本申請屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及硫酸軟骨素四糖的合成方法及其中間體化合物。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素是體內(nèi)廣泛存在的一種糖胺聚糖，其結(jié)構(gòu)由葡萄糖醛酸與N-乙酰氨基半乳糖構(gòu)成，在其結(jié)構(gòu)中羥基可存在不同程度的硫酸化，因而稱之為硫酸軟骨素。硫酸軟骨素與細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白共價結(jié)合形成蛋白聚糖，廣泛分布于細(xì)胞間隙，是一種十分重要的糖胺聚糖。硫酸軟骨素參與了體內(nèi)很多極為重要的生化過程，例如：參與了細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，抑制神經(jīng)軸突的再生，影響癌細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞外眾多細(xì)胞因子發(fā)生結(jié)合等。
近年來，人們發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素的不同亞型，即在特定羥基上具有不同硫酸化修飾的硫酸軟骨素A，C，E可介導(dǎo)不同的生理學(xué)功能。例如，硫酸軟骨素E可顯著性抑制背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長，而硫酸軟骨素A和C則無此作用。為研究不同硫酸化位點與硫酸化數(shù)目對硫酸軟骨素生物學(xué)功能的影響，需首先解決這些具有特定硫酸化方式的硫酸軟骨素的可獲得性問題。傳統(tǒng)的通過從天然來源提取，例如從動物的軟骨中提取，只能獲得不同類型硫酸軟骨素的混合物，進(jìn)一步的分離純化難以進(jìn)行。這些提取物可以滿足一定程度的藥物化學(xué)研究需要，例如可用于骨關(guān)節(jié)病的治療等。然而，具有不同硫酸化位點的混合物并不能滿足更深層次的藥化研究。因此，化學(xué)合成是目前獲取有明確硫酸化位點，且結(jié)構(gòu)均一的能夠進(jìn)行更深層次的生物學(xué)與藥化研究的硫酸軟骨素的唯一有效的方法。
現(xiàn)有技術(shù)中，通過化學(xué)手段合成硫酸軟骨素常以葡萄糖醛酸以及N-乙酰氨基半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖單糖為原料，通過常規(guī)的保護(hù)基保護(hù)還有糖基化操作來進(jìn)行寡糖的組裝(Jean-Claude Jacquinet et al,From Polymer to Size-Defined Oligomers:A Highly Divergent and Stereocontrolled Construction of Chondroitin Sulfate A,C,D,E,K,L,and M Oligomers from a Single Precursor:Part 2.Chem.Eur.J.2009,15,9579-9595.)。這樣的策略合成步驟多，路線長，由于涉及糖基化操作而導(dǎo)致整條路線的收率偏低。目前，僅合成硫酸軟骨素四糖就需要約23步反應(yīng)，收率不足1％。因此，開發(fā)新的硫酸軟骨素寡糖的化學(xué)合成方法，對于促進(jìn)硫酸軟骨素的藥化研究具有重要意義。
目前，在硫酸軟骨素的合成后期均需涉及到對已經(jīng)構(gòu)建好的寡糖骨架上的裸露羥基進(jìn)行磺酸化以及最后全糖的脫保護(hù)。因此，如何快速構(gòu)建可進(jìn)行硫酸化修飾的寡糖中間體是亟待解決的問題。本申請的目標(biāo)即提供這樣一種可直接進(jìn)行后續(xù)硫酸化修飾的寡糖中間體的合成方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本申請的發(fā)明人以較易生產(chǎn)、較易提取得到的透明質(zhì)酸鈉為原料，通過對原料進(jìn)行水解、化學(xué)修飾得到了可用于硫酸軟骨素A，C，E三種四糖合成的關(guān)鍵中間體，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的不足。
本申請的第一個目的是提供一種硫酸軟骨素四糖的合成方法。
本申請的第二個目的是提供用于上述合成方法的中間體化合物。
在本申請的實施方案中，提供了一種硫酸軟骨素四糖的合成方法，所述方法包括硫酸軟骨素四糖關(guān)鍵中間體的合成，包括如下步驟：
(1)式A化合物(即透明質(zhì)酸M鹽)在含有氯化鈉的弱酸性緩沖溶液中，在透明質(zhì)酸酶的作用下得到式B化合物；這里，所述的透明質(zhì)酸酶來源于動物睪丸，活力400-1000IU/mg；優(yōu)選地，選自牛睪丸或綿羊睪丸；更優(yōu)選地為牛睪丸；
(2)式B化合物在無機(jī)酸的醇R1OH溶液中進(jìn)行酯化反應(yīng)，對式B化合物的羧基進(jìn)行酯化；而后利用酸酐R2-O-R2，在堿性條件下對式B化合物其余的所有羥基進(jìn)行酰化保護(hù)，得到式C化合物；
這里，酸酐R2-O-R2中，R2選自脂肪族?；?、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲?；?/p>
(3)式C化合物在堿存在下，在有機(jī)溶劑中選擇性脫除還原端N-乙酰氨基葡萄糖的1位羥基，得到式D化合物；
(4)式D化合物在堿催化下，與三鹵代乙腈反應(yīng)，得到端基含亞胺酯的式E化合物；
(5)式E化合物在酸催化下得到式F化合物
(6)式F化合物在酸存在下，在有機(jī)溶劑中，與醇R4-R3OH反應(yīng)，得到式G化合物；
這里，醇R4-R3OH中R3選自-CH2CH2-(OCH2CH2)n-，n為1-100，脂肪族烷烴亞基，脂肪族烯烴亞基，或-CH2-(OCH2CH2)m-，這里m為1-100；優(yōu)選地，R3為-CH2-O-CH2CH2-；R4選自疊氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚，所述取代的氨基是指被保護(hù)基保護(hù)的氨基，所述保護(hù)基選自芐氧羰?；?、叔丁氧羰酰基、三氯乙?；?、三氟乙酰基；優(yōu)選地，R4-R3OH為N3-CH2-OCH2CH2-OH；
(7)式G化合物在酸或堿的醇R1OH溶液中，脫去式G化合物上所有的R2，得到式H化合物；
(8)式H化合物在R5CHO或R5CHO縮二脂肪醇的存在下，在酸催化下選擇性保護(hù)式H化合物的4,6二羥基與4′,6′二羥基，得到式I化合物；
這里，R5CHO或R5CHO縮二脂肪醇(例如R5CH(OCH3)2)中的R5選自苯基或取代的苯基；
(9)式I化合物在酰鹵R7X或酸酐R7-O-R7的作用下，在堿性條件下進(jìn)行?；檬絁化合物；
這里，酰鹵R7X或酸酐R7-O-R7中的R7選自C1-C4脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲酰基；酰鹵R7X中的X選自氯、溴或碘，優(yōu)選地，選自氯或溴；
(10)式J化合物在酸與還原劑的存在條件下，選擇性裸露4位羥基，使得6位為R5-CH2-保護(hù)，得到式K化合物；
(11)式K化合物在氧化劑存在條件下，對4,4′位羥基進(jìn)行氧化，得到式L化合物；
(12)式L化合物在還原劑存在條件下，選擇性將式L化合物中的4與4′位的兩個酮羰基還原為醇，而且兩個新生成的羥基的構(gòu)型與步驟(11)中式K的兩個羥基構(gòu)型相反，得到半乳糖構(gòu)型的式M化合物；
(13)式M化合物在氧化劑或還原劑作用下，脫除6與6’位的兩個芐基或取代的芐基，得到四醇，即式O化合物；
或者，將步驟(10)-(13)用下述的步驟(10a)-(14)替換：
(10a)式J化合物在酸的存在條件下，水解兩個亞芐基或取代的亞芐基，得到式K’化合物；
(11a)式K’化合物在氯硅烷R8R8R9SiCl與堿的存在下，區(qū)域選擇性地對兩個N-乙酰氨基葡萄糖的6,6’位羥基進(jìn)行硅烷化，得到式L’化合物；
(12a)式L’化合物在氧化劑存在條件下，選擇性地將式L’化合物中的兩個N-乙酰氨基葡萄糖的4與4’位的羥基氧化為酮羰基，得到式M’化合物；
(13a)式M’化合物在還原劑存在條件下將N-乙酰氨基葡萄糖的4與4’位的酮羰基立體選擇性的還原為直立鍵羥基，得到式N’化合物；
(14)式N’化合物在酸或氟離子試劑的存在下脫除N-乙酰氨基半乳糖殘基中6與6’位的硅醚基，得到四醇，即式O化合物；
(15)利用式O化合物合成硫酸軟骨素四糖；
這里，式A-式O化合物中，Ac為乙?；?；
式C-式O化合物以及醇R1OH中，R1選自未取代的芐基或取代的芐基、C1-C4烷基、或烯丙基；這里，所述取代的芐基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R1選自甲基、乙基、烯丙基、芐基，4-甲氧基芐基，更優(yōu)選地選自甲基、乙基、芐基；
式C-式G化合物、式J-式O化合物中，R2和R7各自獨立地選自脂肪族酰基、未取代的苯甲酰基或取代的苯甲?；?；這里，所述脂肪族?；侵窩2-C6烷酰基(例如乙?；?、丙?；?、正丁?；?、異丁?；⒄祯；?、新戊?；蛘乎；?，所述取代的苯甲?；侵副江h(huán)被一個或兩個以上的取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R2和R7各自獨立地選自乙?；?、苯甲?；?-氯代苯甲?；?-溴代苯甲?；?，更優(yōu)選地選自乙?；?、或苯甲?；?；
式G-式O化合物中，R3選自-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，這里n為1-100；脂肪族烷烴亞基；脂肪族烯烴亞基；或-(CH2CH2O)m-CH2-，這里m為1-100；優(yōu)選地，選自-CH2CH2-O-CH2-；R4選自疊氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚；所述取代的氨基是指被保護(hù)基保護(hù)的氨基、所述保護(hù)基選自芐氧羰?；⑹宥⊙豸术；?、三氯乙酰基、三氟乙酰基；優(yōu)選地，-OR3-R4為-O-CH2CH2-O-CH2-N3；
式I、式J、式K、式L和式M化合物中，R5選自未取代的苯基或取代的苯基，這里，所述取代的苯基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，選自苯基、4-甲氧基苯基、4-氯代苯基、4-溴代苯基，更優(yōu)選地，選自苯基或4-甲氧基苯基；
式L’、式M’和式N’化合物中，R8和R9各自獨立地選自C1-C4烷烴基，苯基或取代的苯基；這里，所述C1-C4烷烴基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基；所述取代的苯基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R8和R9各自獨立地選自甲基、異丙基或叔丁基或苯基；
式E化合物中，X選自氟或氯，優(yōu)選地為氯；
式A-式B化合物中，M為鈉、鉀、鋰或鈣，優(yōu)選地為鈉。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(1)中，透明質(zhì)酸酶的加入量為透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量的2.0-3.0％，反應(yīng)溫度為37℃，式A化合物的分子量為1KDa-10,000KDa，優(yōu)選地為10KDa-1,000KDa；所述弱酸性指緩沖溶液的pH值為3.0-6.5，優(yōu)選地為5.0-5.2；所述緩沖溶液選自乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鉀緩沖液、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液或磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液的一種，優(yōu)選地為自乙酸-乙酸鈉緩沖液；所述緩沖液的濃度選為0.01M-1M；優(yōu)選地，所述緩沖溶液為濃度為0.1M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；氯化鈉在弱酸性緩沖溶液中的濃度為0.05M-0.5M，優(yōu)選地為0.15M；所述透明質(zhì)酸酶選自動物睪丸來源的透明質(zhì)酸酶，例如從Sigma-Aldrich公司購買的牛睪丸來源的透明質(zhì)酸酶。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(2)中，所述無機(jī)酸的選自氯化氫、硫酸、硝酸、磷酸，優(yōu)選地，選自氯化氫或硫酸；醇R1OH中R1如上所述；所述堿性條件指的是選自醋酸鈉，吡啶，磷酸二氫鈉，碳酸鉀，三乙胺或哌啶的堿存在的條件，優(yōu)選地，指的是選自吡啶或醋酸鈉的堿存在的條件。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(3)中，所述堿選自乙二胺、水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺，優(yōu)選地，選自水合肼或3-N,N二甲基氨基丙胺；所述有機(jī)溶劑選自丙酮、氯仿、四氫呋喃、二氯甲烷、N,N二甲基甲酰胺或N,N二甲基乙酰胺，優(yōu)選地，選自二氯甲烷、四氫呋喃或N,N二甲基甲酰胺。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(4)中，所述堿選自堿金屬的碳酸鹽、1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)，乙酸鹽、硼酸鹽、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種；優(yōu)選地，選自碳酸鉀或1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)中的一種；所述三鹵代乙腈中的鹵素選自氟、氯、溴，優(yōu)選地為氯。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(5)中，所述酸選自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化銅、對甲基苯磺酸，或樟腦磺酸。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(6)中，所述酸選自三氟甲磺酸烷基硅脂、三氟化硼乙醚、氯化銅、對甲基苯磺酸，樟腦磺酸；優(yōu)選地，選自氯化銅、三氟甲磺酸C1-C4三烷基取代的硅脂；所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、丙酮或1,2-二氯乙烷中的一種；優(yōu)選地為氯仿。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(7)中，所述酸選自氯化氫、硫酸、硝酸、磷酸或三氟化硼乙醚中的一種，優(yōu)選地，選自氯化氫或三氟化硼乙醚；所述堿選自R1ONa、R1OK或NaOH，優(yōu)選地為R1ONa，其中，R1選自未取代的芐基或取代的芐基、C1-C4烷基、或烯丙基；這里，所述取代的芐基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R1選自甲基、乙基、烯丙基、芐基，4-甲氧基芐基，更優(yōu)選地選自甲基、乙基、芐基。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(8)中，所述酸選自對甲基苯磺酸或樟腦磺酸。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(9)中，所述堿性條件指的是選自醋酸鈉、吡啶、磷酸二氫鈉、碳酸鉀、三乙胺或哌啶的堿存在的條件，優(yōu)選地，指的是選自吡啶或醋酸鈉的堿存在的條件。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬氐暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(10)中，所述酸選自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一種，優(yōu)選地為三氟乙酸；所述還原劑選自三烷基取代的硅烷(例如三乙基硅烷、三異丙基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、苯基二甲基硅烷)、氰基硼氫化鈉、硼烷；優(yōu)選地，選自三烷基取代的硅烷(例如三乙基硅烷、三異丙基硅烷、叔丁基二甲基硅烷、苯基二甲基硅烷)或氰基硼氫化鈉。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(11)中，所述氧化劑選自戴斯-馬丁氧化劑、酸酐-二甲基亞砜的組合、草酰氯-二甲基亞砜-三乙胺的組合、三氟乙酸酐-二甲基亞砜-三乙胺的組合或二氧化錳；優(yōu)選地，為戴斯-馬丁氧化劑；
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(12)中，所述還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、烷基取代的硼氫化鹽(例如：三異丁基硼氫化鉀或三異丁基硼氫化鋰)；優(yōu)選地，選自三異丁基硼氫化鉀或硼氫化鈉。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ校霾襟E(13)中，所述氧化劑選自DDQ或硝酸鈰銨；所述還原劑選自三乙基硅烷與單質(zhì)碘的組合、或三乙基硅烷與一氧化碳與八羰基二鈷的組合。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(10a)中，所述酸選自三氟乙酸、乙酸、硼酸中的一種，優(yōu)選地，為乙酸。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，所述步驟(11a)中，所述取代的氯硅烷R8R8R9SiCl選自叔丁基二苯基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、三異丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷、二甲基苯基氯硅烷或三甲基氯硅烷；優(yōu)選地，為叔丁基二甲基氯硅烷；所述堿選自三乙胺、吡啶或4-二甲氨基吡啶，優(yōu)選地，為吡啶。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ校霾襟E(12a)中，所述氧化劑選自草酰氯-二甲基亞砜-三乙胺的組合、乙酸酐-二甲基亞砜的組合、二氧化錳或戴斯-馬丁高碘試劑；優(yōu)選為戴斯-馬丁高碘試劑。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ校霾襟E(13a)中，所述還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀或烷基取代的硼氫化鹽(例如：三異丁基硼氫化鉀或三異丁基硼氫化鋰)；優(yōu)選的，選自三異丁基硼氫化鉀或硼氫化鈉。
在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?所述步驟(14)中，所述酸選自對甲苯磺酸或三氟乙酸，優(yōu)選為對甲苯磺酸；所述氟離子試劑選自四丁基氟化銨、氟化氫吡啶絡(luò)合物、氟化氫三乙胺絡(luò)合物或氟化銨；優(yōu)選地為氟化氫吡啶絡(luò)合物。
本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ǎ诘玫绞絆化合物后，進(jìn)一步地包括如下步驟之一：
(i)1當(dāng)量式O化合物在20-100當(dāng)量的三氧化硫有機(jī)堿復(fù)合物的存在下對其上的羥基進(jìn)行磺酸酯化，而后在堿性條件下脫去保護(hù)基得到硫酸軟骨素E四糖，即式CS-E化合物；
(ii)1當(dāng)量式O化合物在5-15當(dāng)量的三氧化硫有機(jī)堿復(fù)合物的存在下對N-乙酰氨基半乳糖殘基上的6與6‘位的兩個羥基進(jìn)行區(qū)域選擇性磺酸酯化，而后在堿性條件下脫去保護(hù)基得到硫酸軟骨素C四糖，即式CS-C化合物；
(iii)式O化合物與氰基苯甲酰在有機(jī)堿的作用下對N-乙酰氨基半乳糖殘基上的6與6‘位的兩個羥基進(jìn)行區(qū)域選擇性苯甲酰化，而后三氧化硫有機(jī)堿復(fù)合物的存在下對4與4’位的羥基進(jìn)行磺酸酯化，再在堿性條件下脫去保護(hù)基得到硫酸軟骨素A四糖，即式CS-A化合物；
這里，步驟(i)、(ii)和(iii)中的三氧化硫有機(jī)堿復(fù)合物選自三氧化硫吡啶復(fù)合物、三氧化硫三乙胺復(fù)合物或三氧化硫三甲胺復(fù)合物，優(yōu)選地，為三氧化硫三甲胺復(fù)合物。所述堿性條件指的是下列堿存在的條件：氫氧化鈉或其與過氧化氫的混合溶液、氫氧化鉀或其與過氧化氫的混合溶液、氫氧化鋰或其與過氧化氫的混合溶液，優(yōu)選地選自氫氧化鋰或其與過氧化氫的混合溶液。
此外，在本申請?zhí)峁┑牧蛩彳浌撬厮奶堑暮铣煞椒ㄖ?，在得到式O化合物后，可參考現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)(參考文獻(xiàn)：Jean-Claude Jacquinet et al,From Polymer to Size-Defined Oligomers:A Highly Divergent and Stereocontrolled Construction of Chondroitin Sulfate A,C,D,E,K,L,and M Oligomers from a Single Precursor:Part 2.Chem.Eur.J.2009,15,9579-9595.)制備硫酸軟骨素四糖A、C或E。
本申請還提供了用于合成硫酸軟骨素四糖的中間體化合物，選自式D-式N’化合物中的一種：
這里，式D-式N’化合物中，Ac為乙酰基；
式D-式N’化合物中，R1選自未取代的芐基或取代的芐基、C1-C4烷基、或烯丙基；這里，所述取代的芐基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，任選地，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R1選自甲基、乙基、烯丙基、芐基，4-甲氧基芐基，更優(yōu)選地選自甲基、乙基、芐基；
式D-式N’化合物中，R2和R7各自獨立地選自脂肪族?；?、未取代的苯甲?；蛉〈谋郊柞；贿@里，所述脂肪族酰基是指C2-C6烷?；?例如乙?；⒈；?、正丁酰基、異丁?；?、正戊?；?、新戊?；蛘乎；?；所述取代的苯甲?；侵副江h(huán)被一個或兩個以上的取代基所取代、所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，任選地，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R2和R7各自獨立地選自乙?；?、苯甲酰基、4-氯代苯甲?；?、4-溴代苯甲?；?，更優(yōu)選地選自乙?；?、或苯甲酰基；
式G-式N’化合物中，R3選自-(CH2CH2)n-O-CH2CH2-，這里n為1-100；脂肪族烷烴亞基；脂肪族烯烴亞基；或-(CH2CH2)n-O-CH2-，這里n為1-100；優(yōu)選地，選自-CH2CH2-O-CH2-；R4選自疊氮基、炔基、生物素、取代的氨基、醛基、硫醚；所述取代的氨基是指被保護(hù)基保護(hù)的氨基，所述保護(hù)基選自芐氧羰?；⑹宥⊙豸术；⑷纫阴；⑷阴；?；優(yōu)選地，OR3-R4為-O-CH2CH2-O-CH2-N3；
式I、式J、式K、式L和式M化合物中，R5選自未取代的苯基或取代的苯基，這里，所述取代的苯基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，任選地，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，選自苯基，4-甲氧基苯基，4-氯代苯基、4-溴代苯基，更優(yōu)選地，選自苯基，4-甲氧基苯基；
式L’、式M’和式N’化合物中，R8和R9各自獨立地選自C1-C4烷烴基，苯基或取代的苯基；這里，所述C1-C4烷烴基是指甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基；所述取代的苯基是指苯環(huán)被一個或兩個以上取代基所取代，所述取代基選自鹵素(例如氟、氯、溴或碘)、硝基、C1-C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基)、C1-C4鹵代烷基(例如三氟甲基)、C1-C4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基)；并且，任選地，所述取代基在苯環(huán)的任意位置；優(yōu)選地，R8和R9各自獨立地選自甲基，異丙基，叔丁基。
式E化合物中，X選自氟或氯，優(yōu)選地為氯。
本申請?zhí)峁┑挠糜诤铣闪蛩彳浌撬厮奶堑闹虚g體化合物，包括：
(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖；
O-(((2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亞胺酯；
O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙?；?1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧基亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷；
1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-對甲氧芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]丁烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷；和
1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷。
本申請以較易生產(chǎn)、較易提取得到的透明質(zhì)酸鈉為原料，通過廉價的動物睪丸來源的透明質(zhì)酸酶對原料進(jìn)行水解，得到可用于之后進(jìn)行化學(xué)修飾的四糖骨架，而后對其進(jìn)行常規(guī)的保護(hù)基操作從而合成可用于硫酸軟骨素A,C,E三種四糖合成的關(guān)鍵中間體，整條路線無需進(jìn)行糖基化操作，反應(yīng)路線短，收率高，且可具有疊氮基，便于后期利用click反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，可規(guī)?；a(chǎn)硫酸軟骨素及其衍生物；另一方面，通過適當(dāng)?shù)臈l件優(yōu)化及純化方式選擇，可獲取純度較高的樣品用于研究，便于硫酸軟骨素的藥化探索。
具體實施方式
下面通過實施例來進(jìn)一步地說明本申請的可實施性，并非對本申請保護(hù)范圍的限制。
檢測儀器：
核磁：Bruker AV-400型核磁共振儀，溶劑為CDCl3,CD3OD,TMS為內(nèi)標(biāo)。
質(zhì)譜：Bruker APEX IV型質(zhì)譜儀。
縮略語：
CH2Cl2為二氯甲烷
EtOAc為乙酸乙酯
MeOH為甲醇
DMF為N,N-二甲基甲酰胺
DMP:戴斯-馬丁試劑
HRMS:高分辨質(zhì)譜
ESI:電噴霧質(zhì)譜
實施例1：(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖二鈉鹽的合成
取透明質(zhì)酸干粉(分子量約50萬)51.0g置于2500mL的pH＝5.00的含0.15M氯化鈉的0.10M乙酸鈉-乙酸緩沖液中，在劇烈攪拌下使透明質(zhì)酸在室溫下充分溶脹(約需72h)為無色，均一的粘稠膠狀液體。利用恒溫水浴使該膠狀液體升溫至37.0℃,此時加入1.0g透明質(zhì)酸酶干粉(購買自Sigma-Aldrich公司，貨號H-3506，Lot#SLBL1922V)，并于37.0℃下攪拌兩周。反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)液升溫至沸，并在105℃攪拌15min，待溶液不再繼續(xù)渾濁后將其迅速冷卻至室溫，并與1/20體積的無水乙醇混合后減壓蒸餾，濃縮至干得白色糖漿。之后將此糖漿用少量蒸餾水溶解并緩慢滴入3000mL劇烈攪拌的絕對乙醇中析出白色沉淀，以減壓過濾的方法在空氣相對濕度不超過50％的環(huán)境中收集所析出的沉淀，并用少量冷的絕對乙醇洗滌濾餅，而后將收集得到的固體粉末在盛有無水氯化鈣的干燥器中減壓干燥至恒重，得96.0g白色無定形粉末狀固體。該粗產(chǎn)物可直接用于下步合成，無需進(jìn)一步純化。為確定反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及收率，200mg粗產(chǎn)品經(jīng)LH-20葡聚糖凝膠柱(柱高×柱直徑＝100cm×2cm)純化，以蒸餾水洗脫，得到題述四糖產(chǎn)物60mg,與文獻(xiàn)P.Litant et al.Carbohydr.Res.237(1992)271-281所提供1H NMR譜圖比較完全相同。
實施例2：(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-1,4,6-三-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖的合成
將(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖二鈉鹽粗品96.0g溶于12L,0.08M的新制冷的氯化氫甲醇溶液中。而后將反應(yīng)液于4℃靜置96h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用三乙胺中和至中性，而后減壓蒸餾，并濃縮至干。加入吡啶405mL，冷卻至0℃，緩慢滴加乙酸酐230mL后將反應(yīng)液緩慢升至室溫，并于室溫下攪拌24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在冰水浴中冷卻，緩慢滴加甲醇170mL，并于該溫度下攪拌1h，將反應(yīng)液減壓蒸餾濃縮得棕黃色糖漿。將此糖漿溶于2.5L EtOAc中，減壓過濾除去不溶物，有機(jī)相依次用400mL的1M鹽酸水溶液洗滌3次，水相用400mL EtOAc萃取三次。合并有機(jī)相，并依次用600mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，600mL飽和食鹽水洗滌1次。將有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸餾，所得粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝1:1:0.06至1:1:0.14(洗脫劑含0.1％三乙胺)快速硅膠柱層析純化，得32.6g白色無定形固體。自實施例1中的透明質(zhì)酸鈉為原料，三步收率42％。
Rf＝0.38(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.18)。
1H NMR表明產(chǎn)物為α：β＝3:1的混合物。
HRMS(ESI):[M+H]+計算值1225.3777,實測值[M+H]+：1225.3750。
實施例3：(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖的合成
取(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-1,4,6-三-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖30.2g(24.6mmol)溶于240mL四氫呋喃中，在攪拌下緩慢滴加15.5mL(90.7mmol)3-N,N-二甲基-氨基丙胺，并于室溫下攪拌3h。將反應(yīng)液用650mL氯仿稀釋，有機(jī)相用150mL的1M鹽酸溶液洗滌3次，水相用150mL氯仿萃取3次，合并有機(jī)相，用230mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌1次，飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得25.5g淡黃色無定形粉末，收率88％。粗產(chǎn)物無需進(jìn)一步純化，即可用于下面的反應(yīng)。
實施例4：O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亞胺酯的合成
取干燥的(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖粗品7.0g(6.0mmol)溶于60mL干燥二氯甲烷中，加入三氯乙腈6.7mL(60mmol)，將此混合物在氬氣氣氛下于冰水浴中冷卻。之后緩慢滴加1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)149μL(0.9mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌2.5h。待反應(yīng)完成后將反應(yīng)液減壓濃縮，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.10，含0.1％三乙胺)得5.5g白色無定形固體，收率79％。
Rf＝0.48(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.12)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H,C＝NH),6.23(d,J＝3.7Hz,1H),5.84(d,J＝7.5Hz,1H),5.77(d,J＝9.6Hz,1H),5.21(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.15-5.07(m,3H),4.90(dd,J＝J＝9.4Hz,1H),4.83-4.73(m,4H),4.63(d,J＝7.8Hz,1H),4.59(ddd,J＝10.1Hz,3.8Hz,3.8Hz,1H),4.43(dd,J＝J＝9.7Hz,1H),4.29(dd,J＝4.2Hz,12.4Hz,1H),4.18(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.85(m,11H),3.72(s,3H),3.66-3.64(m,1H),3.14(ddd,J＝17.4Hz,8.0Hz,8.0Hz,1H),2.08-2.01(m,33H,COCH3)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.0,170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,160.2,100.9,100.0,98.7,95.3,90.8,77.3,76.8,75.8,74.9,72.3,72.1,71.8,71.8,71.7,71.6,70.2,69.4,68.0,67.7,61.8,61.7,57.7,53.0,52.8,51.8,23.6,23.2,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5。
HRMS(ESI):[M+H]+計算值1326.2768,實測值[M+H]+：1326.2738。
實施例5：O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙?；?1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉
取干燥的O-(((2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖基)三氯乙酰亞胺酯9.0g(6.8mmol)溶于80mL干燥二氯甲烷中，并于氬氣氣氛下在冰水浴中冷卻。緩慢滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯182μL(1.02mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌0.5h。待反應(yīng)完成后滴加150μL三乙胺淬滅反應(yīng)。將反應(yīng)液減壓濃縮至干，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.15，含0.1％三乙胺)得7.1g白色無定形固體，收率90％。
Rf＝0.34(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.18)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.92(d,J＝6.6Hz,1H),5.82(d,J＝7.3Hz,1H),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.12(dd,J＝J＝9.0Hz,1H),5.06(dd,J＝J＝9.2Hz,1H),4.92-4.78(m,6H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(m,1H),4.41-4.30(m,2H),4.20(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.92(m,6H),3.82(s,3H),3.71-3.63(m,11H),3.41(m,2H),3.30(m,1H),3.01(m,1H),2.06-1.96(m,33H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.2(2C),170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,100.7,100.0,99.4,98.3,77.9,76.7,75.6,74.5,72.3,72.2,72.2,71.9,71.8,71.7,71.6,70.4,69.9,69.4,68.9,68.5,68.1,62.4,62.0,58.1,57.5,52.9,52.7,50.7,23.6,23.4,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5；
HRMS(ESI):計算值[M+H]+:1165.3566,實測值[M+H]+：1165.3561。
實施例6：1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷
取干燥的O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉5.0g(4.3mmol)溶于35mL干燥的三氯甲烷中,加入1-疊氮-2-氧雜-4丁醇(其制備方法參見文獻(xiàn)：Johnson,Charles L.and Guo,Zhongwu，Journal of Carbohydrate Chemistry,32(5-6),301-323；2013)5.6g(43mmol)和無水氯化銅631mg(4.7mmol)。反應(yīng)液于65℃下回流10h后加入10mL蒸餾水并繼續(xù)回流1h。將反應(yīng)液于室溫下冷卻，加入飽和碳酸氫鈉水溶液并劇烈攪拌。水相用10mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得無色糖漿。將該糖漿分散于30mL無水乙醚中劇烈攪拌12h，可見大量白色固體析出，過濾收集固體，將固體用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝1:1:0.10,含0.1％三乙胺)得4.7g白色無定形固體，收率84％。
Rf＝0.40(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.17)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.08(m,2H,NHAc),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.12(dd,J＝J＝9.0Hz,1H),5.06(dd,J＝J＝9.2Hz,1H),4.92-4.78(m,6H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(m,1H),4.41-4.30(m,2H),4.20(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.92(m,6H),3.82(s,3H),3.71-3.63(m,11H),3.41(m,2H),3.30(m,1H),3.01(m,1H),2.06-1.96(m,33H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.2(2C),170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,100.7,100.0,99.4,98.3,77.9,76.7,75.6,74.5,72.3,72.2,72.2,71.9,71.8,71.7,71.6,70.4,69.9,69.4,68.9,68.5,68.1,62.4,62.0,58.1,57.5,52.9,52.7,50.7,23.6,23.4,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5。
HRMS(ESI):計算值[M+H]+:1296.4261,實測值[M+H]+：1296.4244。
實施例7：1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷
取1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷4.0g(3.1mmol)溶于30mL 0.25M的氯化氫甲醇溶液中。反應(yīng)液于室溫下攪拌36h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IRA-410OH-型陰離子交換樹脂中和反應(yīng)液至中性。過濾去除樹脂，樹脂用甲醇洗滌3次，洗滌液與濾液合并減壓濃縮至干，并在盛有無水氯化鈣的干燥器中干燥，得2.8g白色無定形固體，收率100％。產(chǎn)物無需進(jìn)一步純化，即可用于后續(xù)反應(yīng)。
Rf＝0.15(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝4:1)。
實施例8：1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷
取1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷2.0g(2.2mmol)溶于15mL干燥N,N二甲基甲酰胺中，加入(+)-樟腦磺酸(0.22mmol)和對甲氧基苯甲醛縮二甲醇(22mmol)，反應(yīng)液在減壓條件下(0.5個大氣壓)于50℃攪拌4h。加入三乙胺淬滅反應(yīng)，將反應(yīng)液減壓蒸干得黃色糖漿。將該糖漿分散于20mL無水乙醚中劇烈攪拌12h，可見大量白色固體析出，過濾收集固體，固體用少量冷的含20％甲醇的乙醚溶液洗滌，得1.9g粗品，收率75％。該粗品無需進(jìn)一步純化，即可用于下面的反應(yīng)。
Rf＝0.40(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝15:1)；
實施例9：1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷
取1-疊氮-2-氧雜-4-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]丁烷1.9g溶于20mL吡啶并冷卻至0℃，將苯甲酰氯預(yù)先溶于1mL吡啶中，而后緩慢滴加入反應(yīng)液中并于0℃攪拌3h。用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)，將反應(yīng)液減壓蒸干，用乙酸乙酯稀釋，有機(jī)相依次用0.5N的鹽酸水溶液洗滌，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，飽和NaCl水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。濃縮物經(jīng)乙醚沉淀得2.3g白色無定形固體，產(chǎn)率：85％。
Rf＝0.63(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝25:1)。
HRMS:計算值[M+Na]+:1696.5277,實測值[M+Na]+：1696.5290。
實施例10：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取干燥的O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙?；?1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉10.0g(8.6mmol)溶于90mL干燥的三氯甲烷中,加入6-疊氮-1-己醇(其合成方法參見T.M.Shaikh and A.Sudalai,Eur.J.Org.Chem.2010,3437–3444)9.7g(69mmol)和無水氯化銅1.26g(9.4mmol)。反應(yīng)液在氬氣氣氛下于65℃回流10h后冷卻至室溫，加入飽和碳酸氫鈉水溶液并劇烈攪拌。水相用10mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得無色糖漿。將該糖漿分散于60mL無水乙醚中劇烈攪拌12h，可見大量白色固體析出，減壓過濾收集所析出的固體粉末，以無水乙醚洗滌濾餅，干燥后得白色粉末狀固體10.6g,收率95％。
Rf＝0.49(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.17)＝0.51；
(c1.0,CHCl3)；
m.p.180-182℃(CH2Cl2/PE)；
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.92(d,J＝5.8Hz,1H,GluNAcIII-NHAc),5.73(d,J＝7.8Hz,1H,GluNAcI-NHAc),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H,GlcAIV-H-3),5.12(dd,J＝J＝9.7Hz,1H,GlcAIV-H-4),5.06(dd,J＝J＝8.5Hz,1H,GlcAII-H-3),4.94-4.79(m,6H,GluNAcIII-H-4,GluNAcI-H-4,GlcAII-H-2,GlcAIV-H-2,GluNAcI-H-1,GluNAcIII-H-1),4.63(d,J＝7.8Hz,1H,GlcAII-H-1),4.60(d,J＝7.9Hz,1H,GlcAIV-H-1),4.55(dd,J＝J＝9.8Hz,1H,GluNAcIII-H-3),4.48(dd,J＝J＝9.7Hz,1H,GluNAcI-H-3),4.33(dd,J＝12.4Hz,4.5Hz,1H,GluNAcIII-H-6a),4.22(dd,J＝12.2Hz,4.9Hz,1H,GluNAcI-H-6a),4.10-4.06(m,2H,GluNAcI-H-6b,GlcAII-H-4),4.01-3.95(m,3H,GlcAIV-H-5,GlcAII-H-5,GluNAcIII-H-6b),3.87-3.82(m,4H,-COOCH3,-OCH2(CH2)5N3),3.71(s,3H,-COOCH3),3.65-3.63(m,2H,GluNAcIII-H-5,GluNAcI-H-5),3.46(dt,J＝9.6Hz,6.4Hz,1H,-OCH2(CH2)5N3),3.27(t,J＝6.8Hz,2H,-O(CH2)5CH2N3),3.09(m,1H,GluNAcI-H-2),2.98(m,1H,GluNAcIII-H-2),2.07-1.96(m,33H,-COCH3),1.59(m,4H,-OCH2(CH2)4CH2N3),1.37(m,4H,-OCH2(CH2)4CH2N3)ppm；
13CNMR(100MHz,CDCl3)δ171.2,171.1,170.8,170.6,170.2,170.0,169.7,169.4,169.3,167.0,168.9,167.8,166.9(C＝O),100.6,100.1,98.9,98.2,77.6,76.6,75.6,74.5,72.3,72.2,71.9,71.8,71.8,69.8,69.4,68.9,68.2,62.4,62.0,58.3,58.2,52.9,52.7,51.3,29.3,28.7,26.4,25.5,23.7,23.5,20.8-20.4(COCH3)ppm；
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值1307.4552,實測值1307.4567。
實施例11：1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷4.0g(3.1mmol)溶于30mL 0.25M的氯化氫甲醇溶液中。反應(yīng)液于室溫下攪拌36h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IRA-410OH-型陰離子交換樹脂中和反應(yīng)液至中性。過濾去除樹脂，樹脂用甲醇洗滌3次，洗滌液與濾液合并減壓濃縮至干，并在盛有無水氯化鈣的干燥器中干燥，得2.8g白色無定形固體，收率100％。產(chǎn)物無需進(jìn)一步純化，即可用于后續(xù)反應(yīng)。
實施例12：1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷7.8g(6.9mmol)溶于68mL干燥N,N二甲基甲酰胺中，加入(+)-樟腦磺酸1.27g(5.5mmol)和對甲氧基苯甲醛縮二甲醇18.6mL(124mmol)，反應(yīng)液在減壓條件下(0.5個大氣壓)于50℃攪拌過夜。加入三乙胺淬滅反應(yīng)，將反應(yīng)液減壓蒸干得黃色糖漿。將該糖漿分散于10mLCH2Cl2中，后在劇烈攪拌下緩慢加入120mL無水乙醚，可見大量白色固體析出，減壓過濾收集固體，固體依次用水與少量冷的甲醇洗滌，得7.12g粗品，收率84％。該粗品無需進(jìn)一步純化，即可用于下面的反應(yīng)。
Rf＝0.55(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝7:1).
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.82(d,J＝8.7Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.41-7.32(m,10H,PhH),5.58(s,2H),5.27(d,J＝5.6Hz,1H),5.11(d,J＝3.9Hz,1H),4.91(s,1H),4.67-4.63(m,2H),4.55(d,J＝8.1Hz,1H),4.45-4.41(m,2H),4.36(d,J＝7.5Hz,1H),4.24-4.16(m,2H),3.95-3.88(m,2H),3.77-3.52(m,18H),3.44-3.33(m,6H),3.16-3.10(m,1H),3.03-2.99(m,2H),1.81(s,6H),1.51-1.45(m,4H),1.30(m,4H)ppm.
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.2,170.1,169.7,168.8,138.1,138.1,128.9,128.4,126.5,126.4,103.9,103.8,101.6,100.7,100.2,100.1,79.4,79.3,79.1,78.4(2C),76.2(2C),74.2(2C),73.7(2C),71.9,69.1,68.2,68.0,66.2(2C),55.6(2C),52.7,52.2,51.0,29.3,28.7,26.3,25.3,23.5,23.4ppm.
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值C50H68N5O23,1106.4300,實測值1106.4318；[M+Na]+:計算值C50H67N5NaO23,1128.4119,實測值1128.4127；[M+K]+:計算值C50H67N5KO23,1144.3858,實測值1144.3830.
實施例13：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-對甲氧亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷5.0g(4.5mmol)溶于60mL吡啶并冷卻至-15℃，將苯甲酰氯2.8mL(23.9mmol)緩慢滴加入反應(yīng)液中并于0℃攪拌3h。用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)，將反應(yīng)液減壓蒸干，用乙酸乙酯稀釋，有機(jī)相依次用0.5N的鹽酸水溶液洗滌，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，飽和NaCl水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。濃縮物經(jīng)乙醚沉淀得6.3g白色無定形固體，產(chǎn)率：86％。
Rf＝0.62(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝20:1).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.8,170.7,167.3,167.0,165.6,165.2,165.2,165.0,164.8(C＝O),137.4,137.1,133.6,133.4,133.3,129.8,129.8,129.6,129.1,129.0,128.9,128.7,128.6,128.5,128.4,128.3,128.3,126.2,126.0(aromatic C),101.3(PhCH,2C),100.6,100.4,99.1,98.2,80.7,80.5,76.2,74.4,72.8,72.3,72.1,71.8,71.7,70.1,69.9,68.8,67.9,65.8,65.4,58.8,58.4,52.9,52.5,51.3,29.3,28.7,26.4,25.4,22.9,22.6ppm；
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值C85H88N5O28,1626.5610,實測值1626.5626.
實施例14：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-O-亞芐基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷8.0g于75％乙酸的水溶液中加熱至80℃，并于此溫度下攪拌1h后將反應(yīng)液冷卻至室溫。與甲苯一同減壓蒸餾3次。殘留物用無水乙醚洗滌，減壓過濾，收集濾餅，干燥后得6.0g白色無定形固體，收率：85％。
Rf(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝10:0.7)＝0.31；
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.96-7.29(m,25H),6.05(dd,J＝J＝9.6Hz),5.66(dd,J＝J＝7.9Hz),5.59(dd,J＝J＝9.7Hz),5.49(dd,J＝9.6Hz,7.8Hz),5.30(dd,J＝J＝7.6Hz),5.15(d,J＝7.7Hz),5.07(d,J＝7.4Hz),4.66(d,J＝9.8Hz),4.59(d,J＝8.3Hz),4.49(dd,J＝J＝8.2Hz),4.33-4.31(m,2H),3.90-3.76(m,6H),3.73-3.63(m,6H),3.57-3.50(m,2H),3.47-3.37(m,2H),3.31-3.18(m,4H),3.13-3.06(m,2H),1.56-1.46(m,4H),1.47(s,3H),1.44(s,3H),1.37-1.30(m,4H)ppm；
13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ171.7,171.6,168.2,167.7,165.6,165.4,165.3,165.2,165.0(C＝O),133.4,133.3,133.2,133.2,129.7,129.6,129.4,129.4,129.3,129.1,128.7,128.6,128.3,128.2(aromatic C),101.3,100.8,100.6,100.5,84.4,83.6,76.1(C×2),75.3,74.3,73.0,72.4,72.3,71.9,71.5,69.9,69.2(C×2),69.0,61.3,61.2,54.9,54.3,52.1,52.0,51.0,29.0,28.4,26.1,25.2,21.6,21.4ppm；
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值C71H80N5O28,1450.4984,實測值1450.4978；[M+Na]+:計算值C71H79N5NaO28,1472.4804,實測值1472.4752。
實施例15：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷1.8g與二甲基叔丁基氯硅烷785mg溶于28mL無水吡啶中，反應(yīng)液在氬氣氣氛下于室溫攪拌過夜。待薄層層析色譜顯示反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液于冰水浴中冷卻，滴加甲醇淬滅反應(yīng)。將反應(yīng)液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯稀釋，依次用1M鹽酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱層析分離(CH2Cl2:MeOH＝100:1→90:1→80:1→40:1→25:1)得白色無定形固體(1.8g,86％)。
Rf(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝20:1.1)＝0.51；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96-7.23(m,25H,benzoyl aromatic proton),5.91(dd,J＝J＝9.5Hz,1H),5.70(d,J＝6.6Hz,1H,GluNAcIII-NHAc),5.62(dd,J＝J＝9.6Hz,1H),5.52-5.47(m,2H),5.31(dd,J＝J＝7.6Hz,1H),5.25(d,J＝6.7Hz,1H,GluNAcI-NHAc),4.93(d,J＝8.2Hz,1H,GluNAcI-H-1),4.87(d,J＝7.7Hz,1H),4.80(d,J＝8.2Hz,1H,GluNAcIII-H-1),4.58(dd,J＝10.1Hz,7.5Hz,1H,GluNAcIII-H-3),4.58(dd,J＝10.1Hz,8.3Hz,1H,GluNAcI-H-3),3.69(s,3H,-COOMe),3.61(s,3H,-COOMe),2.72(ddd,J＝8.3Hz,8.3Hz,6.7Hz,GluNAcI-H-2),2.65(ddd,J＝10.1Hz,8.2Hz,6.6Hz,GluNAcIII-H-2),0.88(s,9H,Si-C(CH3)3),0.87(s,9H,Si-C(CH3)3),0.04(s,9H,3×Si(CH3)),0.02(s,3H,Si(CH3))ppm；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.5,171.1,167.5,166.9,165.5,165.3,165.2,164.8,164.7(C＝O),133.6,133.6,133.5,133.3,129.9,129.8,129.7,129.1,128.9,128.7,128.7,128.6,128.5,128.5,128.4,128.3(aromatic C),100.9,100.8,98.2(GluNAcI-C1),97.2(GluNAcIII-C1),82.9(C×2,GluNAcI andIII-C3),76.2,74.4,74.2,72.4,71.9,71.8,71.7,71.7,70.1,69.5,69.4,69.3,63.0,62.7,58.4(GluNAcI-C2),58.3(GluNAcIII-C2),53.1,53.1,51.3,29.3,28.7,26.4,25.9,25.8,25.5,23.3,23.1,18.4,18.2,-5.1(TBDMS),-5.2(TBDMS),-5.2(C×2,(TBDMS))ppm；
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值C83H108N5O28Si2,1678.6714,實測值1678.6676.
實施例16：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷3.0g(1.8mmol)溶于二氯甲烷(18mL),滴加戴斯-馬丁高碘試劑的二氯甲烷溶液9.0mmol，反應(yīng)于室溫下攪拌18h。待反應(yīng)完成后用含有10％硫代硫酸鈉和5％碳酸氫鈉的水溶液淬滅反應(yīng)，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，殘留物通過一短硅膠柱(CH2Cl2:MeOH＝10:1洗脫)并濃縮洗脫液得2.9g白色無定形固體，產(chǎn)率95％。經(jīng)核磁與質(zhì)譜鑒定所得白色無定形固體為產(chǎn)物與其一水合物和二水合物的混合物，將混合物于高真空條件下加熱脫水可轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)的產(chǎn)物。
Rf＝0.60(SiO2,CH2Cl2:EtOAc:MeOH＝1:1:0.10)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01-7.27(m,25H),6.41(d,1H,NHAc),6.13(d,1H,NHAc),5.87(dd,J＝J＝9.1Hz,1H),5.68(dd,J＝J＝9.6Hz,1H),5.58-5.55(m,3H),5.45(dd,J＝J＝7.11Hz,1H),5.34-5.29(m,2H),5.06(d,J＝9.5Hz,1H),5.01-4.97(m,2H),4.48(d,J＝9.1Hz,1H),4.23(d,J＝9.9Hz,1H),4.15(d,J＝9.6Hz,1H),4.06-4.04(m,2H),3.84(s,3H),3.82-3.73(m,2H),3.69(m,1H),3.63(s,3H),3.49-3.38(m,3H),3.29-3.23(m,4H),1.94(s,3H),1.89(s,3H),1.58-1.26(m,8H),0.87(s,9H),0.80(s,9H),0.06(s,3H),0.05(s,3H),-0.01(s,3H),-0.07(s,3H)ppm；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ198.6(2C,ketone),172.0-164.9(9C＝O),133.5-128.4(aromatic C),99.5,98.9(2C),98.6,79.1,78.4,78.0,77.8,76.2,74.0,73.2,72.1,71.9,71.7,69.64,69.56,61.7,60.5,60.4,53.1,53.0,51.3,29.2,28.7,26.4,25.82(tert-Butyl C),25.81(tert-Butyl C),25.4,23.5,23.3,18.3,18.2,-5.3(2C),-5.4,-5.5ppm；
HRMS(ESI):[M+NH4]+:計算值C83H107N6O28Si2,1691.6629,實測值1691.6666.
實施例17：1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚基-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3-二-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(6-O-二甲基叔丁基硅醚-4-酮-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)]己烷1.7g(1.0mmol)溶于40mL新蒸干燥四氫呋喃中，并于氬氣氣氛下冷卻至-78℃，緩慢滴加市售1M三異丁基硼氫化鋰的四氫呋喃溶液2.2mL(2.2mmol)，并在-78℃氬氣氣氛下反應(yīng)30min。反應(yīng)液用冰醋酸淬滅，而后將反應(yīng)液減壓濃縮，以乙酸乙酯(40mL)溶解剩余物。有機(jī)相依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，水相用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，以無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得白色無定形粉末。將此粉末溶于少量二氯甲烷，在快速攪拌下滴加乙醚至析出白色沉淀，并繼續(xù)滴加乙醚至沉淀析出完全，離心收集沉淀并用少量乙醚洗滌，干燥。
將此沉淀置于50mL塑料離心管中，加入10mL四氫呋喃與10mL吡啶并冷卻至0℃。緩慢滴加HF·Pyridine 1mL，反應(yīng)液緩慢升至室溫并在室溫下攪拌24h.TLC顯示反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液溶于過量乙酸乙酯中，并依次用10％CuSO4水溶液，0.01N EDTA二鈉鹽水溶液與飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相以無水硫酸鈉干燥，過濾，得白色無定形固體。將所得固體依次用無水乙醇與異丙醇重結(jié)晶，得910mg白色粉末，兩步產(chǎn)率62％。
Rf＝0.43(SiO2,CH2Cl2:MeOH＝20:1.6).
1H NMR(400MHz,CDCl3/CD3OD＝2/1)δ7.95-7.27(m,25H,PhH),5.99(dd,J＝J＝9.5Hz,1H),5.63-5.50(m,3H),5.31(dd,J＝J＝7.9Hz,1H),5.15(d,J＝7.9Hz,1H),5.05(d,J＝7.6Hz,1H),4.62(d,J＝8.7Hz,1H),4.54(d,J＝10.2Hz,1H),4.42-3.36(m,2H),4.24(d,J＝8.2Hz,1H),4.10-4.07(m,2H),3.99-3.97(m,1H),3.91-3.70(m,9H),3.61(s,3H),3.49(dd,J＝J＝6.1Hz,1H),3.44-3.38(m,1H),3.30-3.15(m,5H),1.54-1.49(m,4H),1.31-1.25(m,10H)ppm.
13C NMR(100MHz,CDCl3/CD3OD＝2/1)δ172.5-164.3(9C＝O),135.2-128.9(ArH),101.7,101.5,101.3,100.8,81.2,80.4,75.9,74.6,74.4,74.3,73.4,72.4,72.0,71.8,71.6,70.1,68.9,67.7,66.7,61.0,59.9,52.4,52.3,51.1,29.1,28.5,26.2,25.2,21.7,21.5ppm.
HRMS(ESI):[M+H]+:計算值1450.4983,實測值1450.5001.
實施例18:1-疊氮-6-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(4,6-二硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(4,6-二硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷，即硫酸軟骨素E四糖
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷300mg(1.0equiv.)與三氧化硫三甲胺復(fù)合物(20equiv.)溶于無水DMF(4mL)中。反應(yīng)液在50℃℃下反應(yīng)48h后將反應(yīng)液冷卻至室溫，將反應(yīng)液用滴管加至一Sephadex LH-20填充的玻璃柱的上端(填料體積為(2.5cm×140cm)),以二氯甲烷：甲醇＝1：1的洗脫劑洗脫，所得流分經(jīng)硅膠板紫外254nm監(jiān)測，有熒光的流分合并濃縮，得白色泡沫。將此泡沫狀固體溶于THF：H2O＝3：1的混合溶液(10mL)中，冷卻至-10℃，滴加新制的1M LiOH的水溶液與35％雙氧水的混合溶液(體積比為2：1,5mL)，反應(yīng)液于-10℃下攪拌1h后移至室溫繼續(xù)攪拌8h。將反應(yīng)液冷卻至0℃。加入甲醇(8mL),4M NaOH的水溶液(4mL)后緩慢移至室溫，并在室溫下攪拌12h。反應(yīng)用陽離子樹脂中和至中性，過濾，以蒸餾水潤洗樹脂多次，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至干，將剩余物以雙蒸水洗脫，Sephadex LH-20柱脫鹽純化，收集有產(chǎn)物的流分,合并后凍干。得200mg白色泡沫狀固體，得率80％。
實施例19:1-疊氮-6-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(6-硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(6-硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷，即硫酸軟骨素C四糖
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷300mg(1.0equiv.)與三氧化硫三甲胺復(fù)合物(5equiv.)溶于無水DMF(10mL)中。反應(yīng)液在40℃下反應(yīng)48h后將反應(yīng)液冷卻至室溫，將反應(yīng)液用滴管加至一Sephadex LH-20填充的玻璃柱的上端(填料體積為(2.5cm×140cm)),以二氯甲烷：甲醇＝1：1的洗脫劑洗脫，所得流分經(jīng)硅膠板紫外254nm監(jiān)測，有熒光的流分合并濃縮，得白色泡沫。將此泡沫狀固體溶于THF：H2O＝3：1的混合溶液(10mL)中，冷卻至-10℃，滴加新制的1M LiOH的水溶液與35％雙氧水的混合溶液(體積比為2：1,5mL)，反應(yīng)液于-10℃下攪拌1h后移至室溫繼續(xù)攪拌8h。將反應(yīng)液冷卻至0℃。加入甲醇(8mL),4M NaOH的水溶液(4mL)后緩慢移至室溫，并在室溫下攪拌12h。反應(yīng)用陽離子樹脂中和至中性，過濾，以蒸餾水潤洗樹脂多次，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至干，將剩余物以雙蒸水洗脫，Sephadex LH-20柱脫鹽純化，收集有產(chǎn)物的流分，合并后凍干。得150mg白色泡沫狀固體，得率69％。
實施例20:1-疊氮-6-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(4-硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸基)-(1→3)-(4-硫酸酯基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷，即硫酸軟骨素A四糖
取1-疊氮-6-O-[(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-苯甲?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃半乳糖基)]己烷190mg(1.0equiv.)，與氰基苯甲酰(4.0equiv.)在無水吡啶存在下于室溫攪拌24h。在冰水浴下以甲醇淬滅反應(yīng)后減壓濃縮至干，剩余物用無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀，以乙酸乙酯溶解，依次用1N鹽酸水溶液洗滌，飽和NaHCO3水溶洗滌，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得淡黃色泡沫狀固體。將此固體與三氧化硫三甲胺復(fù)合物(10equiv.)溶于無水DMF(2.5mL)中。反應(yīng)液在50℃下反應(yīng)12h后將反應(yīng)液冷卻至室溫，將反應(yīng)液用滴管加至一Sephadex LH-20填充的玻璃柱的上端(填料體積為(2.5cm×140cm)),以二氯甲烷：甲醇＝1：1的洗脫劑洗脫，所得流分經(jīng)硅膠板紫外254nm監(jiān)測，有熒光的流分合并濃縮，得白色泡沫。將此泡沫狀固體溶于THF：H2O＝3：1的混合溶液(10mL)中，冷卻至-10℃，滴加新制的1M LiOH的水溶液與35％雙氧水的混合溶液(體積比為2：1,2mL)，反應(yīng)液于-10℃下攪拌1h后移至室溫繼續(xù)攪拌8h。將反應(yīng)液冷卻至0℃。加入甲醇(4mL),4M NaOH的水溶液(2mL)后緩慢移至室溫，并在室溫下攪拌12h。反應(yīng)用陽離子樹脂中和至中性，過濾，以蒸餾水潤洗樹脂多次，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至干，將剩余物以雙蒸水洗脫，Sephadex LH-20柱脫鹽純化，，收集有產(chǎn)物的流分，合并后凍干。得80mg白色泡沫狀固體，得率58％。