一株耐酸細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株及用該菌株制備可食用細(xì)菌纖維素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌及用該菌株制 備可食用細(xì)菌纖維素。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌纖維素 (Bacterial cellulose,BC)是由多種細(xì)菌新陳代謝的產(chǎn)物形成的不 含木素、半纖維素 W及其他抽提物的高結(jié)晶度的S維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。運(yùn)種結(jié)構(gòu)使得BC有著一些 特有的特性.如高純度、高結(jié)晶度、較大的機(jī)械強(qiáng)度、高保水值、抗菌性、無(wú)毒性、生物相容性 和生物降解性等，從而在多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，如生物醫(yī)藥與組織工程、食品、電學(xué)、造 紙、功能材料等。
[0003] 細(xì)菌纖維素屬于水不溶性膳食纖維，它可W改變食物的流變狀態(tài)，可W生產(chǎn)低熱 量、低膽固醇的食物。現(xiàn)代研究人員對(duì)其作為食品配料的添加應(yīng)用很多但是對(duì)其口感的研 究很少。細(xì)菌纖維素作為纖維素食用時(shí)會(huì)有初性、難切斷、難巧嚼的特點(diǎn)，因此制備高巧嚼 性、口感滑爽、脆嫩、細(xì)膩而有彈性的可食用細(xì)菌纖維素也是研究的難點(diǎn)。此外，現(xiàn)代眾多研 究者對(duì)細(xì)菌纖維素菌株篩選、原料選擇、發(fā)酵工藝等方面做了大量研究，對(duì)于細(xì)菌纖維素高 產(chǎn)菌的選育、發(fā)酵基質(zhì)、發(fā)酵工藝的研究報(bào)道很少。本發(fā)明基于運(yùn)一現(xiàn)狀，篩選出一株適用 于工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌株，并W此菌株為出發(fā)點(diǎn)研究可食用細(xì)菌纖維素的制備 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一株耐酸細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株及 用該菌株制備可食用細(xì)菌纖維素的方法。該菌株具有高的抑適應(yīng)能力，在抑2.5~3.0條件 下能良好生長(zhǎng);該菌株在含有挪漿、牛奶、豆奶等乳品培養(yǎng)基中可W產(chǎn)生高品質(zhì)可食用膳食 纖維，也可W用該菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素面膜W及醫(yī)用材料。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株，所述菌株的分類(lèi)命名為木葡糖醋酸桿菌JXla 化omagataeibacter xylinus JXla),保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:M 2015195,保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。
[0007] -種所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株的篩選方法，篩選基質(zhì)為發(fā)酵挪漿，篩選培養(yǎng) 基為：葡萄糖：2 ~4%;酵母膏：0.5 ~1.0 % ;K 出 P〇4:0.1~0.2% ;MgS〇4:0.15 ~0.25%;乙 醇：2~4%;CaC03:0.5~l%;瓊脂：1.5~2%，pH自然。余量為水。
[000引一種所述的菌株生產(chǎn)可食用細(xì)菌纖維素的方法，采用木葡糖醋酸桿菌JXla 化omagataeibacter xylinus JXla)作為發(fā)酵菌株，采用薦糖、葡萄糖為碳源，采用冰醋酸 為能源物質(zhì)，采用挪漿、挪子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉為氮源。具體步驟為：
[0009] (1)初級(jí)種子培養(yǎng):將木葡糖醋酸桿菌JXla化omagataeibacter xylinus JXla)的 斜面種子接到種子培養(yǎng)基，于28~35°C靜置培養(yǎng)17~30h，得到初級(jí)種子液；
[0010] (2)發(fā)酵種子培養(yǎng):將初級(jí)種子液按5%~10%的接種量接種到發(fā)酵種子培養(yǎng)基 中，28~35°C，靜置培養(yǎng)1~3d，得到發(fā)酵種子液；
[0011] (3)淺盤(pán)靜置發(fā)酵:將發(fā)酵種子液按10%~30%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液 高度1.5-2.5畑1，28~35°(：下靜置培養(yǎng)6~8(1。
[001 ^ 步驟（1)所述種子培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖：2~4% ;酵母膏：0.5~1.0%瓜冊(cè)04: 0.1~0.2%;]/%5〇4:0.15~0.化％;乙醇：2~4%;
[0013] 步驟(2)所述發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖40-80g/L、挪漿5~20g/L、冰醋酸5 ~20g/L、酵母膏0.0 l~Ig/L、屯水合硫酸儀0.2~0.5g/L、p肥.5~3.0;
[0014] 步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:薦糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、挪漿5~20g/ L、冰醋酸5~20g/L、大豆蛋白腺0.0 l~0.5g/L、屯水合硫酸儀0.2~0.5g/L。
[0015] 所述木葡糖醋酸桿菌JXla化omagataeibacterxylinusJXla)能夠在抑2.5~3.0 范圍內(nèi)生長(zhǎng)，生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到濕重500~700g/L，厚度在10~15mm。
[0016] 步驟(3)發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素在食用前需按W下方法處理后再食用:將步驟(3) 發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素切成方塊，常溫水?dāng)埌杞?~4次，每次20~30min;將樣品在90~ 95°C下，用0.2~0.4%海藻酸鋼溶液攬拌20-30min，常溫下用0.2~0.4%乳酸巧靜置浸泡 20~30min。
[0017] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0018]本發(fā)明提出了 一株挪果的高產(chǎn)菌株，木葡萄糖酸醋桿菌（Komagataeibacter 巧11皿3)將1曰為一株的新菌株，該菌株可^在9出％2.5-3.0條件下生長(zhǎng)。用該菌株經(jīng)初級(jí)種 子培養(yǎng)、發(fā)酵種子培養(yǎng)、淺盤(pán)靜置發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，產(chǎn)量達(dá)到500~700g/L。該菌利用挪 漿、牛奶等乳品為氮源生產(chǎn)的可食用細(xì)菌纖維素成本低、得率高、品質(zhì)好，適合于大規(guī)模生 產(chǎn)。本發(fā)明制備的產(chǎn)品可應(yīng)用于飲料、賠烤制品W及乳制品中。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為木葡萄糖酸醋桿菌化omaga1:aeibacte;r巧linus)JXla的16S rDNA序列表。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明所保護(hù)的內(nèi)容不僅僅局限于下 面的實(shí)例。
[0021] 實(shí)施例1:木葡萄糖酸醋桿菌JXla的篩選、分離及鑒定
[0022] 采集海南挪漿，使其自然發(fā)酵（即自然條件下自己發(fā)酵）15天，吸取Iml于IOml試管 中，再加入9ml無(wú)菌水制成1(T蛾度的菌懸液，依次進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e從l(T 2、l(r3濃度梯度稀釋 液中吸取20化1均勻涂布于平板，每個(gè)濃度梯度做S個(gè)對(duì)照，置于30°C培養(yǎng)箱觀察培養(yǎng)情 況，培養(yǎng)4天后，挑取其中菌落長(zhǎng)勢(shì)良好、分布均勻的、產(chǎn)透明圈的全部單菌落，接種于固體 斜面培養(yǎng)基中，3(TC恒溫培養(yǎng)24~4她。待斜面長(zhǎng)出豐厚的菌苔后，挑取一環(huán)斜面菌種接種 于IOml發(fā)酵培養(yǎng)液中3(TC恒溫培養(yǎng)7d，篩選出產(chǎn)膜快且膜厚實(shí)的菌株，劃線分離純化，若為 純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入25%甘油，-2(TC保藏，若不是純培養(yǎng)物繼續(xù)劃線分離。分離培養(yǎng)基:葡萄糖 2% (w/v)，酵母膏0.5% (w/v)，K2HP04 0.1 % (w/v)，MgS〇4 0.15% (w/v)，乙醇2%，CaC〇3 l%(w/v)，瓊脂1.7%(w/v)，pH自然;斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2%(w/v)，酵母膏0.5%(w/v)， K2HPO4 0.1%(w/v)，MgS〇4 0.15%(w/v)，乙醇2%，CaC〇3 l%(w/v)，瓊脂 1.7%(w/v)，pH自 然。
[0023] 木葡萄糖酸醋桿菌化omagataeibacter巧linus)JXla在固體培養(yǎng)基(葡萄糖2%， 酵母膏〇.5%，1(2冊(cè)〇4:0.1%，]/^5〇4:0.15%，乙醇2%，〔曰(：〇3:1%，瓊脂1.7%，抑自然）上生 長(zhǎng)2地，呈淡黃色圓隆狀，質(zhì)地較硬，不易挑取，革蘭氏染色呈陰性。顯微鏡16X100倍觀察 呈短桿狀、單細(xì)胞或成對(duì)。
[0024] 木葡萄糖酸醋桿菌JXla化omaga1:aeibacter xylinus JXla)菌株的遺傳學(xué)特征：
[0025] 提取新鮮培養(yǎng)菌體的基因作為模版，采用27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3)和 1492R(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)為引物進(jìn)行細(xì)菌的16S rDNA序列擴(kuò)增。木葡萄糖酸醋 桿菌化omagataeibacter xylinus)JXla 16S rDNA全長(zhǎng) 1355bp，與NCBI GenBank中的已知 序列進(jìn)行同源性比較，與Komagataeibacter X^inus同源性達(dá)99%，判定該菌為木葡糖醋 酸桿菌，如圖1所示。
[00%] 木葡萄糖酸醋桿菌JXla化omagataeibacter x}dinus JXla)菌株的理化性能見(jiàn)表 1所示。
[0027] 表1木葡萄糖酸醋桿菌化omaga1:aeibacte;r巧linus)JXla生理生化特性 [002引

[0029] 本菌株在培養(yǎng)時(shí)，其培養(yǎng)基的抑為2.5-3,證明本菌株的耐酸性良好;現(xiàn)有技術(shù)中 生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株的pH耐受性在5.0左右。
[0030] 實(shí)施例2:可食用細(xì)菌纖維素的制備方法
[0031] 將斜面種子調(diào)一環(huán)接種到IOmL試管中（種子培養(yǎng)基葡萄糖2%、酵母膏0.5%、 K2HPO4 0.2%、MgS〇4 0.15%、乙醇2% )，在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2地，待表面長(zhǎng)出 纖維膜后，按10%的接種量將其轉(zhuǎn)接到IOOmL的種子培養(yǎng)基中，在3(TC恒溫培養(yǎng)箱中靜置培 養(yǎng)3d，獲得初級(jí)種子液。
[0032] 發(fā)酵種子培養(yǎng):將初級(jí)種子液按10%的接種量接種到發(fā)酵種子培養(yǎng)基中（葡萄糖 80g/L、挪漿20g/L、冰醋酸13g/L、大豆蛋白腺O.Olg/L、屯水合硫酸儀0.2旨/1、9肥.5)，在30 °C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3d。
[0033] 淺盤(pán)靜置發(fā)酵:將發(fā)酵種子液按20%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中（薦糖20g/L、葡 萄糖20g/L、挪漿20g/L、冰醋酸12g/L、大豆蛋白腺0.0 lg/L、屯水合硫酸儀0.2g/L)，混合均 勻后分裝到淺盤(pán)中，裝液量75%，在3(TC發(fā)酵房中靜置培養(yǎng)8d后收獲細(xì)菌纖維素。細(xì)菌纖維 素經(jīng)刮膜處理后切成Icm3的顆粒，產(chǎn)量600g/L。目前現(xiàn)有技術(shù)中用只有的菌株來(lái)生產(chǎn)細(xì)菌 纖維素的最高產(chǎn)量能達(dá)到600g/L，遠(yuǎn)低于本申請(qǐng)的發(fā)酵水平。
[0034] 將生產(chǎn)獲得的可食用細(xì)菌纖維素采用刮膜機(jī)去除表面挪油W及老皮，采用切粒機(jī) 將其切成lcmXlcm的方塊。采用常溫水浸泡3次，攬拌速度l(K)rpm，每次30min，直至浸泡水 抑高于4.5。將處理后的樣品在95°(：下，用0.4%海藻酸鋼溶液處理3〇111111，攬拌速度10化口111。 樣品清洗一遍后用0.4%乳酸巧處理30min，得到可食用纖維素顆粒。
[0035] 對(duì)可食用細(xì)菌纖維素進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，該顆粒賄單爽口，易下咽，無(wú)殘?jiān)?br>[0036] 本文所描述的具體實(shí)施案例僅作為對(duì)本發(fā)明精神和部分實(shí)驗(yàn)做舉例說(shuō)明。本發(fā)明 所述領(lǐng)域的技術(shù)人員可W對(duì)所描述的具體實(shí)施案例做出各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類(lèi) 似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株，其特征在于所述菌株的分類(lèi)命名為木葡糖醋酸桿菌 JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào) 為CCTCC NO:M 2015195,保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。2. -種權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株的篩選方法，其特征在于篩選基質(zhì)為 發(fā)酵椰漿，篩選培養(yǎng)基為:葡萄糖:2~4% ;酵母膏:0.5~1.0 % ; K2HP〇4:0.1~0.2 % ;MgS〇4: 0.15~0.25%;乙醇：2~4%;0&0)3:0.5~1% ;瓊脂：1.5~2%4!1自然。3. -種權(quán)利要求1所述的菌株生產(chǎn)可食用細(xì)菌纖維素的方法，其特征在于采用木葡糖 醋酸桿菌JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)作為發(fā)酵菌株，采用鹿糖、葡萄糖為碳 源，采用冰醋酸為能源物質(zhì)，采用椰漿、椰子粉、牛奶、奶粉、豆奶或豆粉為氮源。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于具體步驟為： (1) 初級(jí)種子培養(yǎng):將木葡糖醋酸桿菌JXla(Komagataeibacter xylinus JXla)的斜面 種子接到種子培養(yǎng)基，于28~35°C靜置培養(yǎng)17~30h，得到初級(jí)種子液； (2) 發(fā)酵種子培養(yǎng):將初級(jí)種子液按5 %~10 %的接種量接種到發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，28 ~35°C，靜置培養(yǎng)1~3d，得到發(fā)酵種子液； (3) 淺盤(pán)靜置發(fā)酵:將發(fā)酵種子液按10%~30%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液高度 1.5-2.5cm，28~35°C下靜置培養(yǎng)6~8d。 步驟(1)所述種子培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖:2~4% ;酵母膏:0.5~1.0% ;K2HP〇4:0.1~ 0.2%;]/%5〇4:0.15~0.25%;乙醇：2~4% ; 步驟（2)所述發(fā)酵種子培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖40-80g/L、椰漿5~20g/L、冰醋酸5~ 20g/L、酵母膏0 · 01~lg/L、七水合硫酸鎂0 · 2~0 · 5g/L、pH2 · 5~3 · 0; 步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：蔗糖20-30g/L、葡萄糖20-30g/L、椰漿5~20g/L、冰 醋酸5~20g/L、大豆蛋白胨0 · 01~0 · 5g/L、七水合硫酸鎂0 · 2~0 · 5g/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述木葡糖醋酸桿菌J X 1 a (Komagataeibacter xylinus JXla)能夠在ρΗ2·5~3.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的發(fā) 酵產(chǎn)量達(dá)到濕重500~700g/L，厚度在10~15mm。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(3)發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素在食用前需 按以下方法處理后再食用:將步驟(3)發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素切成方塊，常溫水?dāng)嚢杞? ~4次，每次20~30min;將樣品在90~95°C下，用0.2~0.4%海藻酸鈉溶液攪拌20-30min， 常溫下用0.2~0.4%乳酸鈣靜置浸泡20~30min。
【專(zhuān)利摘要】一株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株，所述菌株的分類(lèi)命名為木葡糖醋酸桿菌JX1a(Komagataeibacter xylinus JX1a)，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015195，保藏日期為2015年4月6日，保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。該菌株具有高的pH適應(yīng)能力，在pH2.5～3.0條件下能良好生長(zhǎng)；該菌株在含有椰漿、牛奶、豆奶等乳品培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生高品質(zhì)可食用膳食纖維，也可以用該菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素面膜以及醫(yī)用材料。CCTCC NO：M 201519520150406
【IPC分類(lèi)】A23L33/24, C12N1/20, C12P19/04, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN105713860
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610141006
【發(fā)明人】于秋生, 馮偉, 白愛(ài)娟, 李珍妮, 徐暉
【申請(qǐng)人】江南大學(xué), 于秋生, 福建省泉州喜多多食品有限公司