本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種白藜蘆醇的組合生物合成方法。

背景技術(shù)：

白藜蘆醇的化學(xué)名為(E)-5-[2-(4-羥苯基)-乙烯基]-1,3-苯二酚，英文名為Resveratrol，屬非黃酮類(lèi)多酚化合物中的一種，分子式為C₁₄H₁₂，相對(duì)分子質(zhì)量為228.25，作為植物抗逆物質(zhì)被首次發(fā)現(xiàn)于葡萄樹(shù)中。隨著各國(guó)學(xué)者對(duì)白藜蘆醇藥理學(xué)的深入研究，白藜蘆醇的反式異構(gòu)體被指出具有延緩衰老、保護(hù)心血管和減少脂質(zhì)積累等多種與改善人類(lèi)健康有關(guān)的生物活性。也正因此，反式結(jié)構(gòu)的白藜蘆醇被開(kāi)發(fā)應(yīng)用在保健食品、護(hù)膚化妝品及輔助藥品等領(lǐng)域中。市場(chǎng)需求的日益增大，使人們開(kāi)始關(guān)注白藜蘆醇的生產(chǎn)問(wèn)題。目前，白藜蘆醇的獲取主要通過(guò)從植物虎杖或葡萄的組織中進(jìn)行分離提取。然而，白藜蘆醇在植物中的含量非常低下，傳統(tǒng)的獲取方式在提倡環(huán)境友好型社會(huì)發(fā)展的當(dāng)今有著諸多的弊端。其次，植物中的多種白藜蘆醇類(lèi)似物難以通過(guò)低成本和無(wú)公害的方式進(jìn)行去除。雖然，活性物質(zhì)的分離純化技術(shù)在國(guó)內(nèi)外的科學(xué)研究推動(dòng)下不斷地進(jìn)步，但是環(huán)境破壞的問(wèn)題仍然未能有效解決。因此，合成白藜蘆醇的研究方向慢慢轉(zhuǎn)移到了有機(jī)化學(xué)合成和生物技術(shù)合成上?；瘜W(xué)合成現(xiàn)今面臨反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，高能耗、毒副產(chǎn)品及環(huán)境污染等難題未能解決。而生物技術(shù)合成方面主要利用重組微生物工程菌株的發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)，微生物菌株能簡(jiǎn)便地從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)，且具有生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)成本低、產(chǎn)物提純簡(jiǎn)便和環(huán)境污染少等優(yōu)勢(shì)，相比起來(lái)，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)改造大腸桿菌，使其合成白藜蘆醇的研究已有所報(bào)道，合成策略主要分為兩種。第一種為構(gòu)建攜帶一個(gè)或兩個(gè)載體共表達(dá)對(duì)香豆酰輔酶A連接酶(4CL，EC 6.2.1.12)和白藜蘆醇合酶(RS，EC 2.3.1.95)編碼基因的工程菌株，外源添加前體物對(duì)香豆酸，發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)白藜蘆醇。第二種為構(gòu)建攜帶一個(gè)或兩個(gè)載體共表達(dá)酪氨酸解氨酶(TAL，EC 4.3.1.23)、4CL和RS編碼基因的工程菌株，外源添加前體物L(fēng)-酪氨酸或不添加任何底物，發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)白藜蘆醇。

根據(jù)上述關(guān)于白藜蘆醇在國(guó)內(nèi)外的研究狀況，對(duì)本發(fā)明的必要性作其總結(jié)。

其一，反式白藜蘆醇因其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具備多種的生物活性，是一種高價(jià)值和功效強(qiáng)的天然產(chǎn)物，在食品醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域有著十分龐大的需求量。

其二，國(guó)內(nèi)的白藜蘆醇的保健品市場(chǎng)已落后于美國(guó)及歐美國(guó)家，在白藜蘆醇的制備技術(shù)上，國(guó)內(nèi)仍以犧牲自然植物資源為代價(jià)進(jìn)行生產(chǎn)，不利于國(guó)家長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展。合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物的生產(chǎn)應(yīng)用所帶來(lái)的價(jià)值是十分巨大的，未來(lái)的活性物質(zhì)合成方式必將轉(zhuǎn)移到合成生物工程上來(lái)。

其三，白藜蘆醇等芪類(lèi)物質(zhì)的微生物制備仍處在起步階段，有許多問(wèn)題有待解決，能完善和優(yōu)化出一套白藜蘆醇的合成制備體系，定將對(duì)白藜蘆醇的產(chǎn)業(yè)有重要的推動(dòng)作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種白藜蘆醇的組合生物合成方法。

本發(fā)明立足于白藜蘆醇微生物制備的現(xiàn)存問(wèn)題，提出以下幾個(gè)擬解決的科學(xué)問(wèn)題和相應(yīng)的解決策略。

其一，有毒誘導(dǎo)物的使用，大腸桿菌體內(nèi)蛋白表達(dá)系統(tǒng)較為成熟，如Invitrogen公司的pET系統(tǒng)，該系統(tǒng)基本使用毒物異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，而現(xiàn)階段大多數(shù)代謝工程的研究仍沿用此套系統(tǒng)。為此，本發(fā)明提供一種不需誘導(dǎo)物且高效的組成型表達(dá)系統(tǒng)來(lái)解決此問(wèn)題。

其二，表達(dá)元件缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，原核表達(dá)元件包括了啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合序列、載體復(fù)制區(qū)域和宿主等元件的組裝，至今未有標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)系統(tǒng)。為此，本發(fā)明經(jīng)不同元件的組裝測(cè)試后，給出最佳的可應(yīng)用于白藜蘆醇合成的表達(dá)元件組合來(lái)解決此問(wèn)題。

其三，昂貴前體物的使用?，F(xiàn)階段，在重組大腸桿菌中，產(chǎn)量最高的白藜蘆醇生產(chǎn)方式是通過(guò)外源添加前體物對(duì)香豆酸而實(shí)現(xiàn)的。對(duì)香豆酸大多來(lái)源于石油化學(xué)工業(yè)，對(duì)食品和藥品領(lǐng)域而言并不合適，而且對(duì)香豆酸價(jià)格相對(duì)昂貴，大大增加了白藜蘆醇合成成本。為此，本發(fā)明給出分步發(fā)酵的合成方式，先讓工程菌生產(chǎn)大量的對(duì)香豆酸，再以此物作為添加物繼續(xù)白藜蘆醇的發(fā)酵生產(chǎn)，從而解決此問(wèn)題。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種白藜蘆醇的組合生物合成方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建含有表達(dá)框1的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入宿主菌A中，得到工程菌A；所述的表達(dá)框1為組成型啟動(dòng)子+RBS+酪氨酸解氨酶編碼基因+終止子；

(2)對(duì)工程菌A進(jìn)行發(fā)酵，并從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化，得到對(duì)香豆酸提取物；

(3)構(gòu)建含有表達(dá)框2和表達(dá)框3且表達(dá)方向相反的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入宿主菌B中，制備工程菌B；所述的表達(dá)框2為組成型啟動(dòng)子+RBS+對(duì)香豆酰輔酶A連接酶編碼基因+終止子；所述的表達(dá)框3為組成型啟動(dòng)子+RBS+白藜蘆醇合酶編碼基因+終止子；

(4)用含有步驟(2)的對(duì)香豆酸提取物的培養(yǎng)基對(duì)工程菌B進(jìn)行發(fā)酵，并從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化，得到白藜蘆醇。

步驟(1)中所述的表達(dá)載體是拷貝數(shù)為15～20的表達(dá)載體，優(yōu)選為pQE-30；

所述的宿主菌A為高產(chǎn)L-酪氨酸的大腸桿菌，優(yōu)選為E.coli ATCC31884；

所述的酪氨酸解氨酶編碼基因是來(lái)源于粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase，TAL)編碼基因，Genebank登錄號(hào)為KF770992；

步驟(3)中所述的表達(dá)載體是拷貝數(shù)為15～20的表達(dá)載體，優(yōu)選為pQE-30；

所述的宿主菌B為K12系列大腸桿菌，優(yōu)選為E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli MG1665、E.coli MC1061或E.coli M15；

所述的E.coli BL21(DE3)、E.coli MG1665、E.coli MC1061或E.coli M15均為市售菌株。

所述的對(duì)香豆酰輔酶A連接酶編碼基因?yàn)閬?lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)的對(duì)香豆酰輔酶A連接酶(p-Coumaroyl CoA ligase，4CL)編碼基因，Genebank登錄號(hào)為NM_104046.2；

所述的白藜蘆醇合酶編碼基因?yàn)閬?lái)源于葡萄(Vitis vinifera)的白藜蘆醇合酶(Resveratrol synthase，RS)編碼基因，Genebank登錄號(hào)為KC417319.1；

所述的組成型啟動(dòng)子的序列為：

5′-GTCGCGTAATGCTTAGGCACAGGATTGATTTGTCGCAATGATTGACACGATTCCGCTTGACGCTGCGTAAGGTTTTTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCACTA-3′。

所述的RBS的序列為：5′-GAAGGAGATATACAT-3′。

所述的終止子的序列為：

5′-AGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTT CGTTTTAT-3′。

所述的含有步驟(2)的對(duì)香豆酸提取物的培養(yǎng)基中對(duì)香豆酸的濃度大約為80～100mg/L；優(yōu)選為82mg/L。

本發(fā)明的機(jī)理是：首先，分別構(gòu)建兩大生產(chǎn)模塊。第一生產(chǎn)模塊中重組大腸桿菌能利用已構(gòu)建好的組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)酪氨酸解氨酶，并從頭合成對(duì)香豆酸。第二生產(chǎn)模塊中重組大腸桿菌能利用已構(gòu)建好的組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)對(duì)香豆酰輔酶A連接酶和白藜蘆醇合酶，利用第一模塊生產(chǎn)的對(duì)香豆酸，合成白藜蘆醇。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

分步培養(yǎng)的好處是兩個(gè)生產(chǎn)模塊能單獨(dú)進(jìn)行調(diào)節(jié)，理論上更有利于使各模塊達(dá)到其最大的產(chǎn)值。從頭合成白藜蘆醇降低了生產(chǎn)成本，更有利于工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是構(gòu)建的表達(dá)載體pA的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是構(gòu)建的表達(dá)載體pB的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是白藜蘆醇組合生物合成策略。

圖4是HPLC測(cè)定對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品。

圖5是HPLC測(cè)定白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品。

圖6是HPLC測(cè)定發(fā)酵液中白藜蘆醇生產(chǎn)量和對(duì)香豆酸殘余量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

本發(fā)明的白藜蘆醇組合生物合成策略如圖3所示。

實(shí)施例1

1、構(gòu)建表達(dá)載體pQE-30-啟動(dòng)子-RBS-TAL編碼基因-終止子，簡(jiǎn)稱pA，如圖1所示；并將其轉(zhuǎn)入宿主菌A(E.coli ATCC31884，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，https://www.atcc.org/Products/All/31884.aspx)中，得到工程菌A；其中，載體pQE-30購(gòu)自QIAGEN公司；所述的TAL編碼基因的Genebank登錄號(hào)為KF770992。

所述的啟動(dòng)子的序列為：

5′-GTCGCGTAATGCTTAGGCACAGGATTGATTTGTCGCAATGATTGACACGATTCCGCTTGACGCTGCGTAAGGTTTTTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCACTA-3′。

所述的RBS的序列為：5′-GAAGGAGATATACAT-3′。

所述的終止子的序列為：

5′-AGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAT-3′。

2、挑取工程菌A單菌落至裝有100mL YM9培養(yǎng)液(1L YM9配方：17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄，0.5g NaCl，1g NH₄Cl，10g酵母提取物，50mL甘油，42g Morpholinepropanesulfonic acid(MOPS，3-嗎啉丙磺酸)，pH 7.0)的250mL三角瓶中，并加入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素在37℃，200r/min搖床培養(yǎng)12h。

3、把工程菌A的預(yù)培養(yǎng)液離心收集菌體后，加入到裝有100mL YM9培養(yǎng)液的500mL三角瓶中，并加入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素，發(fā)酵培養(yǎng)12h，所有樣品用2倍體積的乙酸乙酯抽提30min，12000r/min離心8min，取上層液體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把乙酸乙酯去除后，用2mL 1mmol/L Tris-HCl溶解濃縮物，即對(duì)香豆酸提取物。

4、構(gòu)建含有表達(dá)框2和表達(dá)框3且表達(dá)方向相反的表達(dá)載體，簡(jiǎn)稱pB，如圖2所示；并將轉(zhuǎn)入宿主菌B(E.coli DH5α，購(gòu)自Novagen公司)中，制備工程菌B；所述的表達(dá)框2為啟動(dòng)子+RBS+4CL編碼基因+終止子；所述的表達(dá)框3為啟動(dòng)子+RBS+RS編碼基因+終止子；其中，所述的表達(dá)載體為pQE-30；所述的4CL編碼基因的Genebank登錄號(hào)為NM_104046.2；所述的RS編碼基因的Genebank登錄號(hào)為KC417319.1。

所述的啟動(dòng)子、RBS、終止子的序列同步驟1。

5、挑取工程菌B單菌落至裝有100mL YM9培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，并加入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素在37℃，200r/min搖床培養(yǎng)12h。

6、把工程菌B的預(yù)培養(yǎng)液離心收集菌體后加入到裝有100mL YM9培養(yǎng)液的500mL三角瓶中，并加入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素和步驟2的對(duì)香豆酸提取物(對(duì)香豆酸的濃度大約為82mg/L)，發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵液用2倍體積的乙酸乙酯抽提30min，12000r/min離心8min，取上層液體，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把乙酸乙酯去除后，用2mL甲醇溶解濃縮物。

7、采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定樣品中對(duì)香豆酸和白藜蘆醇的含量，色譜條件如下：C18反相柱(5μm，250mm×4.6mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm；流速：1mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：乙腈：水(30：60)。制作此HPLC條件下，對(duì)香豆酸和白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，得工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為Y＝8.94×X^-6-1.282，相關(guān)系數(shù)R²＝0.9986。其中Y為白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位為mg/L；X為峰面積，單位為μAU*s(圖5)。對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為Y＝6.8×X^-6+0.035，相關(guān)系數(shù)R²＝0.9997。其中Y為對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位為mg/L；X為峰面積，單位為μAU*s(圖4)。菌體生長(zhǎng)情況檢測(cè)使用紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)波長(zhǎng)為600nm，以YM9培養(yǎng)液作為空白。

8、結(jié)果如圖6所示，最終測(cè)得甲醇濃縮物中白藜蘆醇的含量為60.35±3.54mg/L，對(duì)香豆酸剩余量為23.77±2.45mg/L，菌體濃度OD₆₀₀為6.35±0.14，共耗時(shí)48h。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。