本發(fā)明屬于分析化學技術領域，涉及一種檢測過氧化氫的熒光探針及其應用。

背景技術：

過氧化氫是一種重要的活性氧物質，在生物機體活動和外界環(huán)境中有著極其重要的應用。在自然環(huán)境中，過氧化氫可以用來凈化自來水，在生物進行生命活動的時候，過氧化氫在細胞代謝過程中發(fā)揮著免疫標志的功能。生物新陳代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫（H₂O₂）是生命活動所必需的，過氧化氫在生理過程中有著重要作用。最近幾年的研究表明，過氧化氫可以以信號分子的角色對生理和病理過程進行調節(jié)，與細胞的增殖分化以及遷移過程息息相關，除此之外，過氧化氫在很多病理過程中例如炎癥、機體防御等方面也發(fā)揮著重要作用。但是很多疾病也是由于過量的過氧化氫而引起的，例如：癌癥、阿爾察默病等疾病。因此實時定量的檢測生物機體和外界環(huán)境中的過氧化氫具有非常重要的意義。

目前主要通過比色法、電化學法、滴定法、色譜法等方式來實現(xiàn)對過氧化氫的檢測，雖然以上這些方法能夠靈敏而且選擇性的檢測過氧化氫，但是它們大多操作復雜、受干擾因素影響大、耗時又耗力，無法實現(xiàn)對生物體中的過氧化氫實時、迅速、原位定量分析和檢測。因此目前急需設計和開發(fā)新型的過氧化氫檢測方法。近幾年來，人們通過熒光探針法與激光共聚焦成像技術的結合，很好的對生物組織和活細胞中的過氧化氫進行了“可見、定量、實時”的檢測。研究表明，熒光探針法具有容易操作，高選擇性和靈敏度，很好的生物相容性，也能使檢測對象免遭破壞等優(yōu)點，廣泛應用在化學、生物、環(huán)境和醫(yī)學等領域中。

檢測過氧化氫的熒光探針主要有硼酸及硼酸酯類熒光探針與磺酸酯類熒光探針，2',7'-二氯二氫熒光素（2',7'-dichlorodihydrofluorescein， DCFH）是一種傳統(tǒng)的檢測ROS的探針，它自身無熒光，當它被氧化性物質氧化成2',7'-二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescein， DCF）時，即發(fā)出強烈熒光。然而，這種熒光探針不僅對細胞內活性氧有響應，對其他的氧化物質也有響應，靈敏度和對不同氧化性物質的選擇性都較差。通過把硼酸基團或硼酸酯作為探針的反應位點引入到熒光團分子中巧妙的解決了這個煩惱。由于硼酸基團或硼酸酯能淬滅熒光團發(fā)出的熒光，因此分子探針本身只發(fā)出微弱的熒光或者不發(fā)光，而當過氧化氫與硼酸基團或硼酸酯發(fā)生反應后，硼酸酯被水解成為羥基，繼而發(fā)出熒光。所以熒光探針對過氧化氫的選擇性可以通過引入硼酸酯作為反應位點得到提高。

Chang小組報道了以熒光素為發(fā)光團，以硼酸酯基團作為熒光反應位點的熒光素類的雙硼酸酯熒光探針PF₁（J Am Chem Soc, 2004, 126: 15392-15393.），該探針對過氧化氫的響應比其他活性氧化合物高500倍以上，可以檢測到人體胚腎細胞內微摩爾級的過氧化氫，反應機制如下：

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唐波課題組合成的新型熒光探針FS-1和FS-2（中國科學 B 輯: 化學, 2009, 39 (6): 473-480.）能與檢測超氧陰離子自由基的PNF-1探針（Chem Bio Chem, 2007, 8: 453-458.）聯(lián)合使用同時去檢測活細胞內過氧化氫和超氧陰離子自由基（其中FS-2的發(fā)射波長為520 nm）。FS-2與PNF-1分別作為檢測過氧化氫與超氧陰離子自由基的探針，其熒光光譜互不干擾，很好的實現(xiàn)了同時檢測活細胞內超氧陰離子自由基和過氧化氫的操作。該探針在模擬生理條件下，對過氧化氫有強烈的響應，表現(xiàn)出很好的選擇性，而且不會受到等量的其他生物物質和活性氧的干擾。通過細胞成像實驗得知，小鼠腹膜巨噬細胞在含不同濃度過氧化氫的培養(yǎng)液中培育或由PMA刺激后加入探針FS-1和FS-2后顯現(xiàn)出明亮的綠色熒光，并且靈敏度很高，對細胞中微摩爾級別的過氧化氫濃度變化也能產(chǎn)生響應。以上實驗證明了探針FS-1和FS-2都具有高的膜滲透能力以及良好的選擇性和靈敏度。該探針為研究過氧化氫介導的信號傳導途徑提供了一定的分析方法，具體檢測機制如下：

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綜上所述，為了進一步的揭示和探究過氧化氫在環(huán)境和生物體中作用，設計合成選擇性強、靈敏度高的過氧化氫熒光探針具有非常重要的理論和現(xiàn)實意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術上的不足，提供了一種能夠檢測過氧化氫的熒光探針，并將該探針應用于活細胞中檢測過氧化氫的成像應用。

本發(fā)明所述的一種檢測過氧化氫的熒光探針ACR，其特征在于，所述熒光探針的化學結構式如式（）所示：

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上述檢測過氧化氫的熒光探針ACR以如下方法制備：

中間體A-1的合成：向4-二乙氨基酮酸和對氯間苯二酚的三氟乙酸（TFA）懸浮液中，加入分子篩，之后加熱至90 oC，攪拌6小時。反應結束后將混合物冷卻至室溫并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其在石油醚與乙酸乙酯的混合溶液中重結晶，得到紅色固體A-1。

探針ACR的合成：向2-(疊氮甲基)苯甲酸的二氯甲烷溶液中加入EDCI、DMAP和中間體A-1，之后加熱至室溫并攪拌12小時。反應完成后，將所得溶液倒入水中并用二氯甲烷萃取，合并的有機層，用飽和食鹽水洗滌，后用無水MgSO₄干燥并濃縮，得到紅色油狀粗產(chǎn)物。粗品經(jīng)硅膠色譜柱純化得無色油狀產(chǎn)物ACR。

本發(fā)明的合成如下所示：

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本發(fā)明所述的檢測過氧化氫的熒光探針在檢測活細胞中過氧化氫的應用。

本發(fā)明所述熒光探針可以應于檢測活細胞內的過氧化氫，具體檢測方法為：在Hela細胞中加入10 μM的ACR，在37 oC下培養(yǎng)15分鐘，細胞基本沒有熒光。之后將Hela細胞與10 μM的ACR在37 oC下培養(yǎng)15分鐘后，用PBS洗滌三次，更換培養(yǎng)基，再由過氧化氫緩沖溶液（25 μM）培養(yǎng)15分鐘，細胞發(fā)出強烈的熒光。實驗表明，ACR對細胞中的過氧化氫有良好的成像作用，可以很好的用于檢測生物體中的過氧化氫，在生物醫(yī)學等方面具有重要的潛在應用價值。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所涉及的一種檢測過氧化氫的熒光探針，以羅丹明衍生物為母體，以2-疊氮甲基芳基甲酸酯為開關，能過與過氧化氫特異性反應，本發(fā)明的熒光探針合成簡單，使用方便，可以特異性與過氧化氫發(fā)生反應釋放熒光，在檢測過氧化氫過程中不會受到其他相關氧化物的干擾，對過氧化氫具有良好的選擇性，能對活細胞中的過氧化氫進行檢測，成像效果好，且對細胞毒性低。

附圖說明

圖1是熒光探針ACR的¹H NMR譜圖。

圖2是熒光探針ACR的¹³C NMR譜圖。

圖3是熒光探針ACR的選擇性光譜圖。

圖4是熒光探針ACR隨過氧化氫濃度變化響應光譜圖。

圖5是熒光探針ACR響應時間光譜圖。

圖6是熒光探針ACR抗干擾性測試圖。

圖7是熒光探針ACR對Hela細胞內過氧化氫檢測圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：

中間體A-1的合成：向4-二乙氨基酮酸（6.0 g，19.1 mmol）和對氯間苯二酚15（2.8 g，19.1 mmol）的TFA（20 mL）懸浮液中，加入分子篩（2.0 g），之后加熱至90 oC，攪拌6小時。反應結束后將混合物冷卻至室溫并濃縮，得到粗產(chǎn)物，將其在石油醚：乙酸乙酯為1：1的混合溶液中重結晶，得到紅色固體A-1（7.0 g，95%）。

探針ACR的合成：向2-(疊氮甲基)苯甲酸（252.25 mg，1.43 mmol）的二氯甲烷（5 mL）溶液中加入EDCI（341.50 mg，1.78 mmol），DMAP（72.54 mg，0.59 mmol）和4-二乙氨基酮酸（500.0 mg，1.19 mmol），之后加熱至室溫并攪拌12小時。反應完成后，將所得溶液倒入水（30 mL）中并用二氯甲烷（3 × 20 mL）萃取，合并的有機層，用飽和食鹽水洗滌，后用無水MgSO₄干燥并濃縮，得到紅色油狀粗產(chǎn)物。粗品經(jīng)硅膠色譜柱純化（石油醚：乙酸乙酯 = 5：1）得無色油狀產(chǎn)物ACR（358.81 mg，52%）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.36 (dt, J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.74 (tt, J = 4.1, 2.0 Hz, 1H), 7.71 - 7.69 (m, 1H), 7.69 - 7.65 (m, 1H), 7.63 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.60 - 7.52 (m, 1H), 7.28 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 6.90 (s, 1H), 6.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 9.0, 2.6 Hz, 1H), 4.99 - 4.75 (m, 2H), 3.46 - 3.18 (m, 3H), 1.24 - 1.10 (m, 6H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ169.25, 163.75, 152.55, 150.97, 149.80, 147.87, 138.68, 135.14, 133.96, 132.00, 129.93, 129.90, 129.21, 128.82, 128.41, 126.84, 126.79, 125.15, 124.16, 121.33, 119.04, 112.67, 108.86, 104.33, 97.57, 83.01, 52.98, 44.52, 12.49. HRMS-ESI (m / z) [M + H]⁺ calcd for: C₃₂H₂₆ClN₄O₅⁺, 581.1513, found: 581.1523. FTIR (KBr, cm^-1): 3450, 2918, 2113, 1751,1419, 1343, 1143, 1049, 811, 745.

本發(fā)明對實施例1得到的探針ACR進行了效果測試：

1. ACR選擇性分析

在5 μM的ACR中加入80當量過氧化氫的CH₃OH / PBS緩沖液（其中過氧化氫的濃度為10 mM， pH = 7.4，CH₃OH：PBS緩沖液 = 5：95），檢測結果如圖3，當λ_ex = 470 nm, λ_em = 560 nm 時，ACR對過氧化氫有強烈的熒光響應，而且ACR對其他氧化性物質幾乎沒有響應，說明ACR對過氧化氫具有優(yōu)異的選擇性。

2. ACR對過氧化氫濃度變化響應分析

在5 μM ACR中加入0 - 200個當量（50 - 400 μM）的過氧化氫時，熒光響應強度隨過氧化氫加入量的增加呈規(guī)律性增加，檢測結果如圖4，結果說明ACR對過氧化氫濃度檢測范圍廣且靈敏度高。

3. ACR對過氧化氫響應時間分析

在5 μM的ACR中加入80當量過氧化氫的CH₃OH / PBS緩沖液，對ACR與過氧化氫的響應時間進行了檢測，檢測結果如圖5，結果顯示，在加入過氧化氫后0 - 120分鐘內，ACR對過氧化氫的熒光響應強度隨時間的增加呈線性增強，在較短的時間內就能達到良好的熒光強度。結果表明，ACR對過氧化氫的響應快速，可有效的應用于過氧化氫的檢測。

4. ACR抗干擾性分析

探針ACR在各種氧化性物質和硫醇等其它干擾分子存在的情況下進行了競爭實驗，來檢測ACR的抗干擾性。檢測結果如圖6，在過氧化氫與其他生物硫醇或其他氧化性物質共存的情況下ACR仍然能對其產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光響應。上述結果表明ACR對過氧化氫有著優(yōu)異的抗干擾性，可以在其它氧化性物質及生物硫醇存在的情況下高效的檢測過氧化氫。

5. ACR在細胞檢測中的應用

在Hela細胞中加入10 μM的ACR在37 oC下培養(yǎng)15分鐘，檢測結果如圖7，由圖7中B所示，細胞基本沒有熒光。我們將Hela細胞與10 μM的ACR在37 oC下培養(yǎng)15分鐘后，用PBS洗滌三次，更換培養(yǎng)基，再由過氧化氫緩沖溶液（25 μM）培養(yǎng)15分鐘，由圖7中E所示，細胞發(fā)出強烈的熒光。實驗表明，ACR對細胞中的過氧化氫有良好的成像作用，可以很好的用于檢測生物體中的過氧化氫，在生物醫(yī)學等方面具有重要的潛在應用價值。

上述雖然結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對發(fā)明范圍的限制，所述領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍之內。