本發(fā)明涉及用于利用4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶、必要時(shí)與s-腺苷甲硫氨酸合成酶或3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和其他酶組合來(lái)制備3,4-甲基化的肉桂酸、3,4-甲基化的肉桂酸酯、3,4-二甲氧基苯乙胺和4-甲基肉桂酸酰胺的發(fā)酵方法和生物技術(shù)方法。此外，本發(fā)明涉及載體體系和重組的微生物或真菌，所述重組的微生物或真菌能夠編碼/表達(dá)用來(lái)執(zhí)行本發(fā)明的酶以及涉及為此適合的核酸片段和多肽。此外，本發(fā)明涉及組合物，所述組合物通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得。
背景技術(shù)：
：在調(diào)味劑的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中，對(duì)于合成所述調(diào)味劑的高效的和成本低的途徑存在持續(xù)的需求。甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶聯(lián)產(chǎn)物、尤其是肉桂酸酰胺的偶聯(lián)產(chǎn)物是這類調(diào)味劑的實(shí)例。示例性的肉桂酸酰胺是羅賓紅素(rubemamin)。羅賓紅素作為天然材料在植物花椒草中被鑒定出。然而，現(xiàn)在仍沒(méi)有描述過(guò)用于制備所述專門(mén)的物質(zhì)以及其直接的前體的生物技術(shù)方法。從現(xiàn)有技術(shù)已知：咖啡酸通過(guò)不同的咖啡酰-輔酶a-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(ccaomt)或鄰苯二酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt)和形成ccaomt或comt的轉(zhuǎn)基因微生物來(lái)轉(zhuǎn)化(fellenberg,c.等tapetum-specificlocationofacation-dependento-methyltransferaseinarabidopsisthaliana.plantj.56,132–45(2008)；ibdah,m.,zhang,x.-h.,schmidt,j.&vogt,t.anovelmg(2+)-dependento-methyltransferaseinthe phenylpropanoidmetabolismofmesembryanthemumcrystallinum.j.biol.chem.278,43961–72(2003))。在此，3′位總是被修飾并且僅形成阿魏酸。迄今已經(jīng)證實(shí)：4′位的甲基化能夠僅對(duì)于木質(zhì)醇單體和類苯基丙烷借助源于仙女扇(clarkiabreweri)的(異)丁香酚甲基轉(zhuǎn)移酶的變體(us8,889,392b2,zhang,k.等anengineeredmonolignol4-o-methyltransferasedepressesligninbiosynthesisandconfersnovelmetaboliccapabilityinarabidopsis.plantcell24,3135–52(2012))以及借助苯基丙烯上的其他的o-甲基轉(zhuǎn)移酶、如胡椒酚或紫丁香酚展示出(gang,d.r.等characterizationofphenylpropeneo-methyltransferasesfromsweetbasil:facilechangeofsubstratespecificityandconvergentevolutionwithinaplanto-methyltransferasefamily.plantcell14,505–519(2002))。用于苯乙胺、例如多巴胺、3-甲氧酪胺3-羥基-4-甲氧基-苯乙胺的酶促的全甲基化的方法是未知的。已經(jīng)描述了：通過(guò)多巴脫羧酶以及通過(guò)產(chǎn)生所述酶的轉(zhuǎn)基因微生物將左旋多巴轉(zhuǎn)化成多巴胺(facchini等plantaromaticl-aminoaciddecarboxylases:evolution,biochemistry,regulation,andmetabolicengineeringapplications.phytochemistry54,121–38(2000))。通過(guò)3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-omts)將獲得的多巴胺進(jìn)行修飾同樣是已知的，其中3-甲氧酪胺形成為產(chǎn)物(lotta,t.等kineticsofhumansolubleandmembrane-boundcatecholo-methyltransferase:arevisedmechanismanddescriptionofthethermolabilevariantoftheenzyme.biochemistry34,4202–4210(1995))。此外，能夠顯示出：4-甲氧基酪胺也通過(guò)源于德?tīng)査?delta)變形菌粘細(xì)菌的酶safc的活化從多巴胺產(chǎn)生(nelson,j.t.,lee,j.,sims,j.w.&schmidt,e.w.characterizationofsafc,acatechol4-o-methyltransferaseinvolvedinsaframycinbiosynthesis.appl.environ.microbiol.73,3575–80(2007))。然而，還未證明通過(guò)借助轉(zhuǎn)基因微生物或真菌的生物轉(zhuǎn)化或通過(guò)酶促轉(zhuǎn)換在形成3,4-二甲氧基苯乙胺的情況下始于多巴胺、3-甲氧酪胺和/或3-羥基-4-甲氧基酪胺來(lái)全甲基化形成。此外，已知的是：s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)能夠用于產(chǎn)生 s-腺苷甲硫氨酸(sam)。迄今僅為了形成類黃酮而不為了形成甲基化的肉桂酸以及苯乙胺而顯示出：用s-腺苷甲硫氨酸合成酶與o-甲基轉(zhuǎn)移酶的組合的表達(dá)以改進(jìn)地提供輔助因子s-腺苷甲硫氨酸(sung,s.h.optimizationofrhamnetinproductioninescherichiacoli.j.microbiol.biotechnol.21,854–857(2011))。通過(guò)4-香豆酸:輔酶a連接酶的活化形成肉桂酸的輔酶a酯同樣是已知的(lindermayr,c.等divergentmembersofasoybean(glycinemaxl.)4-coumarate:coenzymealigasegenefamily.eur.j.biochem.1315,1304–1315(2002))。然而，迄今已經(jīng)僅針對(duì)未全甲基化的底物、如阿魏酸和多巴胺顯示出：通過(guò)酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶將胺與形成的輔酶a酯進(jìn)行連接反應(yīng)(yu,m.&facchini,p.j.purification,characterization,andimmunolocalizationofhydroxycinnamoyl-coa:tyraminen-(hydroxycinnamoyl)transferasefromopiumpoppy.planta209,33–44(1999))。基于肉桂酸和左旋多巴起始的合成方法不是已知的。此外，在由現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法中就本發(fā)明而言無(wú)法理解為用于制備肉桂酸酰胺的生物技術(shù)方法、尤其適合用于工業(yè)制備肉桂酸酰胺的方法，因?yàn)楣烙?jì)產(chǎn)量非常低(例如215mg/lkang,k.&back,k.productionofphenylpropanoidamidesinrecombinantescherichiacoli.metab.eng.11,64–68(2009))。因此，存在建立如下生物技術(shù)方法的需求、即發(fā)酵方法和酶促方法，所述發(fā)酵方法和酶促方法至少在一個(gè)步驟中設(shè)有重組的生物的使用，所述重組的生物適合用于工業(yè)使用，以便由此以充足的規(guī)?？蓮?fù)現(xiàn)地提供甲基化的肉桂酸和苯乙胺及其衍生物和其偶聯(lián)產(chǎn)物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的目的在于：提供發(fā)酵方法和酶促的生物技術(shù)方法以及為此所需的重組的生物、核酸片段、多肽和載體體系，通過(guò)其在酰胺偶聯(lián)條件下、即在所述合成途徑的不同層面上由(i)和(ii)構(gòu)成組合生物合成途徑的條件下能夠大規(guī)模生產(chǎn)(i)甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯，(ii)甲基化的苯乙胺和(iii)肉桂酸酰胺、例如羅賓紅素。該目的通過(guò)提供用于利用至少一種4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶在重組的微生物或真菌中制備天然的3,4-甲基化的肉桂酸、3,4-甲基化的肉桂酸酯、3,4-二甲氧基苯乙胺和肉桂酸酰胺的生物技術(shù)方法和為此所需的工具來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)代謝工程建立且能夠用于所述生物技術(shù)方法的其他的酶包括s-腺苷甲硫氨酸合成酶或3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶以及必要時(shí)脫羧酶、4-香豆酸：輔酶a連接酶(cl)和酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(tht)。反應(yīng)能夠在如下條件下完全發(fā)酵地或發(fā)酵地以及酶促地或完全酶促地進(jìn)行，所述條件為總是使用通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的酶。此外，公開(kāi)了適合的重組的微生物和真菌和載體體系、核酸片段和多肽，它們適合用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的第一方面中，基于羥基肉桂酸或在半纖維素上酯化的羥基肉桂酸利用4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(4-omt)以及必要時(shí)附加地3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-omt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)獲得3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠純發(fā)酵地進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終的反應(yīng)酶促地進(jìn)行。在本發(fā)明的第二方面中，基于多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸或其前體或其衍生物利用4-omt和3-omt獲得3,4-二甲氧基苯乙胺。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠純發(fā)酵地進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終的反應(yīng)酶促地進(jìn)行。在本發(fā)明的第三方面中，基于羥基肉桂酸或在半纖維素上酯化的羥基肉桂酸以及由多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸或其前體或其衍生物利用4-omt、4-香豆酸:輔酶a連接酶(cl)和酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(tht)以及必要時(shí)其他的多肽或編碼所述多肽的核酸獲得4-甲基肉桂酸酰胺。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠純發(fā)酵地進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終的反應(yīng)酶促地進(jìn)行。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)酵反應(yīng)中的酰胺偶聯(lián)利用cl和tht進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，酶促反應(yīng)中的酰胺偶聯(lián)通過(guò)連接酶進(jìn)行。在此，酰胺偶聯(lián)的酶促步驟能夠通過(guò)連接酶來(lái)催化。在所述方面的另一實(shí)施方式中，酰胺偶聯(lián)以關(guān)于4′-o-甲基化和可選的3′-甲基化的反應(yīng)步驟的任意順序進(jìn)行。此外，公開(kāi)了重組的微生物和真菌，所述重組的微生物和真菌具有對(duì)于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法所必需的載體或載體體系進(jìn)而編碼核酸以執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。此外公開(kāi)核酸片段和多肽，所述核酸片段和多肽專門(mén)適合用于在此公開(kāi)的方法。此外，提供組合物，所述組合物包括方面三的根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)物。本發(fā)明的方面和實(shí)施方式從下列詳細(xì)的描述和實(shí)例、附圖、序列記錄和所附的權(quán)利要求中得出。附圖說(shuō)明圖1示出具有基因的質(zhì)粒sym_omt_sams，所述基因編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和s-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼。圖2示出具有基因的質(zhì)粒psym_omt1_omt2，所述基因編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼。圖3示出具有基因的質(zhì)粒psym_ddc_omt1_omt2，所述基因編碼脫羧酶、3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶。圖4示出具有基因的質(zhì)粒psym_ddc，所述基因編碼脫羧酶。圖5示出具有基因的質(zhì)粒psym_4cl2_tht，所述基因編碼4-香豆酸:輔酶a連接酶和酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶。圖6示出阿魏酸生物催化轉(zhuǎn)換成3,4-二甲氧基肉桂酸。圖7示出通過(guò)o-甲基轉(zhuǎn)移酶與s-腺苷甲硫氨酸合成酶的聯(lián)合表達(dá)來(lái)增加地形成3,4-二甲氧基肉桂酸。圖8示出左旋多巴到3,4-二甲氧基苯乙胺的酶促轉(zhuǎn)化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜(lc-ms色譜)。圖9示出多巴胺到3,4-二甲氧基苯乙胺的酶促轉(zhuǎn)化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜(lc-ms色譜)。圖10示出左旋多巴到3,4-二甲氧基苯乙胺的發(fā)酵轉(zhuǎn)化的高效液相色譜。圖11示出由巴胺到3,4-二甲氧基苯乙胺的發(fā)酵轉(zhuǎn)化的高效液相色譜。圖12示出(e)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺到(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺的酶促轉(zhuǎn)化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜(lc-ms色譜)。圖13示出(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺到二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺的酶促轉(zhuǎn)化的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜(lc-ms色譜)。圖14示意性示出用于基于肉桂酸以及從左旋多巴制備羅賓紅素的生物合成途徑。在此，首先在通過(guò)連接酶或輔酶連接酶(cl)和tht的酰胺偶聯(lián)之前的最后步驟中聚合肉桂酸途徑和左旋多巴途徑。圖15示意性示出從肉桂酸以及從左旋多巴開(kāi)始用于制備羅賓紅素的其他合成途徑。在此，酰胺偶聯(lián)和進(jìn)而在肉桂酸途徑中兩種起始途徑的結(jié)合已經(jīng)在omt活化之前發(fā)生。在此預(yù)先完成連接酶或輔酶連接酶(cl)和tht的添加。圖16示意示出用于基于肉桂酸以及從左旋多巴制備羅賓紅素的其 他合成途徑。在此，酰胺偶聯(lián)進(jìn)而這兩個(gè)起始途徑的結(jié)合在肉桂酸成分甲基化之前已經(jīng)通過(guò)添加連接酶或輔酶連接酶(cl)和tht進(jìn)行。圖17示意性示出用于基于肉桂酸以及左旋多巴制備羅賓紅素的其他合成途徑。在此，酰胺偶聯(lián)和進(jìn)而這兩個(gè)起始途徑的結(jié)合在肉桂酸甲基化之后，但在多巴胺甲基化之前通過(guò)添加連接酶或輔酶連接酶(cl)和tht進(jìn)行。圖18以比較的方式示出借助cbmomt和借助由其制造的突變將阿魏酸反應(yīng)成3,4-二甲氧基肉桂酸。具體實(shí)施方式公開(kāi)的肉桂酸能夠要么以其游離形式，要么在半纖維素上酯化的形式存在，所述半纖維素例如作為植物細(xì)胞壁的組成部分存在。核酸必要時(shí)能夠密碼子優(yōu)化，即基因的密碼子使用匹配于選擇作為表達(dá)株的重組的微生物或真菌，所述核酸根據(jù)本發(fā)明用來(lái)表達(dá)期望的靶蛋白。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的是：期望的靶基因，能夠不改變翻譯的蛋白質(zhì)序列而被修飾，以便考慮特定的物種相關(guān)的密碼子使用，所述靶基因關(guān)注于編碼蛋白。因此，本發(fā)明的要轉(zhuǎn)化的核酸能夠?qū)ｉT(mén)匹配大腸桿菌或其他細(xì)菌的密碼子使用、酵母菌屬或其他酵母的密碼子使用、木霉屬或其他真菌的密碼子使用。如在此使用的術(shù)語(yǔ)后代根據(jù)本公開(kāi)，在重組的微生物或真菌的上下文中稱作這種生物的后代，所述生物通過(guò)包括有性繁殖法和無(wú)性繁殖法的自然的再生的生殖過(guò)程從初始源生物中產(chǎn)生。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的是：在繁殖過(guò)程中突變能夠以天然的方式引入生物的基因組中，由此后代與親本生物在基因組方面不同，然而仍能夠例如歸于相同的(亞)種。因此，根據(jù)本公開(kāi)的術(shù)語(yǔ)后代也包括這類通過(guò)自然過(guò)程被改變的后代。如在此使用的術(shù)語(yǔ)載體體系稱作體系，所述體系由至少一個(gè)或多個(gè) 載體或質(zhì)粒載體構(gòu)成或包含所述載體或質(zhì)粒載體。因此，載體體系能夠包含(質(zhì)粒)載體，所述(質(zhì)粒)載體編碼兩種不同的靶基因。此外，載體體系也能夠包含多個(gè)(質(zhì)粒)載體，所述多個(gè)(質(zhì)粒)載體就其而言包含根據(jù)本公開(kāi)的至少一個(gè)靶基因。因此，載體體系能夠僅包含一個(gè)(質(zhì)粒)載體構(gòu)建體或多個(gè)(質(zhì)粒)載體構(gòu)建體，其中后者能夠同時(shí)或依次地穩(wěn)定地或暫時(shí)地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的重組的宿主，使得由各個(gè)構(gòu)建體編碼的靶基因能夠由宿主轉(zhuǎn)錄和翻譯。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的是：重組的微生物或真菌或蛋白質(zhì)或酶的培育和培養(yǎng)、分離和純化，所述蛋白質(zhì)或所述酶由根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的核酸編碼。由于在此公開(kāi)的基因產(chǎn)物的持續(xù)的酶促功能，術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)、多肽和酶可交換地使用。用于本公開(kāi)的目的的術(shù)語(yǔ)基因和核酸(片段)同樣可交換地使用。每當(dāng)本公開(kāi)涉及以百分比表示形式表示的核酸序列或蛋白質(zhì)序列的序列同源性或序列同一性，所述表示形式就涉及數(shù)值，如其所述值能夠?qū)τ诤怂嵝蛄杏?jì)算使用embosswater成對(duì)序列比對(duì)(核苷酸)(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)或?qū)τ诎被嵝蛄杏?jì)算使用embosswater成對(duì)序列比對(duì)(蛋白質(zhì))(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_water/)。在由歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所(embl)歐洲生物信息學(xué)研究所(ebi)提供的局部成對(duì)序列比對(duì)工具中，使用修改的smith-waterman算法(見(jiàn)http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/和smith,t.f.&waterman,m.s.“identificationofcommonmolecularsubsequences”journalofmolecularbiology,1981147(1):195-197)。此外，在此，在利用修改的smith-waterman算法執(zhí)行兩個(gè)序列的相應(yīng)成對(duì)的比對(duì)的情況下，參考由embl-ebi當(dāng)前給出的默認(rèn)參數(shù)。這是(i)用于氨基酸序列：基體＝blosum62，空位出現(xiàn)罰分(gapopenpenalty)＝10和空位延長(zhǎng)罰分(gapextendpenalty)＝0.5以及(ii)用于核酸序列：基體＝完整dna，空位出現(xiàn)罰分＝10和空位延長(zhǎng)罰分＝0.5。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，基于羥基肉桂酸或半纖維素上酯化的羥基肉桂酸利用4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(4-omt)和s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)獲得3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯。所述反應(yīng)通過(guò)提供重組的微生物或真菌進(jìn)行，所述重組的微生物或真菌包含(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(4-omt)的基因或由其構(gòu)成，和(a2)可選的核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-omt)的基因或由其構(gòu)成，和(b)可選地用于發(fā)酵生產(chǎn)的核酸片段，所述核酸片段包括編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)的基因或由其構(gòu)成構(gòu)成，以及在允許核酸片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組的微生物或真菌以獲得相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物；可選地分離以及必要時(shí)純化獲得的表達(dá)產(chǎn)物，并且將一種或多種羥基肉桂酸、優(yōu)選添加咖啡酸或阿魏酸，和/或一種或多種其前體或一種或多種其衍生物、尤其在半纖維素上酯化的咖啡酸或阿魏酸的前體或衍生物添加至根據(jù)步驟(ii)的培養(yǎng)的重組的微生物或真菌以用于發(fā)酵反應(yīng)或添加至根據(jù)步驟(iii)的表達(dá)產(chǎn)物以用于酶促反應(yīng)；并且在實(shí)現(xiàn)將羥基肉桂酸或前體或其衍生物反應(yīng)成3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯的條件下培養(yǎng)或孵育重組的微生物或真菌或表達(dá)產(chǎn)物，以獲得相應(yīng)的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯；以及可選地分離和必要時(shí)純化獲得的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯以及可選地必要時(shí)分離和純化上述其他副產(chǎn)物。羥基肉桂酸能夠以其游離的形式或酯化的形式存在。羥基肉桂酸的酯存在于例如植物細(xì)胞壁中。在工業(yè)規(guī)模中作為重組的生物適合用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的所有方面的靶蛋白的微生物以及真菌，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的并且優(yōu)選包括、但不限于：大腸桿菌屬、例如大腸桿菌bl21、大腸桿菌mg1655、大腸桿菌w3110和其后代，芽孢桿菌屬、例如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌和其后代，酵母菌屬、例如釀酒酵母和其后代，漢遜酵母屬或畢赤酵母屬、例如畢赤酵母和多形漢遜酵母和其后代，克魯維酵母菌屬、例如乳酸克魯維酵母和其后代，米曲霉菌屬、例如米曲 霉菌、構(gòu)巢曲霉或黑曲霉和其后代，或木霉屬、例如里氏木霉或哈茨木霉和其后代。用來(lái)培育和培養(yǎng)根據(jù)本公開(kāi)的重組的微生物和真菌的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，所述方法允許根據(jù)所述公開(kāi)的核酸片段的表達(dá)以及根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)物與公開(kāi)的酶的反應(yīng)。用于根據(jù)本發(fā)明的所有方面的使用的4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(4-omts)由于其底物特異性和區(qū)域選擇性而能夠：催化游離的或酯化的羥基肉桂酸的、或l-二羥基苯丙氨酸的或其前體或其衍生物的、或游離的或酯化的羥基肉桂酸或l-二羥基苯丙氨酸或其前體或其衍生物的偶聯(lián)產(chǎn)物的4′-o-基團(tuán)的甲基化。優(yōu)選編碼本發(fā)明的4-omt的核酸包括選自下述的核酸：seqidno.：5、6、7、8、9、15、17、18和85，以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。優(yōu)選4-omt多肽包括如下4-omt多肽，所述4-omt多肽由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼，優(yōu)選的4-omt多肽選自：seqidno.：25、26、27、28、29、35、37、38和86以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述4-omt多肽盡管被修飾，但仍滿足相同的酶促功能、如具有相應(yīng)的seqidno.的未被修飾的多肽。所列出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸序列能夠包含有定向點(diǎn)突變。關(guān)于seqidno.35，優(yōu)選的點(diǎn)突變位于133位置或322位。優(yōu)選的點(diǎn)突變是l322n(見(jiàn)seqidno.:8和28)或t133s(見(jiàn)seqidno.:9和29)或這兩種突變的結(jié)合(s根據(jù)相應(yīng)的核酸或多肽序列為eqidno.:85和86)。用于根據(jù)本發(fā)明的所有方面的使用的3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-omts)由于其底物特異性和區(qū)域選擇性而能夠：催化游離的或酯化的羥基肉桂酸的、或l-二羥基苯丙氨酸的或其前體或其衍生物的、或游離的或酯化的羥基肉桂酸或l-二羥基苯丙氨酸或其前體或其衍生物的偶聯(lián)產(chǎn)物的 3′-o-基團(tuán)的甲基化。優(yōu)選3-omt多肽包括如下3-omt多肽，所述3-omt多肽由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼，優(yōu)選的3-omt多肽選自：seqidno.：3、4、16、19和20以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的優(yōu)選的3-omt多肽在如下條件下選自：seqidno.：23、24、36、39和40以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為關(guān)于分別列出的seqidno.具有相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有相應(yīng)的seqidno.的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸序列能夠包含定向點(diǎn)突變。根據(jù)本發(fā)明的方法的3-omt的使用對(duì)于其中3′-甲基化已經(jīng)存在于反應(yīng)物中的方法是可選的。用于根據(jù)本發(fā)明的所有方面的使用的s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)由于其物質(zhì)特異性和區(qū)域選擇性而能夠：催化atp和甲硫氨酸反應(yīng)成s-腺苷甲硫氨酸。優(yōu)選核酸包括這樣的核酸，編碼本發(fā)明的sams的核酸包括選自下述的核酸：seqidno.：10、65、67、69和71以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的優(yōu)選的sams多肽在如下條件下選自：seqidno.：30、66、68、70和72以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為關(guān)于分別列出的seqidno.具有相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有相應(yīng)的seqidno.的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸序列能夠包含定向點(diǎn)突變。如也本發(fā)明的所有其他方面中那樣，添加編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)的基因在所述基因中引起改進(jìn)地提供s-腺苷甲硫氨酸，這能夠提高相應(yīng)工藝的產(chǎn)量。在本發(fā)明的所述方面和所有其他方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠純發(fā)酵地進(jìn)行。根據(jù)所述實(shí)施方式，目的核酸在重組的微生物或真菌中表達(dá)并且產(chǎn)物的反應(yīng)在活體內(nèi)在重組的微生物或真菌體中進(jìn)行。在本發(fā)明的所述方面和所有其他方面的另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終反應(yīng)酶促地進(jìn)行。在此，目的核酸首先在重組的微生物或真菌中表達(dá)。然后，如此獲得的蛋白質(zhì)可選地被純化并且在活體外在確保蛋白質(zhì)活性的反應(yīng)條件下，在足以獲得最大反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間中，必要時(shí)在實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的反應(yīng)的合適的緩沖液中添加其他物質(zhì)或酶的條件下以及必要時(shí)利用其他對(duì)于反應(yīng)必需的添加劑的情況下，將所獲得的純化的蛋白質(zhì)結(jié)合以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的任意方面的所選擇的反應(yīng)物的反應(yīng)。合適的反應(yīng)條件，如緩沖液、添加劑、溫度和ph值條件以及必要時(shí)其他的蛋白質(zhì)能夠由本領(lǐng)域的技術(shù)人員在獲悉在此公開(kāi)的生物合成途徑和為此所必需的酶的情況下根據(jù)本公開(kāi)的任意方面簡(jiǎn)單地確定，其中所述酶共同決定反應(yīng)條件的選擇。在本發(fā)明的第二方面中，基于多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸(左旋多巴)或其前體或其衍生物利用4-omt和3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶(3-omt)獲得3,4-二甲氧基苯乙胺。這通過(guò)提供重組的微生物或真菌進(jìn)行，所述重組的微生物或真菌包含(a1)核酸片段，所述(a1)核酸片段包括至少一種編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(a2)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(b)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其構(gòu)成構(gòu)成，和(c)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼多巴脫羧酶(ddc)的基因或由其構(gòu)成，以及在允許核酸片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組的微生物或真菌以獲得相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物；并且可選地分離以及必要時(shí)純化獲得的表達(dá)產(chǎn)物；將多巴胺和/或l-二羥基苯丙 氨酸和/或一種或多種其前體或一種或多種其衍生物、尤其一種其前體或一種其衍生物添加至添加至根據(jù)步驟(ii)的培養(yǎng)的重組的微生物或真菌以用于發(fā)酵反應(yīng)或添加至根據(jù)步驟(iii)的表達(dá)產(chǎn)物以用于酶促反應(yīng)，其中在酶促反應(yīng)的情況下還優(yōu)選添加s-腺苷甲硫氨酸；在實(shí)現(xiàn)將多巴胺或l-二羥基苯丙氨酸和/或其一種或多種前體或其一種或衍生物反應(yīng)成3,4-二甲氧基苯乙胺的條件下，培養(yǎng)或孵育重組的微生物或真菌或表達(dá)產(chǎn)物以獲得3,4-二甲氧基苯乙胺；可選地分離以及必要時(shí)純化獲得的3,4-二甲氧基苯乙胺以及可選地分離以及必要時(shí)純化可能存在的其他副產(chǎn)物。多巴胺的優(yōu)選的前體或衍生物選自：l-二羥基苯丙氨酸(左旋多巴)、酪氨酸或苯丙氨酸。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠純發(fā)酵地進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終反應(yīng)酶促地進(jìn)行。通過(guò)4-omt和3-omt的甲基化步驟能夠同時(shí)地或以任意順序依次地進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，除4-omt和3-omt之外，編碼sams的核酸片段也由重組的微生物或真菌轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，在另一實(shí)施方式中，基于左旋多巴或其前體或其衍生物，編碼ddc的核酸片段也由重組的微生物或真菌轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外在根據(jù)本發(fā)明的方面二的酶促反應(yīng)的情況下，優(yōu)選向制備物添加s-腺苷甲硫氨酸。優(yōu)選編碼本發(fā)明的多巴脫羧酶(ddc)的核酸包括選自下述的核酸：seqidno.:1(dmddc，密碼子優(yōu)化的)、2(amddc，密碼子優(yōu)化的)、59、61和63以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。編碼根據(jù)本發(fā)明的核酸的 優(yōu)選的ddc多肽包括選自下述的這種多肽：seqidno.：21、22、60、62和64以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為關(guān)于分別列出的seqidno.具有相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有相應(yīng)的seqidno.的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸序列能夠包含定向點(diǎn)突變。正如對(duì)于本發(fā)明的第一方面，在此也重要的是：4-omt的特定功能有針對(duì)性地與其他酶、在此為3-omt以及可選地sams和/或dcc聯(lián)合，由此，能夠執(zhí)行由本發(fā)明提供的生物合成途徑以獲得目標(biāo)產(chǎn)物。在本發(fā)明的第三方面中，基于羥基肉桂酸或在半纖維素上酯化的羥基肉桂酸以及多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸或其前體或其衍生物，利用4-omt、sams、和3-omt獲得4-甲基肉桂酸酰胺。這通過(guò)提供如針對(duì)本發(fā)明的第一方面限定的重組的微生物或真菌進(jìn)行，所述重組的微生物或真菌附加地包括：(d)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4-香豆酸：輔酶a連接酶的基因或由其構(gòu)成，和(e)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(tht)的基因或由其構(gòu)成，和(f)可選地核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼多巴脫羧酶(ddc)的基因或由其構(gòu)成，以及在允許核酸片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組的微生物或真菌以獲得相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物；可選地：分離和必要時(shí)純化獲得的表達(dá)產(chǎn)物；將多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸和羥基肉桂酸、優(yōu)選咖啡酸或阿魏酸添加至根據(jù)步驟(ii)的培養(yǎng)的重組的微生物或真菌以用于發(fā)酵反應(yīng)，或?qū)⒈揭野?、尤其多巴胺?-甲氧酪胺、3-羥基-4-甲基苯乙胺、3,4-二甲氧基苯乙胺和肉桂酸酯、尤其咖啡酸的、阿魏酸的、異阿魏酸的或3,4-二甲氧基肉桂酸的酯添加至根據(jù)步驟(iii)的表達(dá)產(chǎn)物以用于酶促反應(yīng)，其中在酶促反應(yīng)的情況下此外優(yōu)選添加s-腺苷甲硫氨酸；并且在實(shí)現(xiàn)多巴胺和/或l-二羥基苯丙氨酸和羥基肉桂酸反正成4-甲基肉桂酸酰胺的條件下培養(yǎng)或孵育重組的微生物或真菌或表達(dá)產(chǎn)物，可選地添加連接酶；以及可選地分離以及必要時(shí) 純化獲得的4-甲基肉桂酸酰胺以及必要時(shí)純化可能存在的其他副產(chǎn)物。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)能夠完全發(fā)酵地進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，反應(yīng)物的最終反應(yīng)酶促地進(jìn)行。此外，在根據(jù)本發(fā)明的方面三的酶促反應(yīng)的情況下，優(yōu)選向制備物添加輔酶a和三磷酸腺苷(atp)。編碼本發(fā)明的香豆酸:輔酶a連接酶(cl)的優(yōu)選的核酸選自：seqidno.:11、12、73、75和77以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的cl多肽在如下條件下包括選自下述的多肽：seqidno.:31、32、74、76和78以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為關(guān)于分別列出的seqidno.具有相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有相應(yīng)的seqidno.的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸序列能夠包含定向點(diǎn)突變。優(yōu)選編碼本發(fā)明的酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(tht)的核酸選自：seqidno.：13、14、79和81以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。由優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的tht多肽在如下條件下包括選自下述的多肽：seqidno.:33、34、80和82以及具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為關(guān)于分別列出的seqidno.具有相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有相應(yīng)的seqidno.的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。所提出的核酸序列能夠例如是密碼子優(yōu)化的或密碼子截短的，或所述核酸 序列能夠包含定向點(diǎn)突變。根據(jù)本發(fā)明的任意方面的另一優(yōu)選的實(shí)施方式，也包含編碼多肽的核酸序列的使用，所述核酸序列的使用用于脫羧酶和/或3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或s-腺苷甲硫氨酸合成酶和/或4-香豆酸:輔酶a連接酶和/或酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的純化、分泌、檢測(cè)或定位的目的。所述核酸片段也稱作標(biāo)簽序列并且能夠是將核酸片段前置(n端)和/或后置(c端)，所述核酸片段針對(duì)脫羧酶和/或3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶和/或s-腺苷甲硫氨酸合成酶和/或4-香豆酸:輔酶a連接酶和/或酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶。尤其優(yōu)選地，標(biāo)簽序列選自下列列表：多組氨酸(his)標(biāo)簽、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)標(biāo)簽、硫氧還蛋白標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)簽、抗生蛋白鏈菌素標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)標(biāo)簽、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和/或分泌物標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用的連接酶是連接酶b。連接酶能夠被固定地存在。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接酶是源于南極假絲酵母的連接酶b。源于南極假絲酵母的連接酶b的核酸序列或多肽序列在seqidno.：83和84中示出。另一實(shí)施方式中在如下條件下也包括具有與所述序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，所述條件為具有與相應(yīng)列出的seqidno.相應(yīng)的同源性程度的序列仍滿足與具有seqidno.84的相應(yīng)未被修飾的多肽相同的酶促功能。在一個(gè)實(shí)施方式中，源于南極假絲酵母的連接酶b能夠以固定的形式存在。適合用于根據(jù)本發(fā)明的使用的連接酶是市售(例如從羅氏制藥，曼海姆(roche,mannheim))。在所述方面的一個(gè)實(shí)施方式中，酰胺偶聯(lián)在發(fā)酵反應(yīng)的情況下能夠利用4-香豆酸：輔酶a連接酶(cl)和酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(tht)進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，在酶促反應(yīng)的情況下，酰胺偶聯(lián)通過(guò)連接酶進(jìn)行。在此，酰胺偶聯(lián)的酶促步驟能夠通過(guò)連接酶催化。在所述方面的另一實(shí)施方式中，酰胺偶聯(lián)相對(duì)于4′-o-甲基化和可選的3′-甲基化的反應(yīng)步驟以任意順序進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)方面三的4-甲基肉桂酸酰胺選自：羅賓紅素[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(3,4-二甲氧基)乙基]2-丙烯酰胺]、阿魏酰-3-甲氧基酪胺[(2e)-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基丙酮)-n-[2-(4-羥基-3-甲氧基苯基丙酮)乙基]2-丙烯酰胺]、(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥基-3-甲基-苯基)乙基]2-丙烯酰胺]和3,4-二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-甲氧基苯基丙酮)乙基]2-丙烯酰胺]。本發(fā)明的該第三方面在延續(xù)第一方面和第二方面的條件下結(jié)合兩種代謝途徑。當(dāng)?shù)谝环矫婧偷诙矫嬷型ㄟ^(guò)新型的生物技術(shù)方法提供中間產(chǎn)物時(shí)，根據(jù)方面三的方法的兩種途徑的結(jié)合和延續(xù)產(chǎn)生其他更復(fù)雜的合成產(chǎn)物。對(duì)于本發(fā)明的所有三個(gè)方面，這以生物技術(shù)途徑利用有針對(duì)性結(jié)合代謝途徑并且利用重組的微生物或真菌和4-omt來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，當(dāng)前公開(kāi)了載體體系，所述載體體系根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面包括核酸片段或載體或由核酸片段或載體構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方式中，公開(kāi)了載體體系、尤其質(zhì)粒載體體系，所述載體體系由一種或多種載體或質(zhì)粒載體構(gòu)成或包含一種或多種載體或質(zhì)粒載體，所述載體或質(zhì)粒載體包含(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(a2)可選地核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(b)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其構(gòu)成，其中在存在核酸片段(a2)和/或核酸片段(b)的情況下，在相同的載體或兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的載體上提供所述核酸片段。在另一實(shí)施方式中，公開(kāi)了載體體系、尤其質(zhì)粒載體體系，所述載體體系包含一種或多種載體或質(zhì)粒載體，所述載體體系包含：(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由 其構(gòu)成，和(a2)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(b)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其構(gòu)成，和(c)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼多巴脫羧酶的基因或由其構(gòu)成，其中在相同的載體或兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的載體上提供核酸片段。在又一實(shí)施方式中，公開(kāi)了載體體系、尤其質(zhì)粒載體體系，所述載體體系包括(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(a2)可選地核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼3′-o-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(b)可選地核酸片段，所述(b)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼s-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其構(gòu)成，并且附加地包含一種或多種載體或質(zhì)粒載體，所述載體或質(zhì)粒載體包含(d)核酸片段，所述核酸片段包括至少一種編碼4-香豆酸:輔酶a連接酶的基因或由其構(gòu)成，和(e)核酸片段，所述核酸片段包括編碼酪胺-n-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶的基因或由其構(gòu)成，和(f)可選地核酸片段，所述核酸片段包括編碼多巴脫羧酶的基因或由其成，其中在相同的載體或兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的載體上提供核酸片段。此外，公開(kāi)了重組的微生物和真菌，所述重組的微生物和真菌具有用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法所必需的載體或載體體系進(jìn)而根據(jù)所描述方面之一編碼核酸以執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，如在此描述的那樣，重組的微生物或真菌包括載體體系、尤其質(zhì)粒載體體系。優(yōu)選重組的微生物或真菌選自：大腸桿菌屬、優(yōu)選大腸桿菌bl21、大腸桿菌mg1655或大腸桿菌w3110和其后代，芽孢桿菌屬、優(yōu)選地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌和其后代，酵母菌屬、優(yōu)選釀酒酵母和其后代，漢遜酵母屬或畢赤酵母屬、優(yōu)選畢赤酵母和多形漢遜酵母和其后代，克魯維酵母菌屬、優(yōu)選乳酸克魯維酵母和其后代，米曲霉菌屬、優(yōu)選米曲霉菌、構(gòu)巢曲霉、或黑曲霉和其后代，或木霉屬、 優(yōu)選里氏木霉或哈茨木霉和其后代。此外，本發(fā)明涉及核酸片段以及多肽，所述核酸片段以及多肽專門(mén)突變和必要時(shí)密碼子優(yōu)化以應(yīng)用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。所述核酸片段選自，但不限于由seqidno.：8、16、17、20和85。具有突變的多肽選自，但不限于seqidno.：28、36、37、40和86。此外，提供一種組合物，所述組合物包括依據(jù)方面三的根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括羅賓紅素和至少一種選自下述的其他物質(zhì)：3,4-二甲氧基肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、3-甲氧酪胺、3-羥基-4-甲基苯乙胺、左旋多巴、3,4-二甲氧基苯乙胺。在另一實(shí)施方式中，組合物包括50重量％-99重量％的羅賓紅素、0.1重量％–49.9重量％的3,4-二甲氧基肉桂酸和0.1重量％–49.9重量％的3,4-二甲氧基苯乙胺。此外，本發(fā)明通過(guò)下列、但不可視為限制的實(shí)例闡述。實(shí)例1:產(chǎn)生不同的單獨(dú)構(gòu)建體為了產(chǎn)生所使用的單獨(dú)構(gòu)建體、即具有編碼序列的適合于蛋白質(zhì)表達(dá)的載體，合成不同的靶基因的相應(yīng)的編碼序列并且分別在兩個(gè)限制位點(diǎn)(restriktionsschnittstelle)之間克隆到載體pet28a(merckchemicals有限責(zé)任公司，schwalbach)或pqe30(qiagen，hilden)或pcdfduet-1(merckchemicals有限責(zé)任公司，schwalbach)中。表1中總結(jié)了克隆基因與分別用于克隆的限制位點(diǎn)的概覽。對(duì)于對(duì)應(yīng)于cbmomt和其變體l322n和t133s、cbiemt1、rcomt、gmsomt和psomt的seqidno.：7-9、15、17、5和18，大腸桿菌上基因的密碼子使用適合作為計(jì)劃的表達(dá)宿主。此外，在seqidno.8、9、16和17中具有一種或多種相對(duì)于從相應(yīng)的生物中獲得的原始序列的點(diǎn)突變。表1：克隆基因與應(yīng)用的載體和限制位點(diǎn)的概覽為了產(chǎn)生構(gòu)建體pgj3610_dmddc，合成靶基因的編碼序列(seqidno.：1，seqidno.：2)作為受lifetechnologies有限責(zé)任公司(達(dá) 姆施塔特(darmstadt))委托的基因合成以用于稍后在大腸桿菌中在密碼優(yōu)化的變體中使用。緊接著，基因的編碼序列根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐借助于限制性酶切消化用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi和ncoi(newenglandbiolabs有限責(zé)任公司，法蘭克福(frankfurt))從基因合成質(zhì)粒中剪切。緊接著，限制性制備物在瓊脂糖凝膠上分離并且具有1430堿基對(duì)長(zhǎng)度的目的片段借助凝膠和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收試劑盒(pcrclean-up-kit)(macherey-nagel有限責(zé)任公司&co.kg,düren)從凝膠洗脫出來(lái)。為了建立目的表達(dá)質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶bamhi和ncoi(newenglandbiolabs有限責(zé)任公司，法蘭克福(frankfurt))消化基礎(chǔ)表達(dá)質(zhì)粒并且所獲得的具有2981堿基對(duì)長(zhǎng)度的dna片段借助凝膠和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)回收試劑盒(pcrclean-up-kit)(macherey-nagel有限責(zé)任公司&co.kg,düren)在電泳分離之后從瓊脂糖凝膠洗脫出來(lái)。根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐，表達(dá)質(zhì)粒的建立經(jīng)由用各50ng純化的dna片段(目的片段和表達(dá)質(zhì)粒片段)和t4dna連接酶(newenglandbiolabs有限責(zé)任公司，法蘭克福(frankfurt))的連接反應(yīng)進(jìn)行。借助于標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法(maniatis等，1983年)，反應(yīng)產(chǎn)物引入大腸桿菌xl1-blue感受態(tài)細(xì)胞中并且細(xì)胞經(jīng)過(guò)18小時(shí)在37℃下在選擇性的固體培養(yǎng)基上吸住(lb+氨芐西林(100mg/l)+6g/l瓊脂)。為了鑒別陽(yáng)性克隆，接種具有耐受性單菌落的液體培養(yǎng)基(3ml；lb+氨芐西林(100mg/l))并且如之前那樣吸住。緊接著，借助于genejet質(zhì)粒小提試劑盒(genejetplasmidminiprepkit)(賽默飛世爾科技(thermoscientific))并且根據(jù)普遍的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐經(jīng)由限制性表型(restrictionskatierung)來(lái)分析細(xì)胞的質(zhì)粒dns。經(jīng)由gatcbiotech公司(康斯坦茨，德國(guó)(konstanz,germany))進(jìn)行陽(yáng)性克隆的克隆的dna序列的檢驗(yàn)。實(shí)例2:借助誘變產(chǎn)生不同的cbmomt變體基于質(zhì)粒pet28a_cbmomt，借助quikchangeii定點(diǎn)突變?cè)噭┖?quikchangeiisite-directedmutagenesekit)(agilent,waldbronn) 產(chǎn)生不同的酶變異。在此，依照制造商說(shuō)明書(shū)，利用特定的引物將有針對(duì)性的突變引入cbmomt的編碼的序列中。對(duì)于cbmomt的變體1使用引物momt-l322n_for(seqidno.:41)和momt-l322n_rev(seqidno.:42)，對(duì)于變體2使用引物momt-t133s_for(seqidno.:43)和momt-t133s_rev(seqidno.:44)。由此產(chǎn)生根據(jù)seqidno.:8和9的序列。相應(yīng)的翻譯的蛋白質(zhì)的序列在seqidno.:28和29中描述。實(shí)例3:產(chǎn)生使用的雙重構(gòu)建體3.1制備質(zhì)粒pet28a_cbmomt_scsams(a)產(chǎn)生pet28a_gg構(gòu)建體質(zhì)粒pet28a_cbmomt_scsams的制備借助goldengatetechnologie(wo2011/154147a1)進(jìn)行。為了對(duì)此進(jìn)行準(zhǔn)備，首先合成專門(mén)的核酸序列(seqidno.:53)并且緊接著用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii剪切并且引入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的連接制備物中的載體pet28a(merckchemicals有限責(zé)任公司，schwalbach)中，由此獲得質(zhì)粒pet28a_gg。(b)擴(kuò)增cbmomt基因基因cbmomt從pet28a_cbmomt構(gòu)建體的質(zhì)粒dns(見(jiàn)實(shí)例1)借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)利用dreamtaq-dna-聚合酶(賽默飛世爾科技(thermoscientific)，波恩(bonn))根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐擴(kuò)增。在此，使用引物m_term-f(seqidno.:49)和m_term-r(seqidno.:50)。緊接著，pcr制備物在1％的瓊脂糖凝膠上分離并且具有1280堿基對(duì)長(zhǎng)度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從凝膠洗脫出來(lái)。(c)擴(kuò)增scsams基因基因scsams從pcdfduet-1_scsams構(gòu)建體的質(zhì)粒dns(見(jiàn) 實(shí)例1)借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)利用dreamtaq-dna-聚合酶(賽默飛世爾科技(thermoscientific)，波恩(bonn))根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐擴(kuò)增。在此，使用引物s_prom-f(seqidno.:51)和s_prom-r(seqidno.:52)。緊接著，pcr制備物在1％的瓊脂糖凝膠上分離并且具有1425堿基對(duì)長(zhǎng)度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從凝膠洗脫出來(lái)。(d)基因cbmomt和scsams克隆到pet28a_gg中100ng質(zhì)粒pet28a_gg(見(jiàn)步驟3.1a)與24ng的純化的cbmomt片段和25ng純化的scsams片段在15μl反應(yīng)制備物中在37℃下孵育1h，所述反應(yīng)制備物具有1xnebt4連接酶緩沖液(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))、0.1mg/mlbsa(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))、20ubsai(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))和100unebt4dna連接酶(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))，緊接著在50℃下孵育5min并且在80℃下孵育5min以終止反應(yīng)，孵育。3.2制備質(zhì)粒pet28a_mcpfomt_cbmomt-t133sa)t7-啟動(dòng)子_mcpfomt_t7-終止子片段的擴(kuò)增包括t7啟動(dòng)子、mcpfomt的編碼序列和t7終止子的核酸序列連同限制性內(nèi)切酶sphi或bglii的識(shí)別序列，根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐利用onetaq-聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)中從pet28a_mcpfomt(見(jiàn)實(shí)例1)構(gòu)建體的質(zhì)粒dns擴(kuò)增(引物：seqidno.:54，seqidno.：55)。緊接著，pcr制備物在1％的瓊脂糖凝膠上分離并且具有1079堿基對(duì)的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從凝膠洗脫出來(lái)。b)t7-啟動(dòng)子_mcpfomt_t7-終止子片段克隆到載體 pet28a_cbmomt中a)中的1μg的dna片段以及3μg載體pet28a_cbmomt4(見(jiàn)實(shí)例1)利用限制性內(nèi)切酶sphi和bglii(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐剪切并且緊接著在1％的瓊脂糖凝膠上分離。相應(yīng)的片段從糖凝膠洗脫出來(lái)并且借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)純化。緊接著，51.5ng純化的t7-啟動(dòng)子_mcpfomt_t7-終止子片段與100ng純化的pet28a_cbmomt4載體連同5uexpresslinkt4dna連接酶(lifetechnologies有限責(zé)任公司,darmstadt)在具有1xexpresslink連接酶緩沖液(lifetechnologies有限責(zé)任公司,darmstadt)的20μl反應(yīng)制備物中混合并且在室溫下孵育5min。3.3制備pcdfduet_at4cl2_catht構(gòu)建體為了產(chǎn)生所述構(gòu)建體，合成靶基因的相應(yīng)的編碼序列(at4cl2:seqidno.:11，在里氏木霉上密碼子優(yōu)化；catht：seqidno.：14)并且緊接著在限制位點(diǎn)psti和noti(at4cl2)或kpni和xhoi(catht)之間克隆到載體pcdfduet(merckchemicals有限責(zé)任公司,schwalbach)中。在此，對(duì)于這兩種基因，調(diào)整密碼子使用在大腸桿菌上作為可行的表達(dá)宿主。相應(yīng)的翻譯序列描述為seqidno.:31或34。3.4制備pcdfduet_ntcl1_nttht構(gòu)建體為了產(chǎn)生所述構(gòu)建體，合成靶基因的相應(yīng)的編碼序列(nt4cl1:seqidno.:12，在黑曲霉上密碼子優(yōu)化；nttht:seqidno.:13)并且緊接著在限制位點(diǎn)psti和noti(ntcl1)或paci和avrii(nttht)之間克隆到載體pcdfduet(merckchemicals有限責(zé)任公司,schwalbach)中。在此，對(duì)于這兩種基因，在大腸桿菌上密碼子使用適合作為可行的表達(dá)宿主。相應(yīng)的翻譯序列描述為seqidno.:32或33。實(shí)例4:產(chǎn)生使用的三重構(gòu)建體為了產(chǎn)生使用中的三重構(gòu)建體，分別合成操縱子，所述操縱子由一個(gè)t7-啟動(dòng)子、3個(gè)可變的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs1-3)、3個(gè)編碼的核苷酸序列(orf1-3)和一個(gè)t7終止子構(gòu)成并且緊接著克隆到載體pma7中(見(jiàn)表2)。表2：具有用于orf1-3的rbs的pma7-1構(gòu)建體和pma7-2構(gòu)建體的概覽(分別說(shuō)明相應(yīng)的seqidno.56、57或58)實(shí)例5:在大腸桿菌細(xì)胞中質(zhì)粒dns的轉(zhuǎn)化為了增殖在實(shí)例1-4中產(chǎn)生的質(zhì)粒，質(zhì)粒dns在化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌neb5α細(xì)胞中(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))進(jìn)行。等分成50μl的細(xì)胞在冰上孵育5分鐘。在添加1μl質(zhì)粒dns之后，混合懸浮液并且在冰上繼續(xù)孵育30分鐘。轉(zhuǎn)化通過(guò)將懸浮液轉(zhuǎn)移到加熱模塊中(thermoblock)在42℃下培養(yǎng)30s并且接著在濕冰上培養(yǎng)2min進(jìn)行。然后添加600μl溶菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基(lb)培養(yǎng)基(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))并且將細(xì)胞在37℃和180rpm下培養(yǎng)1h。最后將200μl培養(yǎng)液涂布在具有相應(yīng)的抗生素的lb瓊脂上(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))。皮氏培養(yǎng)皿在37℃下孵育16h。為了準(zhǔn)備蛋白質(zhì)表達(dá)，相應(yīng)的質(zhì)粒dns的轉(zhuǎn)化在大腸桿菌bl21(de)細(xì)胞上進(jìn)行。將等分成50μl的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞在冰上孵育 5分鐘。在添加1μl質(zhì)粒dns之后，混合懸浮液并且在冰上繼續(xù)孵育5分鐘。轉(zhuǎn)化通過(guò)將懸浮液轉(zhuǎn)移到加熱模塊中(thermoblock)在42℃下培養(yǎng)30s并且接著在濕冰上培養(yǎng)2min。然后添加250μllb培養(yǎng)基(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))并且細(xì)胞在37℃和180rpm下培養(yǎng)1h。最后將200μl培養(yǎng)液涂布在具有相應(yīng)的抗生素的lb瓊脂上(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))。皮氏培養(yǎng)皿在37℃孵育16h。實(shí)例6:蛋白質(zhì)表達(dá)和純化為在50ml體積中準(zhǔn)備蛋白質(zhì)表達(dá)，首先5mllb培養(yǎng)基的預(yù)培養(yǎng)液(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))用相應(yīng)的抗生素處理并且借助接種環(huán)將相應(yīng)的菌株的細(xì)胞從瓊脂板中取出并且轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)液中。然后，所述預(yù)培養(yǎng)液在37℃和150rpm下孵育16h。從預(yù)培養(yǎng)液中借助50mllb培養(yǎng)基(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))和相應(yīng)的抗生素接種主培養(yǎng)夜，使得在600nm中光密度為0.1。緊接著，主培養(yǎng)液在37℃和150rpm下孵育直至在600nm中光密度達(dá)到0.4-0.8。為了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，在所述時(shí)間點(diǎn)添加1mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷并且培養(yǎng)液在22℃繼續(xù)孵育16h。緊接著，在10000rpm下離心分離主培養(yǎng)液達(dá)10min，以便獲得細(xì)胞沉淀并且緊接著能夠執(zhí)行蛋白質(zhì)提取和純化。為此，首先借助b-per蛋白質(zhì)提取試劑(b-perproteinextractionreagent)(賽默飛世爾科技(thermoscientific)，波恩(bonn))依照制造商說(shuō)明書(shū)執(zhí)行細(xì)胞破碎。接著，所以獲得的細(xì)胞裂解液要么直接使用，要么依照制造商說(shuō)明書(shū)借助1mlhispurni-nta層析柱(賽默飛世爾科技(thermoscientific)，波恩(bonn))處理。實(shí)例7:生物技術(shù)制備3,4-二甲氧基肉桂酸7.13,4-二甲氧基肉桂酸的酶促展示(darstellung)2mm阿魏酸溶解于50mmtris緩沖液，ph7.5連同4mms-腺苷甲硫氨酸和50μgcbmomt、cbmomt-l322n、cbmomt-t133s、 cbmomt-t133s/l322n(seqidno.:86)或gmsomt蛋白質(zhì)在350μl的總體積中在30℃下孵育6h。然后，通過(guò)添加350μl乙脲終止反應(yīng)。然后，所獲得的反應(yīng)混合物借助hplc分析。使用具有2.1mm直徑和100mm長(zhǎng)度的poroshell120sb-c18(2.7μm)分離柱來(lái)分析。借助下面示出的梯度法，在40℃的柱溫下進(jìn)行分離。具有0.1％蟻酸(a)和乙脲(b)的水在0.4ml/min流速的情況下用作移動(dòng)相。在320nm波長(zhǎng)的情況下進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)外標(biāo)法用相應(yīng)的基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行滯留時(shí)間的確定以及定量的確定。根據(jù)實(shí)例7.1所述的梯度法：0.00mina:95％b:5％0.10mina:95％b:5％10.00mina:50％b:50％12.00mina:0％b:100％15.00mina:0％b:100％15.01mina:95％b:5％7.23,4-二甲氧基肉桂酸的發(fā)酵展示用pet28a_cbmomt-l322n或用pet28a_cbmomt-l322n_scsams轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在tb培養(yǎng)基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)培養(yǎng)直至在600nm中光密度為0.6并且通過(guò)添加0.2mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。直接在添加誘導(dǎo)因子之后，用5mm阿魏酸摻入培養(yǎng)液并且在30℃和130rpm下孵育48h。然后，如在實(shí)例7.1中示出，借助hplc分析獲得的反應(yīng)混合物。實(shí)例8:生物技術(shù)制備3,4-二甲氧基苯乙胺8.1基于左旋多巴酶促展示3,4-二甲氧基苯乙胺1mm左旋多巴連同50μgmcpfomt、50μgcbmomt、50μgdmddc(seqidno.:1，密碼子優(yōu)化的序列)、140μm氯化鎂、40μm磷酸吡哆醛和4mms-腺苷甲硫氨酸在100mm磷酸鉀緩沖液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。然后，借助hplc分析獲得的反應(yīng)混合物。使用具有4mm直徑和250mm長(zhǎng)度的gromsilods-4he(5μm)分離柱來(lái)分析。借助下面示出的梯度法，在40℃的柱溫下進(jìn)行分離。20mm磷酸鉀緩沖液ph4.0(a)和乙脲(b)在0.8ml/min流速的情況下用作移動(dòng)相。在214nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)外標(biāo)法用相應(yīng)的基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行滯留時(shí)間的確定以及定量的確定。根據(jù)實(shí)例8.1所述的梯度法：0.00mina:100％b:0％15.00mina:80％b:20％16.00mina:100％b:0％21.00mina:100％b:0％8.2基于左旋多巴來(lái)發(fā)酵展示3,4-二甲氧基苯乙胺用psym_ddcandpet28a_mcpfomt_cbmomt-t133s轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在tb培養(yǎng)基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分開(kāi)培養(yǎng)直至在600nm中光密度為0.6并且緊接著混合，使得兩種培養(yǎng)液分別在600nm中光密度為0.5。緊接著添加1mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷和0.1％阿拉伯糖來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)以及添加5mm左旋多巴作為底物。培養(yǎng)液在30℃和170rpm下孵育48h之后，如在實(shí)例8.1中示出， 借助hplc分析發(fā)酵上清液。8.3基于多巴胺酶促展示3,4-二甲氧基苯乙胺酶1.3mm多巴胺連同50μgmcpfomt、50μgcbmomt、50μgdmddc(seqidno.:1，密碼子優(yōu)化的序列)、140μm氯化鎂、40μm磷酸吡哆醛和5.2mms-腺苷甲硫氨酸在100mm磷酸鉀緩沖液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。然后，如在實(shí)例8.1中描述，借助hplc分析獲得的反應(yīng)混合物。8.4基于多巴胺發(fā)酵展示3,4-二甲氧基苯乙胺用pet28a_mcpfomt_cbmomt-t133s轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在tb培養(yǎng)基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)培養(yǎng)直至600nm中光密度為1.1。緊接著添加0.2mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并且添加5mm多巴胺作為底物。培養(yǎng)液在30℃和150rpm下孵育48h之后，如在實(shí)例8.1中示出，借助hplc分析發(fā)酵上清液。實(shí)例9:生物技術(shù)制備羅賓紅素用pcdfduet_at4cl2_catht、pma7-1和pet28a_cbmomt-l322n_scsams轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在tb培養(yǎng)基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分開(kāi)地培養(yǎng)直至在600nm時(shí)光密度為1.3并且緊接著混合，使得所有培養(yǎng)液在600nm中光密度分別為0.5。緊接著添加0.8mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并且添加5mm左旋多巴和5mm異阿魏酸作為底物。培養(yǎng)液在30℃和150rpm下孵育48h之后，借助lc-ms分析發(fā)酵上清液。為了分析使用watersacquityuplc和brukermicrotofq-ii檢測(cè)器。借助具有2.1mm直徑和100mm長(zhǎng)度的phenomenexkinetexc18(1.7μm)分離柱在50℃柱溫的情況下借助下面描述的梯度法進(jìn)行試樣分離。具有0.1％蟻酸(a)和0.09％蟻酸(b)的乙脲的水在0.3ml/min流速下用作移動(dòng) 相。根據(jù)外標(biāo)法用相應(yīng)的基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行滯留時(shí)間的確定以及定量確定。根據(jù)實(shí)例9所述的梯度法：0.00mina:90％b:10％25.00mina:65％b:35％26.00mina:0％b:100％30.00mina:0％b:100％實(shí)例10:生物技術(shù)制備阿魏酰-3-甲氧基酪胺用pcdfduet_nt4cl1_nttht和pma7-2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在tb培養(yǎng)基中(23.6g/l酵母提取液、11.8g/l胰蛋白、9.4g/lk2hpo4、2.2g/lkh2po4、4ml/l甘油)分開(kāi)培養(yǎng)直至在600nm中光密度為1.0并且緊接著混合，使得兩種培養(yǎng)液在600nm中光密度分別為0.5。緊接著添加1mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)并且5mm左旋多巴和5mm異阿魏酸作為底物。培養(yǎng)液在30℃和150rpm下孵育48h之后，如在實(shí)例9中示出，借助lc-ms分析發(fā)酵上清液。實(shí)例11:基于(e)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺酶促展示(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺0.64mm(e)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺連同50μgcbmomt和1.3mms-腺苷甲硫氨酸在50mmtris緩沖液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。如在實(shí)例9中描述，隨后借助lc-ms分析獲得的反應(yīng)混合物。實(shí)例12:基于(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺酶促展示二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺1.22mm(e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-[2-(4-羥苯基)乙基]2-丙烯酰胺連同1mgcbmomt裂解液、1mgtaomt2裂解液或1mggmsomt裂解液和4.88mms-腺苷甲硫氨酸在50mmtris緩沖液，ph7.5中混合并且在30℃下孵育24h。如在實(shí)例9中示出，借助lc-ms分析獲得的反應(yīng)混合物。實(shí)例13:不同的甲基轉(zhuǎn)移酶與肉桂酸、苯乙胺和肉桂酸酰胺的反應(yīng)的研究200ppm待研究的底物連同與底物相比雙倍摩爾量的s-腺苷甲硫氨酸和50μg酶在相應(yīng)的緩沖液(見(jiàn)表3)中混合并且在30℃下孵育24h。隨后借助lc-ms分析獲得的反應(yīng)混合物。在此，如在實(shí)例9中示出，分析包含肉桂酸或肉桂酸酰胺的反應(yīng)混合物。為了分析苯乙胺，使用watersacquityuplc和brukermicrotofq-ii檢測(cè)器。借助具有2.1mm直徑和150mm長(zhǎng)度的acquityhsst3(1.8μm)分離柱在50℃柱溫下借助下面描述的梯度法進(jìn)行試樣分離。具有0.1％蟻酸(a)和0.09％蟻酸(b)的乙脲的水在0.35ml/min流速下用作移動(dòng)相。根據(jù)外標(biāo)法用相應(yīng)的基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行滯留時(shí)間的確定以及定量確定。根據(jù)實(shí)例13所述的梯度法：0.00mina:100％b:0％22.00mina:5％b:95％27.00mina:5％b:95％30.00mina:0％b:100％表3：在實(shí)例13中使用的緩沖液列表實(shí)例14:肉桂酸酯和苯乙胺酶促反應(yīng)成相應(yīng)的肉桂酸酰胺0.1mmol肉桂酸酯與0.1mmol苯乙胺溶解在5ml三乙胺中并且連同50mg固化的源于南極假絲酵母的連接酶b(roche,mannheim)在回流條件下在70℃下攪拌24h。緊接著固化的酶通過(guò)過(guò)濾回收。借助lc-ms分析濾液。實(shí)例15:產(chǎn)生pd1214_cbmomt質(zhì)粒為了將cbmomt(seqidno.:7)克隆到修飾的pd1214穿梭載體(由dna2.0，usa提供)，基因的編碼序列利用onetaq聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的實(shí)踐借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增。在此，借助特定的引物(seqidno.:45，seqidno.:46)在片段的5′端和3′端產(chǎn)生用于bsai的位點(diǎn)。緊接著，pcr制備物在1％的瓊脂糖凝膠上分離并且具有1143堿基對(duì)長(zhǎng)度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從凝膠洗脫出來(lái)。100ng載體與20ng純化的pcr片段在15μl反應(yīng)制備物中在37℃下孵育1h，所述反應(yīng)制備物具有1xnebt4連接酶緩沖液(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))、0.1mg/mlbsa(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))、20ubsai(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))和100unebt4dna連接酶(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))，緊接著在50℃下孵育5min并且為了終止反應(yīng)，在80℃下孵育5min。實(shí)例16:產(chǎn)生pd1214_cbmomt_sams質(zhì)粒為了將sams克隆到穿梭載體pd1214_cbmomt(見(jiàn)實(shí)例15)，基因的編碼序列連同用于限制性內(nèi)切酶bamhi和bglii的識(shí)別序列利用onetaq聚合酶(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))根據(jù)普遍的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)踐在pcr(引物:seqidno.:47，seqidno.:48)中擴(kuò)增。緊接著，pcr制備物在1％的瓊脂糖凝膠上分離并且具有1175堿基對(duì)長(zhǎng)度的目的片段借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從凝膠洗脫出來(lái)。與此并行，將3μgpd1214_cbmomt載體與10ubamhi和5ubglii(兩者都來(lái)自newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))在30μl反應(yīng)制備物中在37℃下孵育4h，所述反應(yīng)制備物具有1xneb緩沖液3(newenglandbiolabs，美因河畔法蘭克福(frankfurtammain))。 在緊接著添加1u小牛腸堿性磷酸酶(calfintestinealkalinephosphatase)(lifetechnologies有限責(zé)任公司，達(dá)姆施塔特(darmstadt))之后，制備物在37℃下孵育1h。緊接著，制備物在1％的瓊脂糖凝膠上以層析法分離并且線性的載體借助qiaprepspinminiprepkit(qiagen,hilden)從糖凝膠洗脫出來(lái)。為了連接，30fmol洗脫的載體與90fmol純化的pcr片段連同5uexpresslinkt4dna連接酶(lifetechnologies有限責(zé)任公司，達(dá)姆施塔特(darmstadt))在20μl反應(yīng)制備物中混合，所述反應(yīng)制備物具有1xexpresslink連接酶緩沖液(lifetechnologies有限責(zé)任公司，達(dá)姆施塔特(darmstadt))并且在室溫下孵育5min。實(shí)例17:穿梭載體的增殖為了類似于實(shí)例15和實(shí)例16制備的質(zhì)粒的增殖，在化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌xl1blue細(xì)胞首先在冰上孵育5分鐘之后，分別將5μl反應(yīng)制備物添加到各50μl的所述化學(xué)感受態(tài)的大腸桿菌xl1blue細(xì)胞中。緊接著，制備物在冰上繼續(xù)孵育30分鐘。轉(zhuǎn)化通過(guò)懸浮液轉(zhuǎn)在加熱模塊在42℃下孵育30s并且接著轉(zhuǎn)移到濕冰上孵育2min來(lái)進(jìn)行。然后添加600μllb培養(yǎng)基(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))以及細(xì)胞在37℃和180rpm下孵育1h。最后200μl培養(yǎng)液涂布在具有相應(yīng)的抗生素的lb瓊脂上(carlroth有限責(zé)任公司，卡爾斯魯厄(karlsruhe))并且將皮氏培養(yǎng)皿在37℃下孵育16h。實(shí)例18:在釀酒酵母中轉(zhuǎn)化為了實(shí)例15或?qū)嵗?6中的質(zhì)粒dns的轉(zhuǎn)化，首先用150mlypd培養(yǎng)基(formedium，英國(guó))從釀酒酵母菌株by4741的過(guò)夜培養(yǎng)液中接種主培養(yǎng)液。在達(dá)到od600nm～0.2之后，離心分離培養(yǎng)液，棄掉上清液并且所獲得的沉淀在1.5ml1xte/1xliac緩沖液(10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸鋰，ph7.5)中重懸。與此并行，對(duì)于每種待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dns，將10mg/ml的鯡魚(yú)精dna溶液(lifetechnologies有限責(zé)任公司，達(dá)姆施塔特(darmstadt))的10μl等分試樣在95℃變 性5min并且接著在冰箱中冷卻。緊接著，向所述等分試樣添加100ng質(zhì)粒dns以及100μl釀酒酵母細(xì)胞，所述釀酒酵母細(xì)胞在1xte/1xliac緩沖液(10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸鋰，ph7.5)中重懸。在添加600μl無(wú)菌peg/liac溶液(40％peg4000、10mmtris-hcl、1mmedta、0.1m醋酸鋰，ph7.5)之后，試樣渦旋10s并且緊接著在30℃和200rpm下孵育30min。在添加70μldmso之后，在42℃下孵育15分鐘，接著在濕冰上冷卻2min。緊隨其后短時(shí)間地離心分離細(xì)胞，棄掉上清液并且所獲得的沉淀在500μl1xte緩沖液(10mmtris-hcl、1mmedta，ph7.5)中接納。100μl所述懸浮液涂布在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上并且在30℃下孵育48h。實(shí)例19:用釀酒酵母細(xì)胞發(fā)酵展示3,4-二甲氧基肉桂酸用pd1214_cbmomt或pd1214_cbmomt_sams轉(zhuǎn)化的釀酒酵母細(xì)胞在sdglu-ura培養(yǎng)基(1.9g/lyeastnitrogenbase[formedium，英國(guó)]、0.77g/l不具有尿嘧啶的完全補(bǔ)充混合物[formedium,greatbritain]、20g/l葡萄糖、5g/l硫酸銨)中在30℃下培養(yǎng)直至在600nm中光密度為0.2。為了與pd1214_cbmomt反應(yīng)，，立即在達(dá)到od之后向培養(yǎng)基添加1mm阿魏酸并且制備物在30℃和200rpm下孵育48h。隨后借助hplc分析獲得的反應(yīng)混合物。為了與pd1214_cbmomt_sams反應(yīng)，在達(dá)到od之后，首先離心分離細(xì)胞，棄掉上清液并且將所獲得的沉淀置于sdgal-ura培養(yǎng)基(1.9g/lyeastnitrogenbase[formedium，英國(guó)]、0.77g/l不具有尿嘧啶的完全補(bǔ)充混合物[formedium，英國(guó)]、20g/l半乳糖、5g/l硫酸銨)中。然后添加1mm阿魏酸并且制備物在30℃和200rpm下孵育48h。同樣地，如實(shí)例7.1中描述，借助hplc分析獲得的反應(yīng)混合物。當(dāng)前第1頁(yè)12