本發(fā)明涉及一種高純度羅漢果苷V的分離純化方法，具體涉及一種以羅漢果粗制品為原料，制得高純度羅漢果苷V的分離純化方法。

背景技術(shù)：

羅漢果味甘性涼，歸肺、大腸經(jīng)，有潤肺止咳，生津止渴的功效，適用于肺熱或肺燥咳嗽，百日咳及暑熱傷津口渴等，此外還有潤腸通便的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，羅漢果含有一種比蔗糖甜300倍的甜味素——羅漢果苷V，熱量僅為蔗糖的五十分之一，是一種十分理想的天然甜味劑，可作為糖尿病、肥胖等不宜吃糖者的理想替代糖源。

羅漢果苷V純度的高低是衡量其甜度和口感的重要指標(biāo)，高純度的羅漢果苷V目前在國內(nèi)外食品、飲料行業(yè)備受青睞。

雖然羅漢果提取物在國內(nèi)早已實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)，但是，現(xiàn)有產(chǎn)品中的羅漢果苷V的純度普遍在60%以下，高純度羅漢果苷V的制備僅停留在理論和實(shí)驗(yàn)室階段，高純度羅漢果苷V的批量生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。

CN1706861A公開了一種高純度羅漢果甜苷V的制備方法和用途，在純化步驟采用正相硅膠柱層析和反相硅膠C-18柱串聯(lián)分離技術(shù)，正相硅膠柱層析使用的洗脫劑為氯仿和甲醇，反相硅膠C-18柱使用的洗脫劑為丙酮和水。該方法使用正向硅膠和反向硅膠串聯(lián)分離，工藝繁瑣，規(guī)模化難度大、投資高，在技術(shù)效果部分對羅漢果苷V的收率和純度均無具體描述；且使用的溶劑都屬于第二類毒性有機(jī)溶劑（無基因毒性，但有動(dòng)物致癌性的溶劑），在食品藥品行業(yè)不宜使用。

CN 103923152 B公開了一種羅漢果甙 V 的提取方法，是以羅漢果鮮果為原料，經(jīng)提取、大孔樹脂吸附分離、離子交換樹脂精制、硅膠精制后濃縮再噴霧干燥，獲得終產(chǎn)品羅漢果甙V提取物。該方法采用大孔樹脂富集羅漢果糖的各種甙元，而采用水相中硅膠吸附雜質(zhì)的方法分離純化，其精制的產(chǎn)品含量最高也只能達(dá)到60%，不能將苷V與其它羅漢果甜苷分離開。

CN 101402665 B公開了一種羅漢果苷 V 的制備方法，其中，粗苷采用硅膠柱層析和后續(xù)的 C18 反相柱層析，正相硅膠柱層析使用的洗脫劑為二氯甲烷和乙醇，反相硅膠C-18柱使用的洗脫劑為乙腈和水。雖然正相硅膠層析加反相C18柱串聯(lián)的純化效果較為理想，但是，最終轉(zhuǎn)移率很低，只有50%左右，而且操作過程復(fù)雜，對餾出物需分成小份，如接收的每一小杯為20mL都要頻繁進(jìn)行 HPLC 檢測，設(shè)備投資高、規(guī)模小，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

CN 102659739 A公開了一種白楊黃素二甲醚的提取方法，屬于植物有效成分提取分離技術(shù)領(lǐng)域，使用硅膠拌樣上硅膠層析柱，但其硅膠拌樣為實(shí)驗(yàn)室常用手法，采用有機(jī)溶劑拌樣，然后揮干再裝柱，存在操作時(shí)間長、量少、安全隱患，不適合工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種產(chǎn)品收率、純度高，工藝簡單，操作性強(qiáng)，安全環(huán)保，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的高純度羅漢果苷V的分離純化方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種高純度羅漢果苷V的分離純化方法，包括以下步驟：

（1）溶解、離心：取羅漢果粗制品，加水進(jìn)行溶解，離心，得離心液；

（2）超濾、納濾、濃縮：將步驟（1）所得離心液進(jìn)行超濾，納濾，真空濃縮，得濃縮液；

（3）硅膠拌樣、洗脫、濃縮：將步驟（2）所得濃縮液與硅膠混合拌樣，干燥，裝入硅膠層析柱，然后用洗脫液進(jìn)行洗脫，分段收集目標(biāo)餾分，濃縮，干燥，得羅漢果苷V干粉；

（4）結(jié)晶、洗滌、干燥：將步驟（3）所得羅漢果苷V干粉溶解，過濾，結(jié)晶，晶體洗滌、干燥，得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述羅漢果粗制品中羅漢果苷V的質(zhì)量含量為20～50%。羅漢果鮮果經(jīng)破碎后水提，提取液經(jīng)冷卻、離心、過濾后，上大孔吸附層析柱，洗脫液經(jīng)脫鹽、脫色，即得羅漢果粗制品，這是本領(lǐng)域常用的得到羅漢果粗制品的方法，也可市購。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述水的用量為羅漢果粗制品質(zhì)量的10～20倍。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，為了更有利于后續(xù)的超濾、納濾，溶解羅漢果粗制品的水量若低于10倍，則超濾、納濾效果欠佳，若高于20倍，分離純化效果無明顯提升，徒然浪費(fèi)水資源。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述離心的速率為10000～15000r/min。所述離心優(yōu)選管式離心。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，若離心速率低于10000r/min，則分離效果欠佳，若離心速率高于15000r/min，分離效果無明顯提升。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述超濾所用超濾膜的截留分子量為10000～30000道爾頓；超濾時(shí)，膜的壓力為1.0～2.0MPa，溫度為10～25℃，超濾至濾出液電導(dǎo)率≤500μs/cm為止。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述納濾所用納濾膜的截留分子量為1000～5000道爾頓；納濾時(shí)，膜的壓力為2.0～4.0MPa，溫度為10～25℃，納濾濃縮至料液中固形物的質(zhì)量濃度為10～30%，濾出液電導(dǎo)率≤500μs/cm為止。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述真空濃縮的真空度為-0.10～-0.06MPa，溫度為60～90℃；真空濃縮至濃縮液中固形物的質(zhì)量濃度為60～70%。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述硅膠的用量為濃縮液質(zhì)量的0.5～5.0倍（更優(yōu)選1～4倍）。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，濃縮液直接上硅膠層析展開時(shí)色譜帶拖尾嚴(yán)重、重疊，分離效果欠佳；而采用拌樣上柱時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硅膠的用量為濃縮液質(zhì)量的0.5～5.0倍時(shí)，展開效果較好，其中，拌樣硅膠用量越少，即展開原點(diǎn)越集中時(shí)，在洗脫時(shí)，每個(gè)成分的色譜帶間隔大，色譜帶在硅膠柱上的分離越好，展開效果越佳。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述混合拌樣后的干燥為烘箱干燥，溫度為50～70℃，烘干至表面干燥即可；所述濃縮后的干燥為微波干燥，干燥的真空壓力為-0.10～-0.08MPa，溫度為30～40℃，干燥至產(chǎn)品中水分含量＜5%。選用微波干燥，可保證干燥過程中干粉不焦化、碳化。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述洗脫液為乙酸乙酯和乙醇的體積比為20/80～50/50的混合溶液。所述乙酸乙酯和乙醇均為食品級，發(fā)明人通過薄層展開實(shí)驗(yàn)，確定洗脫用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液以20/80～50/50的體積比混合，其薄層展開效果較好。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述洗脫液的用量為6～15BV（更優(yōu)選8～12BV），洗脫的流速為0.1～2.5BV/h（更優(yōu)選0.2～1.0BV/h）。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫液用量小于6BV時(shí)，洗脫程度欠佳，而當(dāng)洗脫液用量大于15BV時(shí)，造成試劑浪費(fèi)。通過對照羅漢果苷V標(biāo)樣點(diǎn)薄層檢測，確定要收集的目標(biāo)餾分段，一般為3.5～10.0BV段。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述羅漢果苷V干粉溶解所用試劑為乙酸乙酯和乙醇的體積比為70/30～80/20的混合溶液，每100mL試劑中溶解羅漢果苷V干粉40～60g（更優(yōu)選50～55g），所述溶解的溫度為50～70℃。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述結(jié)晶的溫度為2～5℃，結(jié)晶的時(shí)間為20～28h。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）按照本發(fā)明方法所得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品的純度≥98.4%，最終收率＞90%；

（2）本發(fā)明方法打破現(xiàn)有技術(shù)的局限，簡化工藝流程，操作性強(qiáng)，不使用有毒有害化學(xué)溶劑，安全環(huán)保，且成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

本發(fā)明實(shí)施例所使用的羅漢果粗制品，編號V25，購于湖南華誠生物資源股份有限公司，羅漢果苷V的質(zhì)量含量為25%；所使用的乙酸乙酯和乙醇均為食品級材料；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

（1）溶解、離心：取100g羅漢果粗制品，加入1kg去離子水進(jìn)行溶解，在離心速率10000r/min下，進(jìn)行管式離心，得離心液；

（2）超濾、納濾、濃縮：將步驟（1）所得離心液用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜，在膜的壓力為1.0MPa，溫度為10℃的條件下，超濾至濾出液電導(dǎo)率為500μs/cm為止，所得超濾液再用截留分子量為1000道爾頓的納濾膜，在膜的壓力為2.0MPa，溫度為10℃，納濾濃縮至料液中固形物的質(zhì)量濃度為10%，濾出液電導(dǎo)率為500μs/cm為止，所得納濾截留液再在真空度-0.065MPa，溫度88℃下，真空濃縮至濃縮液中固形物的質(zhì)量濃度為61%，得濃縮液130g；

（3）硅膠拌樣、洗脫、濃縮：將步驟（2）所得130g濃縮液與130g硅膠混合拌樣，在熱風(fēng)烘箱中，60℃下烘干至硅膠表面干燥，裝入硅膠層析柱，然后用12BV乙酸乙酯和乙醇的體積比為20/80的混合溶劑，以流速0.25BV/h進(jìn)行洗脫，分段收集餾分，通過對照羅漢果苷V標(biāo)樣點(diǎn)薄層檢測，取6～10BV段餾分進(jìn)行濃縮，再在真空壓力為-0.1MPa，溫度為30℃，微波干燥至產(chǎn)品水分含量＜5%，得羅漢果苷V干粉27.3g；

（4）將步驟（3）所得27.3g羅漢果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的體積比為70/30的混合溶劑，在60℃下充分溶解，過濾，然后放置于5℃的冷藏室結(jié)晶24h后，對晶體進(jìn)行洗滌、干燥，得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品23.5g。

用液相外標(biāo)檢測法，檢測本實(shí)施例所得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品的純度為98.9%，收率為92.97%。

實(shí)施例2

（1）溶解、離心：取100g羅漢果粗制品，加入1.5kg去離子水進(jìn)行溶解，在離心的速率13000r/min下，進(jìn)行管式離心，得離心液；

（2）超濾、納濾、濃縮：將步驟（1）所得離心液用截留分子量為20000道爾頓的超濾膜，在膜的壓力為1.5MPa，溫度為15℃的條件下，超濾至濾出液電導(dǎo)率為400μs/cm為止，所得超濾液再用截留分子量為3000道爾頓的納濾膜，在膜的壓力為2.6MPa，溫度為15℃，納濾濃縮至料液中固形物的質(zhì)量濃度為20%，濾出液電導(dǎo)率為400μs/cm為止，所得納濾截留液再在真空度-0.08MPa，溫度70℃下，真空濃縮至濃縮液中固形物的質(zhì)量濃度為65%，得濃縮液122g；

（3）硅膠拌樣、洗脫、濃縮：將步驟（2）所得122g濃縮液與240g硅膠混合拌樣，在熱風(fēng)烘箱中，60℃下烘干至硅膠表面干燥，裝入硅膠層析柱，用10BV乙酸乙酯和乙醇的體積比為30/70的混合溶劑，以流速0.5BV/h進(jìn)行洗脫，分段收集餾分，通過對照羅漢果苷V標(biāo)樣點(diǎn)薄層檢測，取5～8.5BV段餾分濃縮，再在真空壓力為-0.088MPa，溫度為35℃，微波干燥至產(chǎn)品水分含量＜5%，得羅漢果苷V干粉26.1g；

（4）將步驟（3）所得26.1g羅漢果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的體積比為70/30的混合溶劑，在70℃下充分溶解，過濾，然后放置于4℃的冷藏室結(jié)晶24h后，對晶體進(jìn)行洗滌、干燥，得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品23.6g。

用液相外標(biāo)檢測法，檢測本實(shí)施例所得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品的純度為98.6%，收率為93.08%。

實(shí)施例3

（1）溶解、離心：取100g羅漢果粗制品，加入2.0kg去離子水進(jìn)行溶解，在離心的速率15000r/min下，進(jìn)行管式離心，得離心液；

（2）超濾、納濾、濃縮：將步驟（1）所得離心液用截留分子量為30000道爾頓的超濾膜，在膜的壓力為2MPa，溫度為20℃的條件下，超濾至濾出液電導(dǎo)率為300μs/cm為止，所得超濾液再用截留分子量為5000道爾頓的納濾膜，在膜的壓力為3MPa，溫度為20℃，納濾濃縮至料液中固形物的質(zhì)量濃度為30%，濾出液電導(dǎo)率為300μs/cm為止，所得納濾截留液在真空度-0.1MPa，溫度60℃下，真空濃縮至濃縮液中固形物的質(zhì)量濃度為70%，得濃縮液110g；

（3）硅膠拌樣、洗脫、濃縮：將步驟（2）所得110g濃縮液與440g硅膠混合拌樣，在熱風(fēng)烘箱中，60℃下烘干至硅膠表面干燥，裝入硅膠層析柱，用8BV乙酸乙酯和乙醇的體積比為50/50的混合溶劑，以流速0.5BV/h進(jìn)行洗脫，分段收集餾分，通過對照羅漢果苷V標(biāo)樣點(diǎn)薄層檢測，取3.5～6.5BV段餾分濃縮，再在真空壓力為-0.080MPa，溫度為40℃，微波干燥至產(chǎn)品水分含量＜5%，得羅漢果苷V干粉27.3g；

（4）將步驟（3）所得27.3g羅漢果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的體積比為80/20的混合溶劑，在50℃下充分溶解，過濾，然后放置于2℃的冷藏室結(jié)晶24h后，對晶體進(jìn)行洗滌、干燥，得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品23.1g。

用液相外標(biāo)檢測法，檢測本實(shí)施例所得高純度羅漢果苷V產(chǎn)品的純度為98.4%，收率為90.92%。