一種孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A及其應用技術領域本發(fā)明屬于孤獨癥檢測技術領域，涉及一種孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A及其應用。

背景技術：
孤獨癥，也稱為孤獨癥譜系障礙(AutismSpectrumDisorders，ASD)，是一種以社會功能缺失、言語和非言語溝通異常，以及行為和興趣刻板局限為主要特征的廣泛神經發(fā)育障礙，患病率約1％。一般發(fā)病于3歲前的幼兒期，并持續(xù)終生，男孩發(fā)病率是女孩的4～6倍。研究表明，ASD的早期診斷和篩查有助于增加孤獨癥兒童從早期干預中獲益的機會。然而由于缺乏生物標志物，目前對ASD的篩查診斷主要以兒童的行為特征及發(fā)育史為基礎，因此存在爭議，亟需篩選可量化生物學診斷指標。ASD發(fā)病率逐年增加，已經引起了學術界的廣泛關注。該病的診斷最初起源于對一組病人臨床癥狀的觀察，從有孤獨癥診斷至今，由于缺乏可量化的指標，診斷標準修改過多次。孤獨癥診斷標準的主要內容均為癥狀描述，并且其癥狀存在多樣性，學界對其以癥狀表述為主的診斷標準存在爭議。因此，篩查ASD可量化的生物學指標、生物標志物的鑒定、不僅有利于其早期篩查及診斷，對該病發(fā)病機制的探討、診斷標準的制定及治療藥物的研制亦具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A及其應用，該血清多肽標志物分子為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個片段，是孤獨癥血清多肽標志物。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該血清多肽標志物SERPINA5-A為絲氨酸蛋白酶抑制劑A5SERPINA5的一個片段，分子量為3886道爾頓。所述孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A，其血清中的檢測參數(shù)為2.81～5.11ng/mL。本發(fā)明還公開了孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A作為孤獨癥血清診斷藥物的靶點的應用。本發(fā)明還公開了孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A在制備孤獨癥血清診斷藥物中的應用。所述孤獨癥血清診斷藥物為ELISA檢測孤獨癥血清多肽分子的藥物。與上述孤獨癥血清多肽標志物SERPINA5-A相結合的分子在制備孤獨癥血清診斷藥物中的應用。SERPINA5蛋白作為孤獨癥血清診斷藥物的靶點的應用。與SERPINA5蛋白相結合的分子在制備孤獨癥血清診斷藥物中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：本發(fā)明公開了一種孤獨癥患兒的血清標志物及其檢測方法。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為SERPINA5-A,為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個片段。其精確分子量為3886道爾頓，在孤獨癥患兒血清中呈現(xiàn)顯著高表達：而在正常對照人群中血清中表達范圍為：2.08～3.28ng/mL；在孤獨癥患兒血清中表達范圍為：2.81～5.11ng/mL，且組間具有極顯著差異(p<0.001)。鑒于SERPINA5-A在孤獨癥血清中顯著高表達，那么SERPINA5-A就可以作為孤獨癥血清診斷標志物；且其母本蛋白SERPINA5在孤獨癥患兒血清中呈現(xiàn)特異性的高表達，因此，SERPINA5可應用于孤獨癥患兒血清診斷：用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)檢測SERPINA5-A或ELISA方法測檢測SERPINA5的表達水平，可作為孤獨癥患兒檢測的方法。而針對ELISA檢測孤獨癥血清診斷，SERPINA5就可以作為ELISA檢測藥物的新的靶點。附圖說明圖1為同一孤獨癥患兒血清樣本的三次重復的蛋白多肽圖譜(1KDa～10KDa)；圖2為蛋白多肽峰m/z:3886在孤獨癥患兒和正常對照組中的蛋白多肽表達差異；圖3為SERPINA5-A的MS/MS質譜鑒定圖譜；圖4為孤獨癥兒童及正常對照兒童血清中SERPINA5蛋白的表達水平。具體實施方式本發(fā)明提供的孤獨癥血清多肽分子，是一種新篩選的孤獨癥血清診斷標志物，其表達具有特異性，可應用于孤獨癥診斷。下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。具體的該孤獨癥血清診斷標志物的篩選為：首先應用液體蛋白芯片技術分離提取孤獨癥患兒和正常對照兒童血清蛋白多肽，應用MALDI-TOF-MS捕獲孤獨癥患兒和正常對照人群蛋白多肽圖譜，并且采用ClinProTools2.1軟件對比分析孤獨癥患兒和正常人群血清蛋白多肽譜圖差異，找出組間顯著差異表達的蛋白多肽分值，在孤獨癥患兒血清中顯著高表達的蛋白多肽峰值中篩出孤獨癥血清腫瘤標志物。對于所篩選的孤獨癥血清診斷標志物的驗證為：應用HPLC將孤獨癥患兒血清分離的蛋白多肽混合物分為20～30個組分，在對其進行二級質譜的鑒定，并且對鑒定出的蛋白多肽采用酶聯(lián)免疫法進行血清回歸分析，結果血清回歸驗證證明其在孤獨癥患兒血清中顯著高表達，具有特異性，可以作為孤獨癥患兒血清篩查的生物標志物。1、樣本的采集與處理：采集自西安交通大學附屬兒童醫(yī)院(2013年1月至2015年12月)的150例(男性130例；女性20例；平均年齡3.5歲)臨床確診的孤獨癥患兒和150例正常健康對照兒童(男性130例；女性20例；平均年齡3.5歲)。樣本考慮年齡、性別、采集時間、儲存條件是否一致、有無基礎疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黃帽、有隔離膠)采集全血5mL，室溫靜置30min；室溫離心5min(3000g)，將上層血清分裝成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反復凍融。1.2試劑與儀器血清蛋白的提取采用德國布魯克公司的磁珠試劑盒“弱陽離子型”(MB-WCX)，以及光譜純(HPLC級)乙腈、三氟乙酸(德國Merck公司)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(美國Sigma公司)。磁珠分離器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlexIII基質輔助激光解析電離飛行時間質譜MALDI-TOF-MS(德國BrukerDaltonics公司)。2、血清蛋白樣本的制備運用弱陽離子(MB-WCX)磁珠捕獲血清蛋白多肽，具體操作步驟如下：①用混勻器完全混勻磁珠懸浮液1min；②加10μLMB-WCX結合液以及10μLMB-WCX磁珠至PCR管，混勻后加5μL血清，混勻至少5次，靜置5min；③將PCR管放入磁柱分離器，使磁珠貼壁1min，液體清澈后棄上清液；④加100μLMB-WCX沖洗液，在磁柱分離器上前后移動10次PCR管，磁珠貼壁后棄上清液，重復步驟③、④兩次；⑤加5μLMB-WCX洗脫液洗滌貼壁的磁珠，并反復吹打10次，磁珠貼壁2min，將上清液移入干凈的離心管；⑥加5μLMB-WCX穩(wěn)定液至離心管并混勻，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS檢測或者凍存于-20℃冰箱24h之內質譜分析。2.2質譜分析將分離收集得到的蛋白樣本1μL與10μL的基質α-氰基-4-羥基肉桂酸混勻，取1μL點在Anchorchip靶板上(德國Bruker公司)，每個樣本分別點三個靶點以作三次重復。待室溫干燥后將靶板放入質譜儀進行分析，采用FlexControl2.0軟件進行標準品校正后開始樣本檢測，每個樣本要經過總共300次激光打靶(5次點靶，每次打靶2×30次)之后生成質譜圖，獲得由不同質核比(m/z)組成的蛋白多肽譜圖。采用ClinProTools2.1軟件結合遺傳算法等生物統(tǒng)計學和生物信息學方法分析兩組血清樣本的蛋白多肽圖譜。進行歸一化平滑處理總離子流圖，消除化學及電物理噪聲；分析組間差異蛋白并計算差異大小，按差異大小由大到小排列，找出組間表達具有顯著差異的蛋白多肽峰值(P<0.001)。將孤獨癥患兒組和正常對照組血清樣本采用磁珠分離系統(tǒng)處理后，經過MALDI-TOF-MS分析后，對孤獨癥患兒組和正常對照組的每個樣本進行蛋白多肽圖譜繪制，在分子量范圍1000Da～10000Da共檢測到81個蛋白多肽峰圖，且每個樣本的三次重復穩(wěn)定性較高，如圖1所示。采用ClinProTools2.1軟件對質譜捕獲的孤獨癥患兒和正常對照組的血清蛋白多肽圖譜進行分析，將孤獨癥患兒血清多肽譜圖與正常人群進行比較分析，檢測到分子量為3886道爾頓的蛋白多肽峰在孤獨癥患兒血清中顯著高表達(孤獨癥兒童vs健康對照兒童：4.44±1.07vs2.53±0.59，p<0.001)。結果如圖2所示，對M/Z:3886在孤獨癥患兒(紅色，峰值在上的曲線)和正常對照(綠色，峰值在下的曲線)中的表達進行比較，發(fā)現(xiàn)M/Z:3886的蛋白多肽峰圖在孤獨癥患兒血清中均顯著高表達，因此對其進行序列鑒定并作為標志物的首選進一步鑒定。3、孤獨癥血清潛在標志物的序列鑒定具體采用液相色譜分離與質譜聯(lián)用的技術對孤獨癥血清多肽標志物M/Z:3886進行鑒定，采用Waters公司NanoAcquityUPLC對經磁珠分離收集的質譜上樣剩余的血清蛋白多肽進行二維凝膠色譜分離，收集15～30份肽段餾份：在收集液中檢測到目的蛋白；再聯(lián)用ThermoFisher公司LTQOrbitrapXL質譜系統(tǒng)對孤獨癥患兒血清中表達上調的蛋白多肽M/Z:3886進行序列鑒定。具體的操作步驟為：3.1樣本前處理合并提取后的蛋白樣，1300轉，10分鐘，取上清液，冷凍干燥儀干燥，使終體積在50ul，得到液體A，用安捷倫ziptip萃取柱，濃縮處理液體A。處理方法：①ziptip柱子用100％乙腈吹打5次，活化柱子；②活化好的ziptip在液體1中，反復吹吸10次，盡量避免氣泡產生；③50％ACN0.1％TFA水溶液，洗滌3次ziptip柱子；④、ziptip柱子在0.1％TFA中反復吹吸，使樣本洗脫，得到洗脫液2；⑤重復以上1-4步，30次；⑥合并30次的洗脫液2，冷凍干燥至10ul，用于質譜鑒定。3.2色譜分離：原始樣品加10ul流動相A，轉移至進樣瓶中，共20ul。一維超高效液相系統(tǒng)：Waters公司NanoAquityUPLC(WatersCorporation,Milford,USA)。色譜柱：捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn分析柱：C18,3.5μm,75μm×150mm,nanoAcquityTMColumn流動相A：5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液流動相B:95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液；所有溶液均為HPLC級。捕集流速15μl/min，捕集時間3min，分析流速400nl/min；分析時間60min，色譜柱溫度35℃；PartialLoop模式進樣，進樣體積18μl。梯度洗脫程序：時間流速流動相A％流動相B％40.00.40095.05.041.00.40055.045.045.00.40020.080.045.500.40095.05.060.000.40095.05.0凝膠色譜分離結果如圖3所示。色譜圖中橫坐標表示樣本流出時間，縱坐標代表多肽相對豐度，色譜設定時間為60min，從10min開始收集收集餾分，多肽成分主要在15min后被分離并采用梯度洗脫方式，使洗脫效率提高，設定捕集時間收集餾分：收集15～30份肽段餾份。3.3LTQ-OrbitrapXL質譜分析：使用ThermoFisher公司LTQObitrapXL質譜分析系統(tǒng)。Nano離子源(MichromBioresources,Auburn,USA)，噴霧電壓1.8kV；質譜掃描時間60min；實驗模式為數(shù)據(jù)依賴(DataDependent)及動態(tài)排除(DynamicExclusion),在10秒內對母離子進行2次串級之后加入到排除列表內90秒；掃描范圍400-2000m/z；一級掃描(MS)使用Obitrap，分辨率設定為100000；CID及二級掃描使用LTQ；在MS譜圖中選取強度最強的10個離子的單一同位素作為母離子進行MS/MS(單電荷排除，不作為母離子)。檢測結果如圖3所示。數(shù)據(jù)分析：使用數(shù)據(jù)分析軟件BioworksBrowser3.3.1SP1進行SequestTM檢索。母離子誤差設定為100ppm，碎片離子誤差設為1Da，酶切方式為非酶切,可變修飾為M(Methionine)甲硫氨酸氧化。檢索結果參數(shù)設定為deltacn>＝0.10。檢索結果為：m/z:3886.84；IPI:IPI00007221.1；GeneSymbol＝SERPINA5Plasmaserineproteaseinhibitorprecursor；序列為SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP。所分離的M/Z:3886稱為SERPINA5-A，為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個片段,其精確分子量為3886道爾頓，其氨基酸序列SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP(如SEQ.ID.NO.1所示)。因此，用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測SERPINA5-A或ELISA方法測檢測SERPINA5的表達水平，可作為孤獨癥患兒檢測的方法。SERPINA5-A作為SERPINA5的一個片段，提示SERPINA5是與孤獨癥特異性相關的蛋白，進一步通過ELISA檢測來進行驗證。4、孤獨癥血清SERPINA5表達的ELISA血清驗證分析：1)血清樣本：收集孤獨癥患兒血清48例(男性40例，女性8例；平均年齡3.5歲)、正常對照兒童血清40例(男性35例；女性5例；平均年齡3.5歲)進行ELISA的血清驗證分析。所有血清樣本均來自西安交通大學附屬兒童醫(yī)院，采集時間2014年1月～2015年12月。2)檢測方法：采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測孤獨癥患兒以及正常對照組的血清SERPINA5的表達水平，試劑盒購自美國R&D公司。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)：往預先包被抗人的SERPINA5蛋白(SERPINA5)抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的SERPINA5蛋白呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。具體實驗步驟參照試劑盒說明書，陽性判定標準按照試劑盒說明書界定。3)統(tǒng)計方法：采用GraphPad.Prism.v5.01軟件進行單因素方差分析(ANOVA)以及獨立樣本的T檢驗。4)結果分析：酶聯(lián)免疫法分析結果表明SERPINA5在孤獨癥及正常對照檢測組中的表達水平為孤獨癥vs正常對照組:3.83±0.47(2.81～5.11)vs2.42±0.26(2.08～3.28),p<0.001，組間具有顯著性差異，具體結果如圖4所示。對正常對照人群以及孤獨癥患兒血清中的SERPINA5進行ELISA檢測，結果表明孤獨癥患兒血清中SERPINA5顯著高表達(孤獨癥vs正常對照組:3.83±0.47vs2.42±0.26)：在正常對照兒童血清中表達范圍為：2.08～3.28ng/mL；在孤獨癥患兒血清中表達范圍為：2.81～5.11ng/mL，且組間具有極顯著差異(p<0.001)。這表明：SERPINA5是與孤獨癥發(fā)生密切相關的蛋白，可作為初步的孤獨癥檢測指標。因此可以通過ELISA實驗對待檢血清樣本的SERPINA5表達初步判定其是否還有孤獨癥：孤獨癥患兒(2.81～5.11ng/mL)；正常人群(2.08～3.28ng/mL)。綜上所述，本發(fā)明公開了一種新的孤獨癥血清多肽分子及其檢測方法和應用。其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為SERPINA5-A，是絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制A5(SERPINA5)的一個片段，其精確分子量為3886道爾頓SERPINA5-A在孤獨癥患兒血清檢測中呈現(xiàn)顯著高表達，用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測SERPINA5-A或ELISA方法測檢測SERPINA5的表達水平，可作為孤獨癥血清的檢測方法。