本發(fā)明涉及用于研究T細(xì)胞單型的方法，并且特別涉及能夠?qū)⒀仔?也被稱為反應(yīng)性或良性)T細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤(也稱為惡性或淋巴瘤)T細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)分的引物、探針和其他包含寡核苷酸和抗體的特異性檢測(cè)試劑。本發(fā)明還涉及區(qū)分炎性T細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)的方法。

背景技術(shù)：

組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的單型的分析是重要的和常見的臨床病理學(xué)問題，以便將炎性浸潤(rùn)與腫瘤浸潤(rùn)(例如，淋巴瘤或白血病)區(qū)分。在B細(xì)胞淋巴瘤的環(huán)境下，這通常通過使用對(duì)κ和λ輕鏈特異的檢測(cè)試劑在研究的早期階段進(jìn)行。偏離的κ:λ比率提高了組織B細(xì)胞浸潤(rùn)是腫瘤性而不是反應(yīng)性/炎性的可能性。當(dāng)B細(xì)胞種群中的所有B細(xì)胞僅表達(dá)一條輕鏈(僅κ或僅λ)時(shí)，其被稱為單型種群。單型種群的存在支持存在克隆或腫瘤性B細(xì)胞種群的可能性，并且因此是臨床實(shí)踐中常用的診斷研究。B細(xì)胞的單克隆種群將具有相同的V區(qū)；這只能通過確定V區(qū)的確切序列或序列的一些替代物，例如使用特異性引物的PCR片段大小來(lái)確定。

然而，在T細(xì)胞浸潤(rùn)的環(huán)境中，單型的指定是不可能的，因?yàn)棣屎挺随湶挥蒚細(xì)胞表達(dá)。代替地，通過進(jìn)行T細(xì)胞受體基因重排研究支持T細(xì)胞贅生物(neoplasm)的診斷，其中通過PCR擴(kuò)增重排的T細(xì)胞受體基因，然后通過凝膠或基因掃描儀分析來(lái)表征，以檢驗(yàn)顯性克隆擴(kuò)增的T細(xì)胞受體可變區(qū)(α、β、γ或δ)的存在。與κ/λ染色相比，這是昂貴且耗時(shí)的途徑，并且僅在專業(yè)中心進(jìn)行。此外，由于反應(yīng)性浸潤(rùn)也經(jīng)常與寡克隆抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)，并且腫瘤種群可以具有相關(guān)的抗腫瘤或其它炎性T細(xì)胞應(yīng)答，所以使用T細(xì)胞受體基因重排研究仍然常常難以將反應(yīng)性浸潤(rùn)與腫瘤浸潤(rùn)區(qū)分。因此，對(duì)數(shù)據(jù)的解釋是高度專業(yè)化的，并且是有爭(zhēng)議的。實(shí)際上，在臨床背景和相關(guān)的組織學(xué)特征的環(huán)境下解釋T細(xì)胞受體基因重排研究，但是與其中可以使用κ和λ的B細(xì)胞不同，解釋收到不能在組織學(xué)上可視化促進(jìn)單/寡或多克隆性的T細(xì)胞的阻礙。因此，將炎性T細(xì)胞種群與腫瘤性T-細(xì)胞種群區(qū)分的簡(jiǎn)單測(cè)試在臨床病理學(xué)實(shí)踐中，以及作為人類和非人類系統(tǒng)中的研究工具以檢驗(yàn)T細(xì)胞種群的單型程度(作為T細(xì)胞克隆性的替代)將是有價(jià)值的。這種系統(tǒng)的應(yīng)用的實(shí)例是在淋巴結(jié)、皮膚、腸、骨髓、肺、腎、血液和實(shí)際上任何其它組織的組織中的T細(xì)胞單型的分析。此外，作為克隆性的替代，T-細(xì)胞種群是否為單型的確定在預(yù)測(cè)T細(xì)胞淋巴瘤之外的一系列病癥中的預(yù)后中可能是重要的，其中T細(xì)胞種群的作用是重要的，例如(但不限于)，T細(xì)胞種群浸潤(rùn)其他腫瘤，或T細(xì)胞種群在各種器官中引起病癥，如在自身免疫疾病中或在骨髓或?qū)嶓w器官移植后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使得能夠分析T細(xì)胞單型和提供克隆性的支持證據(jù)的方法和試劑。然后該信息可以用于將炎性細(xì)胞與腫瘤性細(xì)胞區(qū)分和/或評(píng)估種群在其他情況下(其可以是結(jié)果預(yù)測(cè)、藥物反應(yīng)等)是克隆性的可能性。

所有的T細(xì)胞，包括自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)，在其表面上表達(dá)多個(gè)T細(xì)胞受體(TCR)的拷貝。TCR由兩條鏈(α鏈和β鏈或γ鏈和δ鏈)組成，每條鏈具有恒定區(qū)和可變區(qū)。由于在T細(xì)胞發(fā)育期間的體細(xì)胞(遺傳)重組，可變區(qū)可以以數(shù)百萬(wàn)個(gè)不同序列存在。作為單克隆，T細(xì)胞種群必須具有其中所有V區(qū)都相同的T細(xì)胞。每條鏈也具有恒定區(qū)。所有α恒定區(qū)是相同的，然而β恒定區(qū)可以以兩種形式，作為TRBC1(也稱為TCRBC1)和TRBC2(也稱為TCRBC2)存在。Droese et al.Leukemia(2004)18,1531-1538中討論了TRBC1和TRBC2。類似地，γ鏈包含稱為TRGC1(也稱為TCRG1)和TRGC2(也稱為TCRG2)的兩個(gè)非常相似的恒定區(qū)中的一種。T細(xì)胞受體的總體結(jié)構(gòu)決定了其與由MHC或MHC樣分子代表的抗原結(jié)合的特異性。在單型種群中，種群中的所有(或基本上所有)的T細(xì)胞將具有相同的恒定區(qū)，例如，均為TCRBC1或TCRBC2。在T細(xì)胞的多型種群中，一些T細(xì)胞具有帶有這些恒定區(qū)中的每種中的一種形式的受體，并且一些T細(xì)胞具有這些恒定區(qū)中的每種中的其他形式的受體，但每個(gè)單獨(dú)的T細(xì)胞將僅具有一種類型的恒定區(qū)。

在第一方面，本發(fā)明提供了研究T-細(xì)胞(包括NKT細(xì)胞)種群的單型的方法，包括檢測(cè)T細(xì)胞受體β和/或γ鏈恒定區(qū)的至少一種變體的表達(dá)。

可以將T細(xì)胞定義為在RNA和/或蛋白質(zhì)水平表達(dá)T細(xì)胞受體的細(xì)胞。T細(xì)胞的種群可以包括試樣中的所有T細(xì)胞或者具有特定形態(tài)的所有T細(xì)胞，或者由在蛋白質(zhì)/RNA/DNA/碳水化合物水平的特定的生物標(biāo)志物表達(dá)來(lái)定義的所有T細(xì)胞。T細(xì)胞可以是任何類型的T細(xì)胞，例如輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞或自然殺傷T細(xì)胞?？梢詫⑵渲兴械募?xì)胞表達(dá)一種β恒定區(qū)或一種γ恒定區(qū)的T細(xì)胞種群定義為單型。T細(xì)胞的單克隆種群來(lái)自于單一細(xì)胞的擴(kuò)增，并且因此在種群中的T細(xì)胞具有帶有相同的恒定區(qū)和相同的可變區(qū)的T細(xì)胞受體。單型的T細(xì)胞種群是全部表達(dá)相同的恒定區(qū)變體(TRBC1或TRBC2之一以及TRGC1或TRGC2之一)的T細(xì)胞的種群。完全單型的T細(xì)胞種群還可能是單克隆種群，但是對(duì)于一種或甚至兩種T細(xì)胞受體恒定區(qū)的單型的檢測(cè)不明確地證明單克隆性，盡管它是單克隆性的優(yōu)異替代。對(duì)單型的篩選比對(duì)單克隆性的篩選更便宜且更容易，但條件是相同或增強(qiáng)的診斷性、治療性和預(yù)言性的選擇。將單型種群定義為其中種群中的大部分T-細(xì)胞具有相同的TRBC類型(即，均為TRBC1或TRBC2，取決于使用的TRBC基因片段；相同的恒定區(qū))的種群，而將單克隆性定義為種群中的所有T-細(xì)胞具有相同的可變區(qū)序列。存在幾百萬(wàn)種可變區(qū)序列，但是僅存在兩種可能的TRBC類型。篩選兩種TRBC類型比篩選數(shù)百萬(wàn)的可變區(qū)更容易且更便宜得多。

特異性檢測(cè)的變體T細(xì)胞受體β或γ鏈恒定區(qū)可以是選自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的至少一種β和/或γ鏈恒定區(qū)。該方法可以包括檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種。該方法可以包括檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的兩種。該方法可以包括檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的三種。該方法可包括檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的全部。

特異性檢測(cè)的T細(xì)胞受體β恒定區(qū)的變體可以是TRBC1或TRBC2中的至少一種或兩者。如上所述，TRBC1和TRBC2是一對(duì)可替換的β鏈恒定區(qū)，并且T細(xì)胞將表達(dá)任一TRBC1或TRBC2，但不表達(dá)兩者。因此，在T細(xì)胞的種群中，可以通過檢測(cè)這些變體中的一種或兩種來(lái)確定表達(dá)TRBC1或TRBC2的細(xì)胞的百分比。

特異性檢測(cè)的T細(xì)胞受體γ恒定區(qū)的變體可以是TRGC1或TRGC2中的至少一種或兩者。如上所述，TRGC1和TRGC2是一對(duì)可替換的γ鏈恒定區(qū)，并且T細(xì)胞將表達(dá)任一TRGC1或TRGC2，但不表達(dá)兩者。因此，在T細(xì)胞的種群中，可以通過檢測(cè)這些變體中的一種或兩種來(lái)確定表達(dá)TRGC1或TRGC2的細(xì)胞的百分比。

該方法可以包括檢測(cè)一種或兩種β恒定鏈變體和/或一種或兩種γ恒定鏈變體。

優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)TRBC1和TRBC2，和/或TRGC1和TRGC2。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中測(cè)定細(xì)胞種群中的TRBC1與TRBC2和/或TRGC1與TRGC2的相對(duì)量。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法允許測(cè)定在特定的T細(xì)胞種群中表達(dá)特定的TCR恒定區(qū)的的細(xì)胞數(shù)目或相對(duì)細(xì)胞數(shù)目。

可以使用任何合適的方法檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2中的一種或多種。可以在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平中的一種或多種下檢測(cè)這些受體的恒定區(qū)的差異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在許多可以檢測(cè)T細(xì)胞受體恒定區(qū)的差異的方式，并且本文呈現(xiàn)的實(shí)例不旨在是詳盡的。

然后，可以使用PCR來(lái)檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種或多種的相對(duì)量。可以對(duì)提取的DNA或RNA、或?qū)φ麄€(gè)T細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行PCR。該方法可以包括使用適用于PCR反應(yīng)的一對(duì)寡核苷酸以特異性檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2。該方法可以包括同時(shí)地使用多于一對(duì)的適用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸以特異性檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的多于一種。使用PCR檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA的優(yōu)點(diǎn)是僅需要較小的細(xì)胞樣品，并且不存在提供合適的組織切片的需要。使用PCR檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是，且可以在非固體組織，如血液和骨髓抽吸物的樣品上進(jìn)行，以及在提取自固體或非固體組織樣品中的DNA或RNA上進(jìn)行。

可以在組織樣品、切片或細(xì)胞培養(yǎng)中的T細(xì)胞中原位檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA、RNA或蛋白質(zhì)。

可以通過原位雜交和免疫組織化學(xué)原位檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白質(zhì)，例如在組織切片中。這樣的方法可以使用能夠區(qū)分不同的β和γ鏈恒定區(qū)的抗體。可替換地，可以使用可以區(qū)分不同的β和γ鏈恒定區(qū)的標(biāo)記的DNA或RNA探針?？梢灾苯拥鼗蜷g接地標(biāo)記抗體或DNA或RNA探針。用于促進(jìn)分子(如寡核苷酸或抗體)的檢測(cè)的標(biāo)記可以包括任何已知的標(biāo)記，包括熒光、發(fā)光、光散射和/或比色標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括酶以及熒光和顯色部分，以及放射性核苷酸、底物、輔因子、抑制物、磁性顆粒等。如果標(biāo)記是酶，其可以是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各種蛋白酶和磷脂酶。其它標(biāo)記包括熒光團(tuán)或半抗原(hapten)，如地高辛(digoxygenin)或二硝基苯/二硝基苯酚。這種標(biāo)記的探針通常用于原位雜交方法。可以“通過肉眼”或使用數(shù)字病理學(xué)分析技術(shù)來(lái)探測(cè)抗體或標(biāo)記的DNA或RNA探針的結(jié)合。數(shù)字病理分析技術(shù)可用于評(píng)估用一種或多種特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記的組織樣品或切片，每種特異性檢測(cè)試劑特異性識(shí)別恒定區(qū)中的一種。例如，數(shù)字病理學(xué)分析技術(shù)可以計(jì)數(shù)用特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記的細(xì)胞的數(shù)量，并且可以計(jì)算表達(dá)特定的恒定區(qū)的T細(xì)胞的百分比。數(shù)字病理分析技術(shù)還可以處理圖像，例如染色的組織切片的圖像，以評(píng)估用特異性識(shí)別T細(xì)胞受體恒定區(qū)中的一種的特異性檢測(cè)試劑標(biāo)記的T細(xì)胞的分布。數(shù)字病理分析還可以，例如通過計(jì)數(shù)與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的點(diǎn)的數(shù)量(其中點(diǎn)表示陽(yáng)性染色)或通過分析染色強(qiáng)度，來(lái)確定單個(gè)細(xì)胞是否應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為對(duì)特定恒定區(qū)的檢測(cè)為陽(yáng)性。技術(shù)人員將理解，取決于用于檢測(cè)T細(xì)胞恒定區(qū)的方法，不同的數(shù)字病理分析方法將是合適的，并且上述實(shí)例不是詳盡的。

可以使用流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞中檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白質(zhì)。這樣的方法可以使用能夠區(qū)分不同的β和γ鏈恒定區(qū)的抗體，或者它們可以使用可以區(qū)分不同的β和γ鏈恒定區(qū)的標(biāo)記的DNA或RNA探針。

短語(yǔ)“特異性檢測(cè)試劑”在本文中用于指能夠在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上區(qū)分TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的試劑，并且包括，例如PCR引物、寡核苷酸探針和抗體。

T細(xì)胞的種群的蛋白質(zhì)組分析也可用于檢測(cè)T細(xì)胞種群中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2蛋白質(zhì)。

可以使用DNA或RNA測(cè)序技術(shù)，例如全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序(RNAseq)，檢測(cè)T細(xì)胞受體β或γ鏈恒定區(qū)(TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的一種)。

除了TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2之外，還可以特別通過免疫組織化學(xué)、原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其它標(biāo)記物的表達(dá)，例如但不限于CD2、CD3、CD5、CD4、CD7、CD8或CD30、CD56、顆粒酶、穿孔素、Mib-1、Ki-67、PD1、CD10、CXCL13和bcl6。這種其它的標(biāo)記物的檢測(cè)可以與TRBC1、TRBC2-]、TRGC1和/或TRGC2的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行。

通過原位雜交，免疫組織化學(xué)或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2 DNA或RNA或蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)檢測(cè)其他因素，如細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫表型，以及在原位雜交和免疫組織化學(xué)的情況下，表達(dá)特定恒定區(qū)的T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)分布模式。

在一個(gè)實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中為了原位雜交的目的，使用多于一至，優(yōu)選2種、3種、4種或更多個(gè)對(duì)每種恒定區(qū)唯一的不同的寡核苷酸。這具有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：首先其增加該方法的靈敏度，并且其次其增加信號(hào)的強(qiáng)度。

可以使用抗體、雙特異性抗體、擬抗體或它們的片段或變體來(lái)檢測(cè)變體T細(xì)胞受體β或γ鏈恒定區(qū)。確定T細(xì)胞種群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率的方法可以使用抗體、擬抗體或它們的片段。TRBC1/TRBC2和TRGC1/TRGC2在蛋白質(zhì)水平非常相似，但抗體可以區(qū)分它們的蛋白質(zhì)序列。除了或代替免疫組織化學(xué)技術(shù)中的寡核苷酸特異性檢測(cè)試劑，可以將抗體用作特異性檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑。

該方法可以包括測(cè)定在表達(dá)特異性T細(xì)胞受體β或γ鏈恒定區(qū)的特定種群中的T細(xì)胞的百分比?？梢栽赥細(xì)胞的種群中檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種或更多種的表達(dá)。可以測(cè)定表達(dá)所檢測(cè)的T細(xì)胞受體恒定區(qū)(TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2)的種群中的T細(xì)胞的百分比?？梢詸z測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的兩種或更多種的表達(dá)?？梢詸z測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的三種或更多種的表達(dá)?？梢詸z測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的全部四種的表達(dá)。優(yōu)選測(cè)定至少TRBC1和TRBC2、和/或TRGC1和TRGC2的表達(dá)。

該方法可以包括測(cè)定在T細(xì)胞種群中表達(dá)TRBC1的細(xì)胞與表達(dá)TRBC2的細(xì)胞的比率或者測(cè)定T細(xì)胞種群中表達(dá)TRGC1的細(xì)胞與表達(dá)TRGC2的細(xì)胞的比率或兩者。

TRBC1與TRBC2的比率或TRGC1與TRGC2的比率可以通過特異性檢測(cè)來(lái)自一對(duì)的恒定區(qū)中的一種并且比較其中檢測(cè)到標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)目與其中未檢測(cè)到標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)目來(lái)確定。可替代地，可以檢測(cè)TRBC1和TRBC2兩者，和/或可以檢測(cè)TRGC1和TRGC2兩者，并且可以測(cè)定TRBC1與TRBC2的比率或TRGC1與TRGC2的比率或兩者。

T細(xì)胞種群中的單型程度的測(cè)定可以用作提供關(guān)于T細(xì)胞種群是炎性還是腫瘤性T細(xì)胞種群的信息的工具。與對(duì)于該組織類型或該個(gè)體中的T細(xì)胞種群所預(yù)期的相比，具有高單型程度的T細(xì)胞種群可以診斷為其是腫瘤性T細(xì)胞種群。這可能表明需要使用其他指標(biāo)的進(jìn)一步研究以確定是否存在T細(xì)胞贅生物，或者其可以單獨(dú)使用以明確地診斷T細(xì)胞贅生物。

可以將T細(xì)胞的種群(T細(xì)胞的測(cè)試種群)中TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的百分比或者TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率與T細(xì)胞的參考種群中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的百分比或者TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率比較。T細(xì)胞的參考種群可以是已知為炎性T細(xì)胞種群的T細(xì)胞種群。T細(xì)胞的參考種群可以是已知為腫瘤性T細(xì)胞種群的T細(xì)胞種群。T細(xì)胞的參考種群可以是已知為非腫瘤性或非炎性T細(xì)胞種群的T細(xì)胞種群。T細(xì)胞的參考種群可以是來(lái)自與測(cè)試種群相同的受試者或者來(lái)自與測(cè)試種群不同的受試者的T細(xì)胞種群。T細(xì)胞的參考種群可以來(lái)自相似的組織類型或類似的受試者。T細(xì)胞的參考種群還可以包括在體外生長(zhǎng)的永生化T細(xì)胞淋巴瘤系。

與T細(xì)胞的參考種群相比，在T細(xì)胞的測(cè)試種群中的單型的較高水平可以表明T細(xì)胞種群是腫瘤性T細(xì)胞種群而不是炎性T細(xì)胞種群。由于應(yīng)答于抗原的T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，可以在T細(xì)胞的炎性種群中改變TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率。因此，可以單獨(dú)使用關(guān)于T細(xì)胞種群中的TRBC1:TRBC2和/或TRGC1:TRGC2的比率的信息或者與關(guān)于細(xì)胞的其他信息組合，以確定T細(xì)胞種群是炎性T細(xì)胞種群還是腫瘤性T細(xì)胞種群。例如，其他信息可以包括TRBC1(或TRBC2)細(xì)胞是否出現(xiàn)非典型/多形性(例如具有較大的或異常的細(xì)胞核或有絲分裂)或T細(xì)胞的位置(例如在皮膚活檢的表皮或真皮中)，或者種群中多少百分比的T細(xì)胞染色有其他標(biāo)記物(包括但不限于CD2、CD3、CD5、CD4、CD7、CD8或CD30、CD56、顆粒酶、穿孔素、Mib-1、Ki-67、PD1、CD10、CXCL13和bcl6)。

TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率可以是任何比率，并且可以取決于T細(xì)胞種群的具體情況。T細(xì)胞的腫瘤性種群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率可以比炎性T細(xì)胞種群中的TRBC1:TRBC2或TRGC1:TRGC2的比率更遠(yuǎn)離1:1。炎性和腫瘤性T細(xì)胞種群兩者可以具有不為1:1的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。

T細(xì)胞的多型種群可以具有比T細(xì)胞的單型種群更接近1:1的比率。看起來(lái)是多型的T細(xì)胞種群可以是炎性T細(xì)胞種群。

T細(xì)胞的單型種群可以具有比T細(xì)胞的多型種群更遠(yuǎn)離1:1的比率?？雌饋?lái)是單型的T細(xì)胞種群可以是腫瘤性T細(xì)胞種群。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，如果樣品中多于約60％、或多于約70％、或多于約80％、或多于約85％、或多于約90％的T細(xì)胞表達(dá)特定的β或γ恒定鏈，即TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2，那么可以將該種群定義為單型的并且可能是克隆的。如果種群被定義為單型的，并且因此可能是克隆的，其還可以被定義為腫瘤性的。在一個(gè)實(shí)施方式中，如果T細(xì)胞的種群具有超過80％的其細(xì)胞表達(dá)特定的β或γTCR恒定鏈區(qū)，則該種群可以被認(rèn)為是腫瘤性的。

T細(xì)胞的種群可以是T細(xì)胞的組。T細(xì)胞的種群可以是在樣品中或者分離自來(lái)自受試者的樣品。T細(xì)胞的種群可以是在樣品中，或者分離自血液或骨髓的特定組織的樣品。T細(xì)胞的種群可以是在特定組織中的一些或全部的T細(xì)胞。T細(xì)胞的種群可以是取自特定組織和/或特定受試者的樣品中的一些或全部的T細(xì)胞。

受試者可以是人類或非人類的哺乳動(dòng)物。非人類的哺乳動(dòng)物可以包括小鼠(mouse)、大鼠(rat)、貓、狗、綿羊、山羊、奶牛、馬、靈長(zhǎng)類、羊駝或美洲駝中的一種或更多種。

樣品可以是來(lái)自受試者的，或者血液樣品、淋巴結(jié)吸出物或骨髓吸出試樣的全部的或部分的組織或液體或懸浮液。樣品可以是一片組織。樣品可以是來(lái)自活檢的組織。樣品可以是部分的或全部的組織、淋巴結(jié)或者部分或全部的腫塊、腫脹或腫瘤。樣品可以是來(lái)自看起來(lái)宏觀上正常的組織或部分的組織。

組織可以是任何的組織樣品，或血液樣品或骨髓樣品或者它們的部分。組織可以是部分的或全部的淋巴結(jié)。組織可以是，例如，皮膚、胃腸道、骨髓、肺臟、肝臟、脾臟、脂肪、腎臟或血液。由于淋巴瘤、白血病和炎性T細(xì)胞浸潤(rùn)可以出現(xiàn)在身體內(nèi)的任何地方，因此組織可以是任何組織并且樣品可以是來(lái)自任何組織的固體或液體樣品。

可以在組織樣品(如以上描述的)內(nèi)的T細(xì)胞的種群中檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2。可以在測(cè)試前由組織分離的T細(xì)胞的種群中檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2。可以在從樣品或T細(xì)胞種群中提取的蛋白、DNA或RNA樣品中檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2蛋白、DNA或RNA。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了確定T細(xì)胞的種群是腫瘤性T細(xì)胞種群還是炎性T細(xì)胞種群的方法，其中，該方法包括，使用能夠量化或另外表明TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的表達(dá)并且可以用于提供表達(dá)具有TRBC1、TRBC2、TRGC1和/或TRGC2的T細(xì)胞受體的T細(xì)胞的百分比的指標(biāo)的任何方法，測(cè)定T細(xì)胞種群中TRBC1:TRBC2的比率和/或TRGC1:TRGC2的比率。

優(yōu)選地，如果在所研究的T細(xì)胞種群中多于60％、70％、80％、85％、90％的T細(xì)胞表達(dá)TRBC1，則樣品可以被定義為腫瘤性的。優(yōu)選地，如果在所研究的T細(xì)胞種群中多于60％、70％、80％、85％、90％或更多表達(dá)TRBC2，則樣品可以被定義為腫瘤性的。優(yōu)選地，如果在所研究的T細(xì)胞種群中多于60％、70％、80％、85％、90％或更多表達(dá)TRGC1，則樣品可以被定義為腫瘤性的。優(yōu)選地，如果在所研究的T細(xì)胞種群中大于60％、70％、80％、85％、90％或更多表達(dá)TRGC2，則樣品可以被定義為腫瘤性的。優(yōu)選地，如果在所研究的T細(xì)胞種群中大于60％、70％、80％、85％、90％的T細(xì)胞表達(dá)相同的TCR恒定區(qū)，則樣品可以被定義為腫瘤性的。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了適合用于PCR反應(yīng)以特異性檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的寡核苷酸對(duì)。該對(duì)寡核苷酸可以用于測(cè)定T細(xì)胞種群中的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。該寡核苷酸可以適合用于PCR反應(yīng)以確定T細(xì)胞種群中的TRBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。

該對(duì)寡核苷酸可以特異性地檢測(cè)TRBC1而非TRBC2。該對(duì)寡核苷酸可以特異性結(jié)合并且擴(kuò)增TRBC1而非TRBC2的部分或全部。該對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以結(jié)合在TRBC1而非TRBC2內(nèi)。該對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以結(jié)合在TRBC1的3'非翻譯區(qū)內(nèi)，例如可以結(jié)合在SEQ ID NO：1中所列的序列內(nèi)。特異性結(jié)合并且擴(kuò)增TRBC1而非TRBC2的部分或全部的寡核苷酸對(duì)可以具有在SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中所列的序列。

該對(duì)寡核苷酸可以特異性地檢測(cè)TRBC2而非TRBC1。該對(duì)寡核苷酸可以特異性地結(jié)合并且擴(kuò)增TRBC2而非TRBC1的部分或全部。該對(duì)寡核苷酸可以結(jié)合在TRBC2而非TRBC1內(nèi)。該對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)或兩個(gè)可以結(jié)合在TRBC2的3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)內(nèi)，例如可以結(jié)合在SEQ ID NO：2所列的序列內(nèi)。特異性地結(jié)合并且擴(kuò)增TRBC2而非TRBC1的部分或全部的該對(duì)寡核苷酸可以具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所列的序列。由于TRBC1和TRBC2的3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3'UTR)彼此不同，可以將寡核苷酸設(shè)計(jì)為結(jié)合在3'UTR內(nèi)以區(qū)分TRBC1和TRBC2。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了能夠特異性地結(jié)合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的僅一種的寡核苷酸或寡核苷酸的組?？梢詫⒐押塑账嶂苯拥鼗蜷g接地標(biāo)記，并且通過顯色、熒光、放射性同位素或其他的方式檢測(cè)。該寡核苷酸可以適合用于原位雜交。本發(fā)明的寡核苷酸可以結(jié)合至彼此不同的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的DNA或RNA序列的任何部分。在本申請(qǐng)中示出的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的序列可以因此用于設(shè)計(jì)任何長(zhǎng)度的寡核苷酸，條件是它們特異性地結(jié)合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的僅一種的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少2種、或至少3種、或至少4種或更多種的寡核苷酸用于檢測(cè)TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的每一種。

該寡核苷酸可以具有選自包括SEQ ID NO.9、10、11或12的組中的任一種的序列，或者與SEQ ID NO.9、10、11或12具有80％、90％、95％或99％的一致性的序列，或者任何這些序列的互補(bǔ)。

寡核苷酸探針可以包括一種或多種、優(yōu)選地至少2種、3種或4種的結(jié)合至具有序列ID No:15(部分的TRBC1)或序列ID No:16(部分的TRBC2)的序列的探針。

為了檢測(cè)TRBC1，可以使用Seq ID Nos:17至22的序列的一種或多種的寡核苷酸探針。優(yōu)選地，使用17和18。優(yōu)選地，使用Seq ID Nos:19至22中的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種或者全部。

為了檢測(cè)TRBC2，可以使用Seq ID Nos:23至29的序列的一種或多種的寡核苷酸探針。優(yōu)選地，使用具有Seq ID Nos:23至25中的一種或多種、兩種或更多種或全部的序列的寡核苷酸探針?？商娲?，使用具有Seq ID Nos:26至29中的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種或全部的序列的寡核苷酸探針?？商娲?，使用具有Seq ID Nos:23至29中的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種或全部的序列的寡核苷酸探針。

優(yōu)選地將寡核苷酸探針直接地或間接地標(biāo)記，并且可以通過肉眼或數(shù)字地，例如通過人眼或數(shù)字地在顯微鏡下檢測(cè)結(jié)合，如通過使用流式細(xì)胞術(shù)或者其他數(shù)字檢測(cè)方式。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包含特異性地結(jié)合至TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的僅一種的寡核苷酸或抗體的診斷試劑。診斷試劑也可以包含可檢測(cè)的標(biāo)記，例如，有色的、熒光的、放射性的、特異性結(jié)合的、特定尺寸的試劑。

TRBC1和TRBC2核苷酸序列在圖7中以較大字體示出的序列處不同。結(jié)合至該序列的部分或全部或包含該序列的寡核苷酸、寡核苷酸的組、特異性的檢測(cè)試劑或試劑可以用于特異性地檢測(cè)僅TRBC1或者僅TRBC2，而非兩者。

TRGC1和TRGC2核苷酸序列在圖8中以較大字體示出的序列處不同。與TRGC1相比，TRGC2具有一個(gè)或多個(gè)額外的外顯子。結(jié)合至該額外的序列的部分或全部或者包含該序列的寡核苷酸、寡核苷酸的組、探針或試劑可以用于特異性地檢測(cè)僅TRGC1或者僅TRGC2，而非兩者。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸的組確定T細(xì)胞的種群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率的用途。

該寡核苷酸與互補(bǔ)于特異性結(jié)合至其的序列可以具有大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％或100％的序列一致性。

寡核苷酸的組可以包含一種或多種的在本文中描述為具有Seq ID Nos:9至12和17至29的序列的寡核苷酸。

該寡核苷酸必須足夠長(zhǎng)以特異性地結(jié)合至它們的靶向DNA或RNA序列。該寡核苷酸可以為5個(gè)至50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、10個(gè)至40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、15個(gè)至30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度或者20個(gè)至25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。

對(duì)于特異性結(jié)合，可以使用50個(gè)至100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、或100個(gè)至1000個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、或200個(gè)至800個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度、或500個(gè)至700個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度的較長(zhǎng)的寡核苷酸。

優(yōu)選地，將寡核苷酸直接地或間接地標(biāo)記以使得結(jié)合可視化。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合至選自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種多肽的一種或多種抗體、擬抗體、雙特異性抗體或它們的片段?？贵w可以結(jié)合至TRBC1或TRBC2而非兩者?？贵w可以結(jié)合至TRGC1或TRGC2而非兩者?？贵w可以用于在蛋白水平區(qū)分這些蛋白中的每一種的表達(dá)水平?？贵w可以用于量化替代的恒定區(qū)的對(duì)的表達(dá)，從而確定T細(xì)胞的種群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率?？梢詫⒖贵w或抗體片段或擬抗體修改或標(biāo)記。抗體可以是多克隆抗體?？贵w可以是單克隆抗體。抗體可以適合用于免疫組織化學(xué)。本發(fā)明的抗體可以結(jié)合至彼此不同的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中的一種的區(qū)域。通過比較TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的多肽序列并且確定差異區(qū)域，可以確定用于本發(fā)明的抗體的TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2上的可能的結(jié)合位點(diǎn)。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或抗體在研究T細(xì)胞單型中的用途。

本發(fā)明的方法可以是體外方法。本發(fā)明的方法可以在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以在固體或液體的細(xì)胞學(xué)樣品或組織吸出物上進(jìn)行。本發(fā)明的方法可以是體內(nèi)方法。

可以將本發(fā)明的寡核苷酸直接地連接至標(biāo)記或者經(jīng)由一些層連接。例如，可以使用將信號(hào)放大的支鏈DNA聚合物的層，將寡核苷酸特異性檢測(cè)試劑連接至熒光的、顯色的或其他形式的標(biāo)記。該標(biāo)記可以是熒光的、顯色的、放射性的或其他標(biāo)記。

本發(fā)明進(jìn)一步地提供了寡核苷酸、肽或抗體特異性的檢測(cè)試劑確定T細(xì)胞的種群中TRBC1:TRBC2的比率或者TRGC1:TRGC2的比率的用途。

本發(fā)明進(jìn)一步地提供了用于藥物的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或寡核苷酸的組、根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的對(duì)或根據(jù)本發(fā)明的抗體。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或抗體可以選擇性地結(jié)合至表達(dá)T細(xì)胞受體恒定區(qū)TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2中選擇的一種的T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或抗體或其他的治療模式可以用于治療表達(dá)選自TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2的T細(xì)胞受體恒定區(qū)的目標(biāo)T細(xì)胞。由于可以選擇性地抑制或破壞表達(dá)特定的一種T細(xì)胞受體恒定區(qū)的T細(xì)胞，同時(shí)使表達(dá)其他T細(xì)胞恒定區(qū)的T細(xì)胞不受影響，這可以有用于治療或預(yù)防淋巴瘤或移植排斥、自身免疫性疾病或炎性疾病。這限制了治療的免疫抑制的量。一旦確定了表達(dá)特定的T細(xì)胞受體恒定區(qū)的T細(xì)胞，通過本發(fā)明的方法或者通過其他的方法，可以通過包含本發(fā)明的特異性檢測(cè)試劑的藥劑選擇性地靶向作為不期望的克隆擴(kuò)增的結(jié)果，表達(dá)已經(jīng)確定的恒定區(qū)的T細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步地提供了包含一種或更多種的本發(fā)明的寡核苷酸、肽或抗體探針的試劑盒，以及使用該探針和/或試劑盒以確定T-細(xì)胞種群中或由其提取的物質(zhì)中的TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種或多種的表達(dá)的水平的說明。

試劑盒可以進(jìn)一步地包含陰性對(duì)照的寡核苷酸或探針。該試劑盒可以旨在與原位雜交技術(shù)或PCR技術(shù)一起使用。其可以與試驗(yàn)或者與其他的來(lái)自任何制造商的專有的檢測(cè)試劑一起使用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷方法，包括使用本發(fā)明的寡核苷酸、肽或抗體探針以獲得T細(xì)胞種群的單型或克隆性的標(biāo)志。該方法可以包括測(cè)定T細(xì)胞種群中的RBC1:TRBC2的比率或TRGC1:TRGC2的比率。該方法可以包括使用探針以將T細(xì)胞種群中表達(dá)TRBC1、TRBC2、TRGC1、TRGC2中的一種或多種的T細(xì)胞可視化。該方法可以包括使用寡核苷酸探針或抗體探針在樣品上進(jìn)行原位雜交或免疫組織化學(xué)。該方法可以包括使用TRBC1、TRBC2、TRGC1或TRGC2特異性的寡核苷酸探針在樣品上進(jìn)行PCR。

本發(fā)明進(jìn)一步地提供了用于檢測(cè)細(xì)胞T-細(xì)胞單型的方法，該方法包括：

I)由受試者獲得含有T細(xì)胞的樣品；

II)使用直接或間接標(biāo)記的寡核苷酸以確定在I中獲得的T細(xì)胞中的TRBC1和TRBC2，和/或TRGC1和TRGC2的表達(dá)水平；

III)檢測(cè)與寡核苷酸探針雜交有關(guān)的信號(hào)；

IV)如果多于約60％、70％、80％、85％或90％的T細(xì)胞表達(dá)相同的恒定區(qū)，則得出存在表明克隆性的T細(xì)胞單型的結(jié)論。

該方法可以進(jìn)一步地包括如果觀察到表明克隆性的T細(xì)胞單型，則得出樣品包含腫瘤性T細(xì)胞的結(jié)論。優(yōu)選地，為了得出T細(xì)胞單型為克隆性的標(biāo)志的結(jié)論，至少80％或更多的T細(xì)胞必須表達(dá)相同的T細(xì)胞受體恒定區(qū)。

可以通過原位雜交確定樣品中的一種或多種寡核苷酸與細(xì)胞的結(jié)合。

本發(fā)明的方法可以因此用于診斷贅生物。其也可以用于通過觀察T細(xì)胞TCR恒定區(qū)表達(dá)模式隨時(shí)間的變化來(lái)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和/或?qū)χ委煹姆磻?yīng)和/或緩解狀況。其也可以用于監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答用于指示它們是否是單克隆的。這些免疫應(yīng)答可以是自然的或者由多種種類的治療操控的，例如，在用如易普利姆瑪(ipilimumab)的藥物治療或不治療下，T細(xì)胞對(duì)腫瘤的應(yīng)答；在骨髓移植之后骨髓及其他器官中的T細(xì)胞應(yīng)答；在治療或不治療下在自身免疫病癥中的T細(xì)胞應(yīng)答，以及在傳染性疾病，如肺結(jié)核、麻風(fēng)病和病毒感染中的T細(xì)胞應(yīng)答。

在本發(fā)明的另一方面，可以特異性地靶向表達(dá)選自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2的T細(xì)胞恒定區(qū)的T細(xì)胞，以增加或調(diào)節(jié)那些T-細(xì)胞的行為或功能用于治療性或?qū)嶒?yàn)性的(研究)目的。用于特異性靶向的方法可以包括特異性寡核苷酸、特異性抗體、雙特異性抗體、擬抗體、抗體片段或它們的變體或者任何其他的特異性檢測(cè)試劑。

本發(fā)明可以進(jìn)一步地提供治療贅生性病癥的方法，例如通過使用探針以靶向細(xì)胞并且遞送毒性劑至該細(xì)胞。可替換地，本發(fā)明可以用于標(biāo)記腫瘤性的種群中的細(xì)胞，其隨后可以通過，例如使用FACS，從該種群中去除，并且隨后可以將不含贅生性細(xì)胞的細(xì)胞種群送回至受試者。通過以這種方式處理骨髓樣品，其可以用于治療淋巴瘤或白血病。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以將本發(fā)明的任何一個(gè)實(shí)施方式和/或方面和/或權(quán)利要求的優(yōu)選特征應(yīng)用至本發(fā)明的所有其它的實(shí)施方式和/或方面和/或權(quán)利要求。

附圖說明

現(xiàn)在以下是僅通過實(shí)例的方式的參照附圖的本發(fā)明的詳細(xì)描述，在附圖中；

圖1-示出了包含TRBC1和TRBC2之間的序列差異的拼接后的mRNA的區(qū)域。上一個(gè)外顯子的末端以粗體示出，3’UTR以普通字體示出，并且聚腺苷酸化位點(diǎn)(AATAA)是下劃線的。其中反向引物(示于圖2中)結(jié)合的位點(diǎn)以較大字體、下劃線和粗體突出。

圖2–示出了擴(kuò)增TRBC1和TRBC2的引物。原則上，許多其他的含有3’未翻譯RNA的區(qū)域可以用作為用于引物或特異性檢測(cè)試劑結(jié)合的位點(diǎn)。例如，可以使用所有的或一些的3’UTR，或者3’UTR可以包含在結(jié)合TRBC1和TRBC2的較大區(qū)域的特異性檢測(cè)試劑內(nèi)。在該實(shí)例中，反向引物結(jié)合在圖1中以較大字體示出的位點(diǎn)處，而正向引物結(jié)合在編碼區(qū)的上游。

圖3-示出了來(lái)自兩種多克隆T細(xì)胞種群(C12和C14)和一種克隆種群(38)的TRBC1和TRBC2PCR的結(jié)果，示出后者僅表達(dá)TRBC2，

圖4-示出了對(duì)于來(lái)自從反應(yīng)性組織和T細(xì)胞淋巴瘤組織，*T細(xì)胞淋巴瘤樣品的石蠟包埋的切片分離的RNA的樣品的TRBC1(CB1)和TRBC2(CB2)的定量rtPCR的結(jié)果。虛線以上表示P<0.05，

圖5-示出了TRGC1和TRGC2之間的蛋白差異的區(qū)域。由TRGC2額外的外顯子編碼的氨基酸是下劃線的。

圖6示出了TRBC1(SEQ ID NO：5)的蛋白質(zhì)序列和TRBC2(SEQ ID NO：6)的蛋白質(zhì)序列

圖7示出了TRBC1(SEQ ID NO：3)和TRBC2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列。其中圖2的寡核苷酸結(jié)合的位點(diǎn)是下劃線的。其中TRBC1和TRBC2在序列上不同的主要區(qū)域以較大字體標(biāo)明。Tga(TRBC1)或tag(TRBC2)終止密碼子和主要的aataaa聚腺苷酸化信號(hào)以斜體和下劃線標(biāo)明。

圖8示出了TRGC1和TRGC2的核苷酸序列。其中TRBC1和TRBC2在序列上不同的區(qū)域以較大字體標(biāo)明。相比于TRGC1，TRGC2具有額外的外顯子。taa終止密碼子和主要的aataaa聚腺苷酸化信號(hào)以下劃線標(biāo)明。

圖9A和9B顯示了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸探針在非贅生性(良性)的淋巴結(jié)樣品上示出了陽(yáng)性染色。圖9A示出了使用指向TRBC1的探針的陽(yáng)性染色，并且圖9B示出了使用指向TRBC2的探針的陽(yáng)性染色。

圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸探針可以區(qū)分克隆細(xì)胞系，更具體地在唯一地表達(dá)TRBC1的Jurkat細(xì)胞中。

圖11進(jìn)一步顯示了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸探針可以區(qū)分克隆細(xì)胞系，更具體地，唯一地表達(dá)TRBC2的CEM細(xì)胞中的TRBC表達(dá)，。在該圖中，使用Seq ID nos：26至29的探針檢測(cè)TRBC2。

圖12顯示了使用原位雜交，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸探針可以檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞。

圖13進(jìn)一步顯示了使用原位雜交，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸探針可以檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞。在該圖中，使用Seq ID nos：19至22的探針檢測(cè)TRBC1，并且使用Seq ID nos：26至29的探針檢測(cè)TRBC2。

圖14和15顯示了根據(jù)本發(fā)明的TRBC1和TRBC2探針兩者均結(jié)合至非贅生性，良性的T細(xì)胞種群。

圖16詳述了在本發(fā)明中使用的多種寡核苷酸探針的序列。

圖17詳述了具有Seq ID Nos：26至29的序列的TRBC2寡核苷酸位于反向和互補(bǔ)的靶序列中的何處。

圖18詳述了具有Seq ID Nos：19至22的序列的TRBC1寡核苷酸位于反向和互補(bǔ)的靶序列中的何處。

T細(xì)胞受體的總體結(jié)構(gòu)確定了其對(duì)于結(jié)合至由MHC或MHC樣分子表現(xiàn)的抗原的特異性。T細(xì)胞可以表達(dá)α-βT細(xì)胞受體或者γ-δT細(xì)胞受體。β鏈包含兩個(gè)可替換的但非常相似的，被稱為TRBC1和TRBC2的恒定區(qū)中的一種。類似地，γ鏈包含兩個(gè)非常相似的被稱為TRGC1和TRGC2的恒定區(qū)中的一種。在T細(xì)胞種群中，一些T細(xì)胞具有帶有這些恒定區(qū)中的每一種的一種形式的受體，并且一些T細(xì)胞具有帶有這些恒定區(qū)中的每一種的其他形式的受體。因此，表達(dá)α-β的T細(xì)胞將表達(dá)TRBC1或TRBC2中的一種作為β鏈的恒定區(qū)。類似地，表達(dá)γ-δ的T細(xì)胞將表達(dá)TRGC1或TRGC2中的一種作為γ鏈的恒定區(qū)。

這些恒定區(qū)中的每一種的差異表達(dá)可以用作幫助確定T細(xì)胞單型和克隆性的方法，并且因此將炎性的(也被稱為反應(yīng)性或良性的)T細(xì)胞浸潤(rùn)與贅生性的(也被稱為惡性或淋巴瘤或白血病的)T細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)分。

人類TRBC1和TRBC2的蛋白質(zhì)序列因僅極少的氨基酸不同，使得它們很難區(qū)分。RNA序列僅在編碼區(qū)內(nèi)略微不同，然而在本發(fā)明中，使用在3’非翻譯區(qū)中的差異來(lái)將TRBC1和TRBC2區(qū)分。在圖1中示出了TRBC1和TRBC2共用等位基因的3’非翻譯區(qū)的mRNA序列。該序列是來(lái)自于專業(yè)的IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)，但是應(yīng)注意的是，在一些出版物和序列提交中，作者已經(jīng)反向參考了序列名稱。在圖1中示出了所使用的TRBC1和TRBC2，其中突出的序列表示可以用作為研究表達(dá)T細(xì)胞種群的TRBC1和TRBC2的方式的差異。

TRGC1和TRGC2等位基因的3’UTR是相同的，但是在編碼區(qū)存在差異，其一個(gè)實(shí)例示出于圖5中。相比于TRGC1等位基因，TRCG2等位基因全部都具有一個(gè)或兩個(gè)額外的外顯子。可以使用在TRGC1和TRGC2的氨基酸序列或mRNA序列中的突出的差異把它們區(qū)分開。

使用PCR以區(qū)分T細(xì)胞受體恒定區(qū)

設(shè)計(jì)了可以用于特異性地?cái)U(kuò)增在TRBC1和TRBC2之間不同的特有的3’非翻譯區(qū)的部分的PCR引物(圖2)。正向引物結(jié)合在TRBC1或TRBC2的編碼區(qū)內(nèi)，并且反向引物在圖1中的較大字體示出的位置處結(jié)合在3’UTR中。cDNA產(chǎn)生自分離自組織切片(包括石蠟包埋的切片、新鮮切片或冷凍切片)的或者從培養(yǎng)物中分離的細(xì)胞的RNA。證實(shí)了使用其中反向引物結(jié)合在3’非翻譯區(qū)內(nèi)且正向引物結(jié)合在上游的引物，，可以使用來(lái)自生長(zhǎng)于培養(yǎng)物，包括克隆和多克隆T細(xì)胞種群中的細(xì)胞的rtPCR區(qū)分TRBC1和TRBC2(圖3)。

定量rtPCR用于比較分離自反應(yīng)性或贅生性的甲醛固定石蠟包埋的組織的RNA中的TRBC1和TRBC2比率。由于反應(yīng)性組織可以包含抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)增，在所有的樣品中存在TRBC1和TRBC2的差異表達(dá)。然而，四個(gè)樣品示出了顯著地(P<0.05)不同于反應(yīng)性樣品的TRBC1/TRBC2比率(圖4)。所有這些均分離自主要含有T細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，TRBC1和TRBC2表達(dá)的比率的分析可以用于測(cè)試培養(yǎng)物或組織中的T細(xì)胞種群，以檢驗(yàn)它們的相對(duì)單型和克隆性。

已經(jīng)將基于PCR的方法用作驗(yàn)證，但是可替換地，原位RNA雜交或免疫組織化學(xué)的/免疫細(xì)胞化學(xué)的方法可以用于分析該比率，因?yàn)槠湓试S共同產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的、形態(tài)學(xué)的和/或免疫表型的數(shù)據(jù)并且在不同細(xì)胞亞群(例如，CD4+或CD8+細(xì)胞，或者在不同組織部位中的細(xì)胞，例如，在皮膚活檢中的真皮細(xì)胞或表皮細(xì)胞)中檢測(cè)TRBC1或TRBC2，這可以增強(qiáng)從惡性的或淋巴瘤的或贅生性T細(xì)胞種群中進(jìn)一步地區(qū)分反應(yīng)性的(或良性或炎性)的T細(xì)胞種群的能力。

最后，盡管TRBC1和TRBC2的蛋白質(zhì)序列是相似的，但是可以產(chǎn)生特異性地結(jié)合至選自TRBC1、TRBC2、TRGC1和TRGC2中的一種多肽的單克隆抗體，其可以從TRBC2中區(qū)分TRBC1以及從TRGC2中區(qū)分TRGC1，潛在性地允許在蛋白水平下確定差異表達(dá)水平。

3’未翻譯RNA區(qū)在RNA序列上含有差異，其可以用于檢驗(yàn)表達(dá)的差異水平。原位或基于PCR的RNA檢測(cè)可以基于TRBC1和TRBC2之間的序列差異的任何區(qū)域的表達(dá)。

由于大多數(shù)的贅生性人類T細(xì)胞浸潤(rùn)(例如淋巴瘤)源自α-βTCR-表達(dá)T細(xì)胞，初步研究已經(jīng)使用了TRBC1和TRBC2，但存在罕見的贅生性γ-δT細(xì)胞浸潤(rùn)(例如淋巴瘤)。圖5和8示出了在蛋白或RNA水平是相似的差異表達(dá)分析的原因的TRGC1和TRGC2的區(qū)域。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明了T細(xì)胞受體恒定區(qū)基因的表達(dá)的比率可以用于確定T細(xì)胞種群是反應(yīng)性的/炎性的還是贅生性的。使用TRBC1和TRBC2的3’非翻譯區(qū)解決了編碼基因序列相似的問題，并且使用檢測(cè)3’非翻譯區(qū)的方法將因此特別有用于特異性地檢測(cè)TRBC1和TRBC2表達(dá)的水平。

RT-PCR方法

根據(jù)制造商的說明使用RNeasy FFPE試劑盒(QIAGEN 73504)和III第一鏈合成系統(tǒng)(Life Technologies 18080-051)進(jìn)行自甲醛固定的石蠟包埋組織的RNA提取和cDNA合成。設(shè)計(jì)了以下引物組

TRBC1

正向ACCCTGTATGCTGTGCTGGT(SEQ ID NO：9)；

反向GGGATGCAGAGAGGTGAGAG(SEQ ID NO：10)

TRBC2

正向ACCTTGTATGCCGTGCTGGT(SEQ ID NO：11)；

反向CTGGGATGGTTTTGGAGCTA(SEQ ID NO：12)

肌動(dòng)蛋白

正向GGACTTCGAGCAAGAGATGG(SEQ ID NO：30)；

反向AGCACTGTGTTGGCGTACAG(SEQ ID NO：31)

使用Power Green PCR Master Mix(4367659)在7500快速熱循環(huán)器(Fast Thermal Cycler)(Applied Biosystems)中進(jìn)行反應(yīng)。通過添加25μl的Green PCR Master Mix、300nM的引物組、10μl的cDNA和H2O(最高至50μl)制備實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)混合物。RT-PCR條件如下：酶活化(保持)95℃持續(xù)10min，40次循環(huán)的95℃持續(xù)15秒以及60℃持續(xù)1分鐘。

使用原位雜交以區(qū)分T細(xì)胞受體恒定區(qū)并診斷贅生性病癥

實(shí)施例1-RNAScope驗(yàn)證T細(xì)胞中的TRBC1和TRBC2表達(dá)水平，可以使用RNAScope確定

為了證實(shí)當(dāng)將活檢樣品放于玻片上時(shí)保留了RNA，在載玻片上的活檢樣品上進(jìn)行使用針對(duì)具有低表達(dá)水平的RNA轉(zhuǎn)錄物，例如PPIB的RNAScope探針的體外雜交實(shí)驗(yàn)。所得結(jié)果顯示在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中RNA保存良好。

下一步是使用RNAScope(Minca EC et al.J Cutan Pathol.2015Feb；42(2):82-9)以及用于TRBC1和TRBC2的探針確定是否存在信號(hào)。當(dāng)將對(duì)TRBC1和TRBC2特異性的標(biāo)記的探針應(yīng)用至非贅生性(良性)淋巴結(jié)組織樣品時(shí)，在所有的玻片上看到信號(hào)(圖9)。在圖9中的染色是其中T細(xì)胞表達(dá)TRBC1和TRBC2表達(dá)的混合物的正常淋巴結(jié)的表示。

為了顯示可以單獨(dú)地檢測(cè)TRBC1/TRBC2表達(dá)，用相同的對(duì)TRBC1或TRBC2特異性的標(biāo)記的探針將僅表達(dá)TRBC1(Jurkat細(xì)胞)或TRBC2(CEM細(xì)胞)的克隆細(xì)胞系染色。結(jié)果示出于圖10和11中，由此清楚的是，當(dāng)T細(xì)胞是克隆種群，如在這種情況下示出的細(xì)胞系的一部分時(shí)，它們是TRBC1或TRBC2的單型。在該組織學(xué)研究中觀察到的結(jié)果由RT-PCR分析支持。

當(dāng)計(jì)數(shù)用TRBC1和TRBC2染色的克隆細(xì)胞系中的細(xì)胞的數(shù)目時(shí)，觀察到以下結(jié)果：

單個(gè)的細(xì)胞系數(shù)據(jù)(陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))：

CEM(PCR限制的TRBC2)

TRBC1 0.17(0.04-0.53)％

TRBC2 95.56％(94.48–96.44)

MOLT-4(PCR限制的TRBC2)

TRBC1 0.06(0.00–0.37)％

TRBC2 97.06(96.14–97.77)％

RPMI8402(PCR限制的TRBC1)

TRBC1 86.00(84.29–87.55)％

TRBC2 22.00(20.12–24.00)％

Jurkat(PCR限制的TRBC1)

TRBC1 90.72(89.26–92.00)％

TRBC2 3.17(2.43–4.12)％

由3個(gè)觀測(cè)者對(duì)所有的細(xì)胞系記數(shù)，對(duì)于TRBC1每人記數(shù)600個(gè)細(xì)胞，對(duì)于TRBC2每人記數(shù)600個(gè)細(xì)胞，意味著每個(gè)細(xì)胞系總共記數(shù)1800個(gè)細(xì)胞。對(duì)于所有記數(shù)(所有細(xì)胞系和探針組一起)，由任何一對(duì)觀察者獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性為0.99至1.00(Spearman's)。使用具有連續(xù)性校正的Wilson方法計(jì)算95％置信區(qū)間。

圖10和11中已經(jīng)顯示，TRBC1和TRBC2可以用于區(qū)分不同的克隆性贅生性細(xì)胞系，問題是顯示該原理可以轉(zhuǎn)化至患者樣品，并且可以用于，例如淋巴瘤的診斷。難點(diǎn)是從相關(guān)的反應(yīng)性(非贅生性)T細(xì)胞中區(qū)分淋巴瘤細(xì)胞，在一些情況下其可以代表>50％的浸潤(rùn)。反應(yīng)性T細(xì)胞是非克隆性的并且應(yīng)當(dāng)是大致相等的表達(dá)TRBC1和TRBC2的細(xì)胞的混合物。然而，有時(shí)淋巴瘤細(xì)胞是形態(tài)學(xué)上可確認(rèn)的(大的、多形態(tài)的等等)。通過使用本發(fā)明的方法以將TRBC1和TRBC2細(xì)胞原位染色，該結(jié)果可以與形態(tài)分析結(jié)合以作出診斷。這在圖12和13中示出，兩者都顯示T-細(xì)胞淋巴瘤看起來(lái)主要表達(dá)僅一種TRBC類型。

與檢驗(yàn)表達(dá)每種TRBC的T細(xì)胞的差異形態(tài)一樣，也可以使用與其他的T細(xì)胞標(biāo)記的共染色，其可能顯著地增強(qiáng)淋巴瘤檢測(cè)的敏感度。

圖14進(jìn)一步顯示了本發(fā)明的診斷性能。在圖14中，用TRBC1探針(具有Seq ID nos：17和18的探針)和TRBC2探針(具有Seq ID nos：26至 29的探針)將贅生性的良性淋巴結(jié)組織染色。結(jié)果顯示，對(duì)每個(gè)探針組(棕色點(diǎn)，DAB檢測(cè))，所示的副皮質(zhì)區(qū)(T細(xì)胞區(qū)域)中的約一半的T細(xì)胞是陽(yáng)性的。在每個(gè)圖像的頂部，存在清楚限定的延伸的陰性區(qū)域，其是淋巴結(jié)皮質(zhì)竇。這些很少含有T細(xì)胞。

圖15示出了與圖14相似的結(jié)果，但是使用不同的探針組和不同的檢測(cè)方法。在全自動(dòng)Ventana Discovery Ultra Immunostainer(Ventana Medical Systems Inc，Tuscon，AZ)的甲酰胺和SSC緩沖液中進(jìn)行雜交。使用探針的混合物(具有Seq ID nos：19至22的序列的TRBC1探針以及具有Seq ID nos：26至29的序列的TRBC2探針)在37C至46C之間雜交。使用0.1％的SSC在37C和48C之間進(jìn)行三次嚴(yán)格的洗滌。探針是地高辛標(biāo)記的，并且通過連接有專用多聚體擴(kuò)增系統(tǒng)的HRP標(biāo)記的抗地高辛小鼠單克隆抗體(Ventana Medical Systems Inc，Tuscon，AZ)檢測(cè)。隨后酪胺擴(kuò)增，沉積半抗原BF(Rimsza et al.Diagnostic Pathology 2014 9：144)，其用HRP標(biāo)記的小鼠抗BF抗體檢測(cè)。隨后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，在探針結(jié)合的所有位點(diǎn)留下棕色底物。用蘇木精將切片復(fù)染色并置于Depex中。再次，對(duì)每個(gè)探針組，所示的副皮質(zhì)區(qū)(T細(xì)胞區(qū)域)中的約一半的T細(xì)胞是陽(yáng)性的(棕色點(diǎn)，DAB檢測(cè))。在每個(gè)圖像的頂部，存在清楚限定的延伸的陰性區(qū)域，其在TRBC1染色中是淋巴結(jié)皮質(zhì)竇且在TRBC2中是血管，兩者都很少含有T細(xì)胞。

現(xiàn)在隨后是本發(fā)明如何可以用于改變和改善當(dāng)前的相關(guān)于淋巴瘤和白血病的臨床實(shí)踐的實(shí)例。

1.皮膚淋巴瘤(包括但不限于蕈樣真菌病；賽扎里綜合征；外周T細(xì)胞淋巴瘤，未另外規(guī)定；間變大細(xì)胞淋巴瘤；淋巴瘤樣丘疹??；原發(fā)性皮膚CD4-陽(yáng)性小/中型多形T細(xì)胞淋巴瘤)。

皮膚淋巴瘤以外觀顯示，通常是紅色斑塊，類似于良性的炎性皮膚病癥。通常將這些活檢，但通過當(dāng)前的形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)手段難以區(qū)分良性病癥和淋巴瘤。基于PCR的T細(xì)胞受體基因重排研究可能失敗或給出單克隆、寡克隆或多克隆的結(jié)果，其顯示與臨床診斷不完全的相關(guān)，即淋巴瘤通常是單克隆的，但是作為炎癥過程的一部分發(fā)生的強(qiáng)免疫應(yīng)答也可給出單克隆的結(jié)果。相反，多克隆或寡克隆結(jié)果可能在良性的炎性皮膚病癥中更常見，但由于存在大量對(duì)淋巴瘤反應(yīng)的良性的T-細(xì)胞種群，一部分的淋巴瘤將產(chǎn)生多克隆或寡克隆結(jié)果，其掩蓋了從淋巴瘤細(xì)胞獲得的任何單克隆結(jié)果。在所有這些情況下，由于不能將在PCR結(jié)果中產(chǎn)生任何克隆峰的原因的細(xì)胞種群與其他種群區(qū)分開，因此產(chǎn)生困難。在高比例的病例中，盡管進(jìn)行了這些分析，但沒有達(dá)到確定性的診斷，因此可以進(jìn)行血液和骨髓樣品的放射學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室分析，以嘗試達(dá)到確定性的診斷。這些額外的研究很少有幫助，并采取觀望(“觀察和等待”)的方法。一種等待患者返回并重復(fù)活檢分析，希望更確定性的結(jié)果，并且一種進(jìn)行血液和骨髓樣品的放射學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室分析。

如在本發(fā)明中描述的TRBC1/2分析將解決該問題。例如，通過使用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或抗體，可以將TRBC1/2分析應(yīng)用于細(xì)胞種群，其也可以基于它們的形態(tài)外觀、免疫表型(例如，較大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表達(dá))或其他特性限定。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD4+T細(xì)胞是TRBC1限制性的(即，表達(dá)TRBC1而非TRBC2)，則能夠得出這是淋巴瘤而非良性炎性皮膚病癥的結(jié)論，并且用放射療法、化學(xué)療法或其它適當(dāng)?shù)闹委焷?lái)治療患者。還應(yīng)當(dāng)注意，根據(jù)本發(fā)明的這種TRBC1/2分析可以在少于24小時(shí)內(nèi)廉價(jià)且快速地進(jìn)行，而T-細(xì)胞受體基因重排研究將需要一周至數(shù)周。本發(fā)明提供了可以更廉價(jià)地獲得的更可靠的、確定性的和快速的結(jié)果。

2.小腸難治性乳糜瀉/腸病相關(guān)的T細(xì)胞淋巴瘤

乳糜瀉是一種自身免疫性疾病，由對(duì)發(fā)現(xiàn)于大麥、黑麥和小麥中的蛋白質(zhì)谷蛋白的T-細(xì)胞應(yīng)答引發(fā)。小百分比的乳糜瀉患者發(fā)展為腸病相關(guān)的T-細(xì)胞淋巴瘤，即，在沒有乳糜瀉的情況下幾乎不會(huì)見到的病癥。乳糜瀉與腸病相關(guān)的淋巴瘤之間的關(guān)鍵差異是，乳糜瀉的組織學(xué)特征(小腸上皮中的淋巴細(xì)胞以及小腸絨毛的損傷)和癥狀(腹瀉、腹脹、貧血、疲勞)由嚴(yán)格的避免膳食谷蛋白而消退，但是腸病相關(guān)的淋巴瘤和難治性乳糜瀉(越來(lái)越多地被認(rèn)為是早期形式的腸病相關(guān)的淋巴瘤)的那些沒有。然而，一部分個(gè)體具有進(jìn)行中的谷蛋白暴露而沒有意識(shí)到，并且盡管表面上無(wú)谷蛋白飲食(其中他們未察覺到進(jìn)行中的谷蛋白暴露)，他們的癥狀不能消退。由于存在進(jìn)展中的腸病相關(guān)的T細(xì)胞淋巴瘤的懷疑，他們經(jīng)常進(jìn)行十二指腸活檢，并且在活檢中進(jìn)行組織學(xué)檢查和克隆性研究。如上述關(guān)于皮膚淋巴瘤討論的，現(xiàn)有的克隆性研究不能可靠地區(qū)分良性病癥、急性乳糜瀉與淋巴瘤病癥、難治性乳糜瀉/腸病相關(guān)的淋巴瘤。血液和骨髓樣品的放射學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室分析不能總是有助于這種區(qū)分，并且可以觀察患者并進(jìn)行飲食操作以及進(jìn)一步地活檢以試圖達(dá)到確定性的診斷。

如參照皮膚淋巴瘤所描述的，通過本發(fā)明的技術(shù)，如(但不限于)組織學(xué)的TRBC1/2分析可以特別應(yīng)用于基于它們的形態(tài)學(xué)外觀、免疫表型(例如，較大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表達(dá))或其他特性限定的細(xì)胞種群以確定是否存在對(duì)TRBC1或TRBC2的偏斜。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD8+T-細(xì)胞是TRBC1限制性的(即，表達(dá)TRBC1而非TRBC2)，則能夠得出這是淋巴瘤病癥、難治性乳糜瀉/腸病相關(guān)的淋巴瘤中的一種的結(jié)論，并且用化學(xué)療法治療患者。這在侵襲性的乳糜瀉相關(guān)的淋巴瘤中可以開始得越早，預(yù)后越好。如前所述，本發(fā)明的TRBC1/2分析可以在少于24小時(shí)內(nèi)廉價(jià)且快速地進(jìn)行，提供更可靠的、確定性的和快速的結(jié)果。

3.骨髓中的T細(xì)胞淋巴瘤和白血病

T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(T-LGL)是CD8+T淋巴細(xì)胞的克隆增殖，其引起中性粒細(xì)胞減少(即，外周血中中性粒細(xì)胞數(shù)目減少)，貧血(即，外周血中紅血細(xì)胞數(shù)目減少)，和/或血小板減少(即，外周血中血小板數(shù)目減少)。這種病癥通常與自身免疫性疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他淋巴增殖性疾病相關(guān)。有時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)顯示CD8+CD57+T細(xì)胞數(shù)量增加來(lái)表明診斷，并且在一部分的病例中，這通過T細(xì)胞受體基因重排研究證實(shí)。可替換地，可以在骨髓環(huán)鉆上診斷T-LGL，有時(shí)作為不可預(yù)見的偶然發(fā)現(xiàn)。在環(huán)鉆中，可能存在T-細(xì)胞數(shù)量的質(zhì)變?cè)黾?，有時(shí)具有簇形成，并且通常具有CD4+:CD8+T細(xì)胞比率的反轉(zhuǎn)，盡管該發(fā)現(xiàn)不是T-LGL特定的。

基于PCR的T細(xì)胞受體基因重排研究可能失敗(骨髓環(huán)鉆的常見問題)或給出為單克隆、寡克隆或多克隆的結(jié)果，其顯示與臨床診斷的不完全相關(guān)，即T-LGL通常是單克隆的，但是對(duì)骨髓或淋巴結(jié)中的淋巴瘤或其它病癥，如另一種贅生物，例如B細(xì)胞淋巴瘤，骨髓瘤或脊髓發(fā)育不良綜合癥的存在的較強(qiáng)免疫應(yīng)答可能使得單克隆結(jié)果更難以記錄。類似地，僅少量的T細(xì)胞的存在可導(dǎo)致單克隆結(jié)果，稱為假克隆性。對(duì)外周血進(jìn)行的T細(xì)胞基因重排研究經(jīng)受類似的限制。因此，在相當(dāng)大比例的其中可能存在T-LGL的病例中，不能達(dá)到確定性診斷，并且采取觀望的“觀察和等待”方法。

如參照皮膚淋巴瘤所描述的，可以特異性地將通過本發(fā)明的技術(shù)，如(但不限于)組織學(xué)的TRBC1/2分析應(yīng)用于基于它們的形態(tài)外觀、免疫表型(例如，較大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表達(dá))或其它特征限定的細(xì)胞的種群以測(cè)定是否存在對(duì)TRBC1或TRBC2的偏斜。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD8+T細(xì)胞是TRBC1限制性的(即，表達(dá)TRBC1而非TRBC2)，則可以得出這是T-LGL的結(jié)論并且用化療劑如類固醇、甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺治療患者。其可以越早開始，預(yù)后越好。如先前所述，本發(fā)明的TRBC1/2分析可以在少于24小時(shí)內(nèi)廉價(jià)且快速地進(jìn)行，提供更可靠的、確定的和快速的結(jié)果。

用于分析TRBC1/2表達(dá)水平的本發(fā)明的方法允許更準(zhǔn)確地診斷骨髓或淋巴結(jié)或其他組織或血液樣品中存在或不存在淋巴瘤。這在確定例如是通過對(duì)皮膚的局部放射療法還是通過全身化學(xué)療法來(lái)治療皮膚淋巴瘤是至關(guān)重要的。

此外，一些全身性T細(xì)胞淋巴瘤最初可以表現(xiàn)出相對(duì)低水平的骨髓侵犯(例如，淋巴瘤占骨髓中的20-30％的細(xì)胞)，并且即使在形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查以及基于PCR的T細(xì)胞受體基因重排研究之后該診斷仍是非確定性的?？梢試L試放射學(xué)檢查和外周血分析，以試圖并達(dá)到診斷，但通常是不確定性的。然后采用觀望(“觀察和等待”)方法，直到第二次環(huán)鉆或淋巴結(jié)活檢顯示高得多的淋巴瘤侵犯的水平，其允許對(duì)形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查確定性地診斷，或者等待在某處生長(zhǎng)出可以在放射學(xué)上確定并活檢以得到明確的組織學(xué)診斷的團(tuán)塊。應(yīng)當(dāng)注意的是，一部分的患者由于不能得到診斷并因此延遲治療而死亡。對(duì)于以上的T-LGL，通過如(但不限于)組織學(xué)的技術(shù)來(lái)應(yīng)用TRBC1/2分析可以導(dǎo)致對(duì)初始骨髓環(huán)鉆的快速診斷，導(dǎo)致快得多地開始治療以及更好的患者結(jié)果。

4.淋巴結(jié)中的T細(xì)胞淋巴瘤

當(dāng)在顯微鏡下觀察時(shí)，一些T細(xì)胞淋巴瘤由明顯的贅生物樣細(xì)胞組成。在淋巴結(jié)中，它們經(jīng)常在副皮質(zhì)區(qū)(通常含有豐富的T細(xì)胞的淋巴結(jié)的部分)中生長(zhǎng)。因此可能非常難以測(cè)定是否存在淋巴瘤，并且進(jìn)行昂貴且耗時(shí)的基于PCR的克隆性研究，由于在淋巴結(jié)中還存在許多的非贅生性細(xì)胞，其可能掩蓋PCR研究的克隆性質(zhì)，其通常不能給出確定性結(jié)果。

如在本發(fā)明中描述的TRBC1/2分析將解決該問題。例如，通過使用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或抗體，可以將TRBC1/2分析應(yīng)用于也可以基于它們的形態(tài)外觀、免疫表型(例如，較大的尺寸、CD4或CD8或CD30的表達(dá))或其他特性限定的細(xì)胞種群。例如，如果90％(或80％或70％或60％)的CD4+T細(xì)胞是TRBC1限制性的(即，表達(dá)TRBC1而非TRBC2)，則能夠得出這是淋巴瘤而非良性T細(xì)胞種群的結(jié)論，并用放射療法、化學(xué)療法或其他適當(dāng)?shù)寞煼ㄖ委熁颊摺＿€應(yīng)當(dāng)注意的是，根據(jù)本發(fā)明的這種TRBC1/2分析可以在少于24小時(shí)內(nèi)廉價(jià)且快速地進(jìn)行，而T細(xì)胞受體基因重排研究將需要一周至數(shù)周。本發(fā)明提供了可以更廉價(jià)地獲得的更可靠的、確定性和快速的結(jié)果。

序列ID

SEQ ID NO：1 TRGC2 mRNA 3’非翻譯區(qū)，在圖1中示出，上一個(gè)外顯子的末尾以粗體示出并且主要的3’聚腺苷酸化位點(diǎn)示出為下劃線-GTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGTGGAGTTAGGAGCTTCTAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCAGCGCTTCTGAAGAGCTGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTATGTGCATGCACACCTGCACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGACCTTAGCATGCCTAAGTGACTAAACCAATAAA

SEQ ID NO：2 TRBC2 mRNA 3’非翻譯區(qū)，在圖1中示出，上一個(gè)外顯子的末尾以粗體示出并且主要的3’聚腺苷酸化位點(diǎn)示出為下劃線-GTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCCAAAACCATCCCAGGTCATTCTTCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTCCCAATCTGTGTTCCTAAAAGTGATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACATGAATACTTCTCTCTTTTTTCTGTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAAGTACGAAATAGGCTAAACCAATAAA

SEQ ID NO：3 TRBC1外顯子和3’UTR，在圖7中示出。

SEQ ID NO：4 TRBC2外顯子和3’UTR，在圖7中示出。

SEQ ID NO：5 TRBC1蛋白質(zhì)序列，在圖6中示出。

SEQ ID NO：6 TRBC2蛋白質(zhì)序列，在圖6中示出。

SEQ ID NO：7 TRGC1蛋白質(zhì)序列，在圖5中示出-XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS

SEQ ID NO：8 TRGC2蛋白質(zhì)序列，在圖5中示出-XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDIIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGIDQEIIFPPIKTDVTTVDPKYNYSKDANDVITMDPKDNWSKDANDTLLLQLTNTSAYYTYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS

SEQ ID NO：9 TRBC1 Cβ1正向引物：ACCCTGTATGCTGTGCTGGT，在圖2中示出。

SEQ ID NO：10 TRBC1 Cβ1反向引物：GGGATGCAGAGAGGTGAGAG，在圖2中示出。

SEQ ID NO：11 TRBC2 Cβ2正向引物：ACCTTGTATGCCGTGCTGGT，在圖2中示出。

SEQ ID NO：12 TRBC2 Cβ2反向引物：CTGGGATGGTTTTGGAGCTA，在圖2中示出。

SEQ ID NO：13 TRGC1外顯子和3’UTR，在圖8中示出。

SEQ ID NO：14 TRGC2外顯子和3’UTR，在圖8中示出。

SEQ ID NO：15-CCATGTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGTGGAGTTAGGAGCTTCTAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCAGCGCTTCTGAAGAGCTGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTATGTGCATGCACACCTGCACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGACCTTAGCATGCCTAAGTGACTAAACC

SEQ ID NO：16-CATGGTGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCCAAAACCATCCCAGGTCATTCTTCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTCCCAATCTGTGTTCCTAAAAGTGATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACATGAATACTTCTCTCTTTTTTCTGTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAAGTACGAAATAGGCTAAACC

SEQ ID NO：17–ACCATGACGGGTTAGAAGCT

SEQ ID NO：18–TTAGGGAGATTTCAGCCGTGA

SEQ ID NO：19–TGGGTTAGGGAGATTTCAGCC

SEQ ID NO：20–ATTGGGATGCAGAGAGGTGAG

SEQ ID NO：21–TGTGTATTGAAACCATGACGG

SEQ ID NO：22–CTAACTCCACTTCCAGGGCTG

SEQ ID NO：23–TGTAAGTAGGAGATGAGAAGCA

SEQ ID NO：24–TTGGGAGCAGGTACAGGAGAAT

SEQ ID NO：25–AGGATGAAGAATGACCTGGGAT

SEQ ID NO：26–GCCTATTTCGTACTTGGGGGT

SEQ ID NO：27–GTAAGTAGGAGATGAGAAGCAG

SEQ ID NO：28–AGGAACACAGATTGGGAGCAG

SEQ ID NO：29–CCTGGGATGGTTTTGGAGCTA

SEQ ID NO：30–肌動(dòng)蛋白正向引物：GGACTTCGAGCAAGAGATGG

SEQ ID NO：31–肌動(dòng)蛋白反向引物：AGCACTGTGTTGGCGTACAG

SEQ ID NO：32–反向和互補(bǔ)的TRBC2靶序列，在圖17中示出：TTTATTGGTTTAGCCTATTTCGTACTTGGGGGTTGGGAGCTCAATCTTCAGGGAAACAGAAAAAAGAGAGAAGTATTCATGTAAGTAGGAGATGAGAAGCAGAGTGAGAATCACTTTTAGGAACACAGATTGGGAGCAGGTACAGGAGAATCCTGGGTGAGGATGAAGAATGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTAGCCTCTGGAATCCTTTCTCTTGAC

SEQ ID NO：33–反向和互補(bǔ)的TRBC1靶序列，在圖18中示出：

TTTATTGGTTTAGTCACTTAGGCATGCTAAGGTCCCCCTGGGTTAGGGAGATTTCAGCCGTGAGTGTGCAGGTGTGCATGCACATAGGGGGATATCTATTGGGATGCAGAGAGGTGAGAGCAGCTCTTCAGAAGCGCTGGCAAAAGAAGAATGTGTATTGAAACCATGACGGGTTAGAAGCTCCTAACTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCAGAAATCCTTTCTCTTGAC

序列表

<110> 牛津大學(xué)科技創(chuàng)新有限公司

<120> T細(xì)胞單型的分析

<130> JA74505P.WOP

<150> GB 1417498.1

<151> 2014-10-03

<150> GB 1510237.9

<151> 2015-06-12

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gtcaagagaa aggatttctg aaggcagccc tggaagtgga gttaggagct tctaacccgt 60

catggtttca atacacattc ttcttttgcc agcgcttctg aagagctgct ctcacctctc 120

tgcatcccaa tagatatccc cctatgtgca tgcacacctg cacactcacg gctgaaatct 180

ccctaaccca gggggacctt agcatgccta agtgactaaa ccaataaa 228

<210> 2

<211> 218

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gtcaagagaa aggattccag aggctagctc caaaaccatc ccaggtcatt cttcatcctc 60

acccaggatt ctcctgtacc tgctcccaat ctgtgttcct aaaagtgatt ctcactctgc 120

ttctcatctc ctacttacat gaatacttct ctcttttttc tgtttccctg aagattgagc 180

tcccaacccc caagtacgaa ataggctaaa ccaataaa 218

<210> 3

<211> 915

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60

tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc cccgaccacg 120

tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acggacccgc 180

agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240

gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300

acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg 360

tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc taccagcaag 420

gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc ctgtatgctg 480

tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc tgaaggcagc 540

cctggaagtg gagttaggag cttctaaccc gtcatggttt caatacacat tcttcttttg 600

ccagcgcttc tgaagagctg ctctcacctc tctgcatccc aatagatatc cccctatgtg 660

catgcacacc tgcacactca cggctgaaat ctccctaacc cagggggacc ttagcatgcc 720

taagtgacta aaccaataaa aatgttctgg tctggcctga ctctgacttg tgaatgtctg 780

gatagctcct tggctgtctc tgaactccct gtgactctcc ccattcagtc aggatagaaa 840

caagaggtat tcaaggaaaa tgcagactct tcacgtaaga gggatgaggg gcccaccttg 900

agatcaatag cagaa 915

<210> 4

<211> 905

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

aggacctgaa aaacgtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga 60

tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg 120

tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc 180

agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga 240

gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct 300

acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg 360

tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag 420

gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg 480

tgctggtcag tgccctcgtg ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctagc 540

tccaaaacca tcccaggtca ttcttcatcc tcacccagga ttctcctgta cctgctccca 600

atctgtgttc ctaaaagtga ttctcactct gcttctcatc tcctacttac atgaatactt 660

ctctcttttt tctgtttccc tgaagattga gctcccaacc cccaagtacg aaataggcta 720

aaccaataaa aaattgtgtg ttgggcctgg ttgcatttca ggagtgtctg tggagttctg 780

ctcatcactg acctatcttc tgatttaggg aaagcagcat tcgcttggac atctgaagtg 840

acagccctct ttctctccac ccaatgctgc tttctcctgt tcatcctgat ggaagtctca 900

acaca 905

<210> 5

<211> 176

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

165 170 175

<210> 6

<211> 178

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser

165 170 175

Arg Gly

<210> 7

<211> 173

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項(xiàng)特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何自然存在的氨基酸

<400> 7

Xaa Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

115 120 125

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

145 150 155 160

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

165 170

<210> 8

<211> 189

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 雜項(xiàng)特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是任何自然存在的氨基酸

<400> 8

Xaa Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu

1 5 10 15

Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu

35 40 45

Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys

50 55 60

Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Glu

65 70 75 80

Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys

85 90 95

Asn Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val

100 105 110

Thr Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val

115 120 125

Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Trp Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr

130 135 140

Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu

145 150 155 160

Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu

165 170 175

Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser

180 185

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

accctgtatg ctgtgctggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

gggatgcaga gaggtgagag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

accttgtatg ccgtgctggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

ctgggatggt tttggagcta 20

<210> 13

<211> 958

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

gataaacaac ttgatgcaga tgtttccccc aagcccacta tttttcttcc ttcaattgct 60

gaaacaaagc tccagaaggc tggaacatac ctttgtcttc ttgagaaatt tttccctgat 120

gttattaaga tacattggga agaaaagaag agcaacacga ttctgggatc ccaggagggg 180

aacaccatga agactaatga cacatacatg aaatttagct ggttaacggt gccagaaaag 240

tcactggaca aagaacacag atgtatcgtc agacatgaga ataataaaaa cggagttgat 300

caagaaatta tctttcctcc aataaagaca gatgtcatca caatggatcc caaagacaat 360

tgttcaaaag atgcaaatga tacactactg ctgcagctca caaacacctc tgcatattac 420

acgtacctcc tcctgctcct caagagtgtg gtctattttg ccatcatcac ctgctgtctg 480

cttagaagaa cggctttctg ctgcaatgga gagaaatcat aacagacggt ggcacaagga 540

ggccatcttt tcctcatcgg ttattgtccc tagaagcgtc ttctgaggat ctagttgggc 600

tttctttctg ggtttgggcc atttcagttc ttatgtgtgt actattctat ctattgtata 660

acggttttca aaccagtggg cacacagaga acctcactct gtaataacaa tgaggaatag 720

ccacggcgat ctccagcacc aatctctcca tgttttccac agctcctcca gccaacccaa 780

atagcgcctg ctatagtgta gacatcctgc ggcttctagc cttgtccctc tcttagtgtt 840

ctttaatcag ataactgcct ggaagccttt cattttacac gccctgaagc agtcttcttt 900

gctagttgaa ttatgtggtg tgtttttccg taataagcaa aataaattta aaaaaatg 958

<210> 14

<211> 1013

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

gataaacaac ttgatgcaga tgtttccccc aagcccacta tttttcttcc ttcaattgct 60

gaaacaaaac tccagaaggc tggaacatac ctttgtcttc ttgagaaatt tttcccagat 120

attattaaga tacattggca agaaaagaag agcaacacga ttctgggatc ccaggagggg 180

aacaccatga agactaacga cacatacatg aaatttagct ggttaacggt gccagaagag 240

tcactggaca aagaacacag atgtatcgtc agacatgaga ataataaaaa cggaattgat 300

caagaaatta tctttcctcc aataaagaca gatgtcacca cagtggatcc caaatacaat 360

tattcaaagg atgcaaatga tgtcatcaca atggatccca aagacaattg gtcaaaagat 420

gcaaatgata cactactgct gcagctcaca aacacctctg catattacat gtacctcctc 480

ctgctcctca agagtgtggt ctattttgcc atcatcacct gctgtctgct tggaagaacg 540

gctttctgct gcaatggaga gaaatcataa cagacggtgg cacaaggagg ccatcttttc 600

ctcatcggtt attgtcccta gaagcgtctt ctgaggatct agttgggctt tctttctggg 660

tttgggccat ttcagttctc atgtgtgtac tattctatct attgtataat ggttttcaaa 720

ccagtgggca cacagagaac ctcactctgt aataacaatg aggaatagcc atggcgatct 780

ccagcaccaa tctctccatg ttttccacag ctcctccagc caacccaaat agcgcctgct 840

atagtgtaga cagcctgcgg cttctagcct tgtccctctc ttagtgttct ttaatcagat 900

aactgcctgg aagcctttca ttttacacgc cctgaagcag tcttctttgc tagttgaatt 960

atgtggtgtg tttttccgta ataagcaaaa taaatttaaa aaaatgaaaa gtt 1013

<210> 15

<211> 226

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

ccatgtcaag agaaaggatt tctgaaggca gccctggaag tggagttagg agcttctaac 60

ccgtcatggt ttcaatacac attcttcttt tgccagcgct tctgaagagc tgctctcacc 120

tctctgcatc ccaatagata tccccctatg tgcatgcaca cctgcacact cacggctgaa 180

atctccctaa cccaggggga ccttagcatg cctaagtgac taaacc 226

<210> 16

<211> 218

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

catggtgtca agagaaagga ttccagaggc tagctccaaa accatcccag gtcattcttc 60

atcctcaccc aggattctcc tgtacctgct cccaatctgt gttcctaaaa gtgattctca 120

ctctgcttct catctcctac ttacatgaat acttctctct tttttctgtt tccctgaaga 180

ttgagctccc aacccccaag tacgaaatag gctaaacc 218

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

accatgacgg gttagaagct 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

ttagggagat ttcagccgtg a 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

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