黑暗狀態(tài)下靜止放置至少5min，進行染色處理，獲得染色水樣；

4)將染色水樣置于流式細胞儀的樣品管內(nèi)，測定水樣在(533±15)nm和>670nm的熒光強度，獲得水樣中微生物的含量。

其中，步驟1)中所述消氯劑選擇濃度為3.5g/L的硫代硫酸鈉溶液。

特別是，所述硫代硫酸鈉溶液按照如下方法配制而成：將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，控制每1L純水中加入3.5gNa₂S₂O₃·5H₂O，即得濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液。

尤其是，步驟1)中所述消氯處理包括如下步驟：

1-1)配制消氯劑

將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，配制成濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液；

1-2)余氯含量測定

精密移取生活飲用水消毒處理后的出水，作為消氯水樣；接著按照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)》中的方法測定生活飲用水消毒工藝處理后精密移取是消氯的水樣中的余氯含量；

1-3)按照公式(Ⅰ)計算消氯水樣中添加的消氯劑的用量：

向消氯水樣中加入相應(yīng)的消氯劑用量，攪拌均勻，去除水樣中余氯，進行所述的消氯處理。

其中，步驟2)中精密量取的消氯水樣的體積為200ul。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和好處：

1、本發(fā)明的檢測方法是采用流式細胞儀在不同的停留時間下對待測水樣染色后進行上機檢測。采用流式細胞儀檢測避免了現(xiàn)有的生活飲用水中微生物含量測定中耗時費力的問題。

2、本發(fā)明方法檢測時間短，檢測效率高，利用本方法，僅在30分鐘內(nèi)即可完成檢測，實現(xiàn)了水中微生物含量的快速定量測定。

3、利用本發(fā)明方法可以快速直接地判別微生物的存活狀態(tài)。

4、本發(fā)明方法操作步驟簡單，檢測用時短，在水中微生物檢測及水環(huán)境微生物學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

5、本發(fā)明的檢測生活飲用水消毒方法時效性的方法簡單易行，操作步驟簡單，檢測時間較短，檢測效果穩(wěn)定，可靠，可用于水處理中微生物的。

6、利用本發(fā)明方法檢測凈水消毒工藝的時效性可更精準(zhǔn)地把握后續(xù)次氯酸鈉的投加時間及投加量，與現(xiàn)行的消毒劑投加方式相比更科學(xué)有效，能夠節(jié)省一定的消毒劑購置費用，進而降低了給水廠的運營成本。

附圖說明

圖1為實施例1單獨次氯酸鈉消毒處理后凈水中微生物含量與停留時間的關(guān)聯(lián)圖；

圖2為實施例2低壓紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒處理后凈水中微生物含量與停留時間的關(guān)聯(lián)圖；

圖3為實施例3中壓紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒處理后凈水中微生物含量與停留時間的關(guān)聯(lián)圖；

圖4為單獨次氯酸鈉消毒處理后凈水中余氯含量與停留時間的關(guān)聯(lián)圖；

圖5為紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒處理后凈水中余氯含量與停留時間的關(guān)聯(lián)圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

下述實施例中的方法，無特別說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明實施例中使用的試劑、儀器如下：

實施例1 常規(guī)次氯酸鈉消毒工藝的時效性監(jiān)測

1、水樣采集

使用已消毒的采樣瓶對某自來水廠的炭池出水進行采集，每個采樣瓶中的水樣為500ml；

2、水樣消毒處理

將采集的水樣為6組，依次加入次氯酸鈉消毒劑，第1-6組加入的次氯酸鈉消毒劑的濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L，并分別進行相應(yīng)的標(biāo)記；加入消毒劑混合均勻，靜止放置30min，進行消毒處理，獲得消毒水樣；

本發(fā)明實施例中向自來水廠的炭池出水中添加次氯酸鈉消毒劑，模擬自來水廠次氯酸鈉消毒工藝。

國內(nèi)正常運行的水廠中有99.5％采用次氯酸鈉作為消毒劑的消毒工藝。為了能更好地模擬實際水廠運行中的情況，故選用次氯酸鈉作為消毒劑。一般出廠水的余氯濃度在0.6mg/L～1.0mg/L，另外，根據(jù)《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》提到的城市管網(wǎng)末梢的余氯濃度不應(yīng)低于0.05mg/L，故本發(fā)明實施例中消毒劑濃度定為0mg/L～1.0mg/L。實驗中選取的消毒劑濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L。

3、流式細胞儀檢測

3-1)水樣預(yù)處理

分別從各采樣瓶的消毒水樣中精密移取100ml消毒水樣作為消氯水樣，接著采用Hach的便攜式余氯儀分別測定1-6組消氯水樣中的余氯含量，測定結(jié)果如表1所示；

表1 消毒處理0h后消毒水樣的余氯含量(mg/L)檢測結(jié)果

硫代硫酸鈉溶液的配制：將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，配制成濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液；

向移取的100ml消氯水樣中分別加入消氯劑硫代硫酸鈉溶液，去除水樣中的余氯，對水樣進行消氯處理，獲得各待檢測水樣(100ml)；其中：加入的硫代硫酸鈉溶液用量按照公式(Ⅰ)計算：

通常加入的消氯劑的量稍微過量。消氯劑硫代硫酸鈉與水樣中的余氯發(fā)生氧化還原反應(yīng)，去除水樣中的余氯。

對經(jīng)過消毒處理的水樣進行消氯處理，可避免水樣中殘余的氯對采用流式細胞儀檢測時對熒光的影響，確保檢測出的數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。

本發(fā)明實施例中將經(jīng)過消毒處理后的水樣加入到購自Crystalgen公司的“一次性細菌瓶”，對水樣進行消氯處理，獲得待檢測水樣；該“一次性細菌瓶”中已添加有消氯劑硫代硫酸鈉溶液且稍微過量，可以去除水樣中殘余的氯。

3-2)將待檢測水樣分別置于渦旋震蕩儀中進行震蕩處理，使得水樣均勻；

3-3)將震蕩混勻的水樣分別置于生物安全柜中，并分別在消毒處理后0、2、4、6、8、24、48h用移液槍分別取出200ul水樣，然后置于相對應(yīng)的滅菌后的1.5ml離心管中；

3-4)在生物安全柜中分別向離心管內(nèi)加入cell viability kit染料套裝(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)中的染料噻唑橙(TO)和染料碘化丙啶(PI)各5ul，并震蕩混合均勻；然后于黑暗狀態(tài)下，室溫(20-35℃)下反應(yīng)5min，使染料與水樣中的微生物進行充分接觸，與微生物DNA結(jié)合；

其中，染料套裝中的染料TO的作用是穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合；染料PI的作用是僅能穿過細胞的不完整細胞膜與DNA結(jié)合。

3-5)將反應(yīng)后的樣品置于C6流式細胞儀(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)的樣品管內(nèi)，進行檢測，檢測過程中設(shè)置流式細胞儀進樣量為100ul，檢測速度為SLOW，通過檢測樣品在(533±15)nm、>670nm的熒光強度值，即檢測水樣在C6流式細胞儀的FL1(533nm±15)熒光通道和FL3(>670nm)熒光通道的熒光強度值，然后計算獲得水樣中微生物的數(shù)量，測定結(jié)果如圖1所示。

實驗通過細胞熒光標(biāo)記染料與水體中微生物DNA結(jié)合，完成對水體中微生物進行計數(shù)。

細胞熒光標(biāo)記染料為TO和PI，其中TO可以標(biāo)記水中所有微生物，包括死的、受損傷的和活性良好的。其可以透過各種狀態(tài)微生物的細胞膜并與DNA進行結(jié)合。其替代染料為SYBR GREEN。通過FL1(533nm±15)熒光通道進行檢測。

PI只可以標(biāo)記水中死的或受損傷的微生物。不能標(biāo)記活性良好的微生物。其只可以透過受損傷或死亡的微生物的細胞膜，與DNA進行結(jié)合，不能透過活性良好微生物的細胞膜。其替代染料為7-AAD，通過FL3(>670)熒光通道進行檢測。

從圖1可看出常規(guī)消毒工藝(單獨次氯酸鈉消毒)的除菌效果隨著停留時間的延長(0-48h內(nèi))，存活的微生物數(shù)量有所增長。同時，隨著加入的消毒劑的濃度升高，微生物數(shù)量增長幅度逐漸趨于緩慢。在較低投加量時的存活的微生物數(shù)量隨著時間的延長顯著增加，這可能是水中的余氯隨時間的增加而逐漸衰減，導(dǎo)致水中的余氯較低，促使微生物數(shù)量增長明顯；而在較高投加量時活的微生物數(shù)量隨時間的延長增長速度則變緩。另外，若想保證存活的微生物數(shù)量維持在較低的水平，需要消毒劑的投加量保持在1.0mg/L以上。該種消毒方法的時效性直接與所加入的消毒劑的濃度成正比關(guān)系。

實施例2 紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒工藝的時效性監(jiān)測

1、水樣采集

水樣采集自設(shè)置在某自來水廠的紫外消毒系統(tǒng)的出水，該紫外消毒系統(tǒng)是采用低壓紫外汞燈進行照射、消毒的，該設(shè)備的紫外消毒劑量為40mJ/cm²，水樣使用已高溫滅菌后的采樣瓶進行采集，每個采樣瓶中的水樣為500mL；

2、水樣消毒處理

將采集的水樣為6組，依次加入次氯酸鈉消毒劑，第1-6組加入的次氯酸鈉消毒劑的濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L；并分別進行相應(yīng)的標(biāo)記；加入消毒劑混合均勻，靜止放置30min，進行消毒處理，獲得消毒水樣；

本發(fā)明實施例中向自來水廠的紫外線消毒系統(tǒng)出水中添加次氯酸鈉消毒劑，模擬自來水廠紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒工藝。

3、流式細胞儀檢測

3-1)水樣預(yù)處理

分別從各采樣瓶的消毒水樣中精密移取100ml消毒水樣作為消氯水樣，接著采用Hach的便攜式余氯儀分別測定1-6組消氯水樣中的余氯含量，測定結(jié)果如表1所示；

硫代硫酸鈉溶液的配制：將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，配制成濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液；

向移取的100ml消氯水樣中分別加入消氯劑硫代硫酸鈉溶液，去除水樣中的余氯，對水樣進行消氯處理，獲得各待檢測水樣(100ml)；其中：加入的硫代硫酸鈉溶液用量按照公式(Ⅰ)計算：

通常加入的消氯劑的量稍微過量。

3-2)將待檢測水樣分別置于渦旋震蕩儀中進行震蕩處理，使得水樣均勻；

3-3)將震蕩混勻的水樣分別置于生物安全柜中，并分別在消毒處理后0、2、4、6、8、24、48h用移液槍分別取出200ul水樣，然后置于相對應(yīng)的滅菌后的1.5ml離心管中；

3-4)在生物安全柜中分別向離心管內(nèi)加入cell viability kit染料套裝(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)中的染料噻唑橙(TO)和染料碘化丙啶(PI)各5ul，并震蕩混合均勻；然后于黑暗狀態(tài)下，室溫(20-35℃)下反應(yīng)5min，使染料與水樣中的微生物進行充分接觸，與微生物DNA結(jié)合；

其中，染料套裝中的染料TO的作用是穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合；染料PI的作用是僅能穿過細胞的不完整細胞膜與DNA結(jié)合。

3-5)將反應(yīng)后的樣品置于C6流式細胞儀(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)的樣品管內(nèi)，進行檢測，檢測過程中設(shè)置流式細胞儀進樣量為100ul，檢測速度為SLOW，通過檢測樣品在(533±15)nm、>670nm的熒光強度值，即檢測水樣在C6流式細胞儀的FL1(533nm±15)熒光通道和FL3(>670nm)熒光通道的熒光強度值，然后計算獲得水樣中微生物的數(shù)量，測定結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可看出若采用單獨紫外消毒工藝，紫外消毒后的水在停留24小時內(nèi)，隨存放時間的延長，水中存活的微生物數(shù)量逐漸降低，待停留48小時后，存活的微生物數(shù)量僅有少量的增長。若采用紫外-氯聯(lián)合消毒工藝，不論消毒劑的投加量的高低，在24小時內(nèi)，水中存活的微生物量均不隨著停留時間的延長而增加，仍舊保持著降低的趨勢。當(dāng)消毒劑的投加量不小于0.8mg/L時，水中存活的微生物數(shù)量在48小時內(nèi)均維持在同一水平。另外，隨著消毒劑投加量的增加，水中的微生物的衰減速率也有所加快。采用單獨紫外消毒或紫外-氯聯(lián)合消毒的方式，在24小時內(nèi)微生物含量可保持不增長的趨勢，由此表現(xiàn)出單獨紫外消毒方式或紫外-氯聯(lián)合消毒方式具有時效性。

實施例3 紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒工藝的時效性監(jiān)測

1、水樣采集

水樣采集自某自來水廠的中壓紫外消毒系統(tǒng)的出水，該紫外消毒系統(tǒng)是采用中壓汞燈進行照射、消毒，該設(shè)備的紫外消毒劑量為40mJ/cm²，水樣使用已高溫滅菌后的采樣瓶進行采集，每個采樣瓶中的水樣為500mL。

2、水樣消毒處理

將采集的水樣為6組，依次加入次氯酸鈉消毒劑，第1-6組加入的次氯酸鈉消毒劑的濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L；并分別進行相應(yīng)的標(biāo)記；加入消毒劑混合均勻，靜止放置30min，進行消毒處理，獲得消毒水樣；

3、流式細胞儀檢測

3-1)水樣預(yù)處理

分別從各采樣瓶的消毒水樣中精密移取100ml消毒水樣作為消氯水樣，接著采用Hach的便攜式余氯儀分別測定1-6組消氯水樣中的余氯含量，測定結(jié)果如表1所示；

硫代硫酸鈉溶液的配制：將Na₂S₂O₃·5H₂O加入到純水中，攪拌溶解，配制成濃度為3.5g/L的消氯劑硫代硫酸鈉溶液；

向移取的100ml消氯水樣中分別加入消氯劑硫代硫酸鈉溶液，去除水樣中的余氯，對水樣進行消氯處理，獲得各待檢測水樣(100ml)；其中：加入的硫代硫酸鈉溶液用量按照公式(Ⅰ)計算：

通常加入的消氯劑的量稍微過量。

3-2)將待檢測水樣分別置于渦旋震蕩儀中進行震蕩處理，使得水樣均勻；

3-3)將震蕩混勻的水樣分別置于生物安全柜中，并分別在消毒處理后0、2、4、6、24、48h用移液槍分別取出200ul水樣，然后置于相對應(yīng)的滅菌后的1.5ml離心管中；

3-4)在生物安全柜中分別向離心管內(nèi)加入cell viability kit染料套裝(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)中的染料噻唑橙(TO)和染料碘化丙啶(PI)各5ul，并震蕩混合均勻；然后于黑暗狀態(tài)下，室溫(20-35℃)下反應(yīng)5min，使染料與水樣中的微生物進行充分接觸，與微生物DNA結(jié)合；

其中，染料套裝中的染料TO的作用是穿過任何細胞膜與DNA結(jié)合；染料PI的作用是僅能穿過細胞的不完整細胞膜與DNA結(jié)合。

3-5)將反應(yīng)后的樣品置于C6流式細胞儀(美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司)的樣品管內(nèi)，進行檢測，檢測過程中設(shè)置流式細胞儀進樣量為100ul，檢測速度為SLOW，通過檢測樣品在(533±15)nm、>670nm的熒光強度值，即檢測水樣在C6流式細胞儀的FL1(533nm±15)熒光通道和FL3(>670nm)熒光通道的熒光強度值，然后計算獲得水樣中微生物的數(shù)量，測定結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可看出若采用單獨紫外消毒工藝，紫外消毒后的水在停留24小時內(nèi)，隨存放時間的延長，水中存活的微生物數(shù)量逐漸降低，待停留48小時后，存活的微生物數(shù)量有所增長。若采用紫外-氯聯(lián)合消毒工藝，不論消毒劑的投加量的高低，在24小時內(nèi)，水中存活的微生物量均不隨著停留時間的延長而增加，仍舊保持著降低的趨勢。隨著加入的消毒劑濃度的提高，待停留24-48小時內(nèi)，微生物的增長趨勢逐漸變緩。當(dāng)消毒劑的投加量不小于0.8mg/L時，水中存活的微生物數(shù)量在48小時內(nèi)均維持在同一水平。另外，隨著消毒劑投加量的增加，水中的微生物的衰減速率也有所加快。

采用中壓紫外-氯聯(lián)合消毒的方式，在停留24小時內(nèi)微生物含量可保持不增長的趨勢，由此也可表現(xiàn)出中壓紫外-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方式具有時效性。

實施例4 常規(guī)次氯酸鈉消毒工藝的時效性監(jiān)測—余氯衰減

1、水樣采集

使用已消毒的采樣瓶對某自來水廠的炭池出水進行采集，每個采樣瓶中的水樣為500ml；

2、水樣消毒處理

將采集的水樣為6組，依次加入次氯酸鈉消毒劑，第1-6組加入的次氯酸鈉消毒劑的濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L；并分別進行相應(yīng)的標(biāo)記；加入消毒劑混合均勻，靜止放置30min，進行消毒處理，獲得消毒水樣；

3、余氯含量測定

采用Hach的便攜式余氯儀進行水樣中的余氯檢測，方法如下：

對消毒處理后的消毒水樣，分別于消毒后0、2、4、6、8、24、48h取樣(5ml)；接著將所取水樣加入到Hach的便攜式余氯儀的測試瓶中；然后加入游離氯的測試藥包(DPD Free Chlorine Reagent),與水樣混勻，隨后放到便攜式余氯儀中進行檢測即可得到待測水樣的余氯值。水樣中余氯含量測定結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：當(dāng)初始加氯量為不高于0.4mg/L時，2小時后單獨采用次氯酸鈉消毒方法的凈水中余氯值可以維持在0.1mg/L左右。

當(dāng)加氯量提高到0.8mg/L和1.0mg/L時，2小時單獨采用次氯酸鈉消毒方法的凈水中余氯則分別為0.49mg/L和0.68mg/L。

測試余氯的衰減是由于在凈水廠出廠前需停留幾小時，而且對出廠水的余氯是有界定標(biāo)準(zhǔn)的，一般出廠水的余氯濃度在0.6mg/L～1.0mg/L，若要達到此標(biāo)準(zhǔn)，并且有效監(jiān)控微生物的含量，因此對常規(guī)消毒工藝的時效性進行監(jiān)測。兩種監(jiān)測方式相結(jié)合，可更準(zhǔn)確有效的確定消毒劑的投加時間及投加量。

實施例5 紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒工藝的時效性監(jiān)測-余氯衰減

1、水樣采集

水樣采集自設(shè)置在某自來水廠的紫外消毒系統(tǒng)，該紫外消毒系統(tǒng)是采用低壓紫外汞燈進行照射、消毒的，該設(shè)備的紫外消毒劑量為40mJ/cm²，水樣使用已高溫滅菌后的采樣瓶進行采集，每個采樣瓶中的水樣為500mL；

2、水樣消毒處理

將采集的水樣為6組，依次加入次氯酸鈉消毒劑，第1-6組加入的次氯酸鈉消毒劑的濃度依次為0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1.0mg/L；并分別進行相應(yīng)的標(biāo)記；加入消毒劑混合均勻，靜止放置30min，進行消毒處理，獲得消毒水樣；

3、余氯含量測定

采用Hach的便攜式余氯儀進行水樣中的余氯檢測，方法如下：

對消毒處理后的消毒水樣，分別于消毒后0、2、4、6、8、24、48h取樣(5ml)；接著將所取水樣加入到Hach的便攜式余氯儀的測試瓶中；然后加入游離氯的測試藥包(DPD Free Chlorine Reagent),與水樣混勻，隨后放到便攜式余氯儀中進行檢測即可得到待測水樣的余氯值。水樣中余氯含量測定結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：當(dāng)初始加氯量為不高于0.4mg/L時，2小時后紫外-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法的凈水中余氯值僅在0.05mg/L以內(nèi)。

當(dāng)加氯量提高到0.8mg/L和1.0mg/L時，2小時紫外-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法的凈水中余氯分別為0.35mg/L和0.56mg/L。

紫外-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法的凈水中余氯衰減速率相對單獨采用次氯酸鈉消毒方法更快，可能是經(jīng)紫外照射后，氯更能高效的產(chǎn)生羥基自由基和氯自由基，因而比單獨采用次氯酸鈉消毒方法會氯耗更大。

測試余氯的衰減是由于在凈水廠出廠前需停留幾小時，而且對出廠水的余氯是有界定標(biāo)準(zhǔn)的，一般出廠水的余氯濃度在0.6mg/L～1.0mg/L，若要達到此標(biāo)準(zhǔn)，并且有效監(jiān)控微生物的含量，因此對紫外線-次氯酸鈉聯(lián)合消毒工藝的時效性進行監(jiān)測。兩種監(jiān)測方式相結(jié)合，可更準(zhǔn)確有效的確定消毒劑的投加時間及投加量。

結(jié)合實施例1、2兩種消毒方式的凈水中微生物含量檢測結(jié)果圖1和圖2來看，在采用單獨次氯酸鈉消毒方法時，氯消毒劑的投加量要高于1.0mg/L才能保證水中的微生物數(shù)量在48小時內(nèi)基本維持在同一水平；而采用紫外-次氯酸鈉聯(lián)合消毒方法時，氯消毒劑的投加量不低于0.8mg/L時，即可保證48小時內(nèi)微生物的數(shù)量不增長。另外，通過紫外-氯聯(lián)合消毒的效果圖2中可看出，在僅有少量余氯存在的情況下，微生物的滅活效果就能得以保證。因此，可以考慮在采用紫外-氯消毒的工藝時，適當(dāng)降低消毒劑的投加量。

對比不同的消毒方式，在保證微生物數(shù)量不增長的情況下，單獨氯消毒方式需要氯的投加量不低于1.0mg/L，否則微生物在2小時內(nèi)就會有不同速率的增長，因此，可認為單獨氯消毒方式的時效性僅與加入的消毒劑濃度有關(guān)。

采用單獨紫外消毒方式進行消毒，在停留24小時內(nèi)可保證微生物數(shù)量不增長，可看出紫外消毒具有時效性。采用紫外-氯聯(lián)合消毒方式進行消毒，在停留24小時內(nèi)不論加入的消毒劑濃度的高低均能保持微生物不增長的趨勢，若想微生物不增長的趨勢保持得更長久，則需要考慮加入較高濃度的消毒劑，也同樣反映出此種消毒方式的消毒具有時效性。