背景技術(shù)：
：根據(jù)不同的資料，在3-10％的人群中存在各種病因的周圍神經(jīng)損傷發(fā)生[1-3]。開發(fā)可改善標準治療的質(zhì)量的其他治療方法的理由是由于長時間的康復(fù)期(一年及更長)、工作年齡患者的生活質(zhì)量明顯降低和高失能率。周圍神經(jīng)損傷是職業(yè)失能的常見原因。周圍神經(jīng)完整性修復(fù)方法的選擇是由于每個個體病例損傷的許多特性，即損傷機制、從損傷起到手術(shù)干預(yù)時持續(xù)的時間、周圍神經(jīng)缺損的程度等等。通過端-端吻合術(shù)縫合被切開的神經(jīng)區(qū)域是重建治療模式中的一種。然而，周圍神經(jīng)損傷經(jīng)常伴有嚴重的缺損，因此使這種途徑不適用。在這種環(huán)境下，自體神經(jīng)移植是修復(fù)神經(jīng)完整性的最適當?shù)倪x項?？色@取功能較不重要的神經(jīng)作為自體移植物。不同的導(dǎo)管可用作代用品。這些是被指定為代替延長的組織缺損并創(chuàng)建周圍神經(jīng)再生條件的管狀結(jié)構(gòu)。手術(shù)修復(fù)后受周圍神經(jīng)支配的肢體功能的恢復(fù)程度取決于各種因素，例如從損傷直到手術(shù)時過去的時間、缺損程度、從周圍神經(jīng)的損傷位置到受神經(jīng)支配的區(qū)域的距離等等。然而，盡管神經(jīng)完整性再建技術(shù)的進步，但即使在最有利的條件下，通常只發(fā)生受神經(jīng)支配的肢體功能的部分恢復(fù)。這引起了對將會改善標準重建治療和患者一般生活質(zhì)量的結(jié)果的新方法的研究。利用生長因子誘導(dǎo)周圍神經(jīng)的再生是這些途徑中的一種。這種概念產(chǎn)生于對在周圍神經(jīng)再生的自然過程中發(fā)揮重要作用的生長因子的知識積累[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vegf)是被充分研究的影響周圍神經(jīng)恢復(fù)的生長因子之一。vegf是血管生成和血管發(fā)生的主要調(diào)節(jié)劑之一。vegf是34-42kda的二硫鍵結(jié)合的糖蛋白二聚體。vegf-a是特異性的內(nèi)皮細胞(ec)促分裂原。vegf誘導(dǎo)ec增殖、它們的激活、分化和它們形成毛細小管，進一步重塑成成熟血管。它也是增加ec存活的強大因子，因為它誘導(dǎo)抗凋亡蛋白的表達。編碼vegf的基因的缺失在心血管系統(tǒng)發(fā)育過程中導(dǎo)致致死性的嚴重缺陷。人類vegf的基因位于染色體位點6р21.3。編碼區(qū)包含約14,000bp。有數(shù)種vegf同種型例如vegf121、vegf145、vegf148、vegf165、vegf183、vegf189、vegf206，源于由8個外顯子組成的mrna的可變剪接。具體的細胞外定位與各vegf同種型對應(yīng)，所述同種型基于它們在結(jié)合硫酸肝素和硫酸乙酰肝素的能力中的生化差異。例如，人類vegf-a基因的所有轉(zhuǎn)錄本都含有外顯子1-5和8，差異在于外顯子6和7的可變剪接。在發(fā)現(xiàn)之后，vegf長期只被認為是血管生成的誘導(dǎo)物和用于治療伴有組織缺血的不同病癥的潛在治療劑。然而，隨著時間過去，已經(jīng)得到了它對于周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩者的神經(jīng)元的神經(jīng)保護性質(zhì)的資料[5，6]。vegf刺激施旺細胞(schwanncells)、星形細胞、小膠質(zhì)細胞和皮層神經(jīng)元的增殖[7-10]。在大鼠坐骨神經(jīng)擠壓性損傷模型中，顯示了腰椎響應(yīng)損傷顯著增加vegf和flt-1(vegfii型受體)的表達[11]。因此，產(chǎn)生了利用這種生長因子作為周圍神經(jīng)損傷重建治療的附加治療組分的前提。利用vegf作為充入導(dǎo)管中的基質(zhì)膠的部分誘導(dǎo)了軸突出芽，其隨著所述導(dǎo)管中每單位橫截面面積中軸突數(shù)量增加而顯現(xiàn)[12]。在腓和脛神經(jīng)廣泛缺損的創(chuàng)傷模型中，在自體靜脈移植物中使用荷載vegf的聚乳酸微球顯著改善了神經(jīng)功能指標并增加了所述移植物中有髓纖維的數(shù)量[13]。在試驗中，vegf誘導(dǎo)施旺細胞在移植物中分裂并向遠端部分遷移，這與毛細管和有髓纖維數(shù)量增加相關(guān)聯(lián)[14]。在大鼠海綿體神經(jīng)損傷模型中，在海綿體中引入vegf與bdnf的組合引起失去的神經(jīng)支配和勃起功能恢復(fù)[15]。fgf是另一種生長因子，其具有誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的性質(zhì)。fgf在周圍神經(jīng)損傷中誘導(dǎo)施旺細胞增殖和遷移[16]。在動物試驗中顯示，阻斷fgf、fgfr1和fgfr2的受體導(dǎo)致無鞘感覺纖維神經(jīng)病和熱疼痛敏感性的明顯削弱[17]。在周圍神經(jīng)損傷模型中的骨髓源性干細胞應(yīng)用引起fgf表達增加，按作者的意見，這誘導(dǎo)了施旺細胞遷移和增殖[18]。在胸部脊髓損傷模型中，在坐骨神經(jīng)移植物中使用fgf促進了上肢運動功能的改善[19]。因此，基于所述試驗數(shù)據(jù)可以推測，在周圍神經(jīng)修復(fù)的綜合療法結(jié)合這些生長因子可能是有效的。然而，生長因子的治療應(yīng)用已知有很多限制。在施用到損傷部位中之后，它們經(jīng)歷快速降解，因此不能保持它們的恒定濃度以達到期望的治療效果[20]。因此，使用基因療法更加合適?；谥委焺┚幋a基因的轉(zhuǎn)移機制，有兩種主要趨勢，例如使用病毒和非病毒載體。然而，盡管病毒載體有高轉(zhuǎn)染活性，但在臨床中使用它們則因插入誘變、炎性應(yīng)答和毒性的風險而受到限制。應(yīng)用質(zhì)粒dna是更安全的基因轉(zhuǎn)移方法。在用端-端和端-側(cè)吻合術(shù)修復(fù)肌皮神經(jīng)的模型中，將有vegf基因的dna質(zhì)粒在手術(shù)中施用到遠側(cè)區(qū)中引起吻合部位遠側(cè)區(qū)域的每單位橫截面積的有鞘纖維數(shù)量顯著增加，其與施旺細胞中vegf濃度顯著增加有關(guān)聯(lián)[21]。基因治療構(gòu)建物可神經(jīng)旁注射。在坐骨神經(jīng)損傷模型中，plvegf肌內(nèi)給藥并與覆蓋吻合部位的透明質(zhì)酸膜鞘聯(lián)用以便降低瘢痕形成嚴重度。與它們用作單一療法相比，所述藥物肌肉注射伴有肌肉響應(yīng)幅度的顯著增加和所述吻合部位遠側(cè)的有髓纖維數(shù)量增加[22]。wangf等進行的研究證明了當在端-端縫合坐骨神經(jīng)殘端后神經(jīng)內(nèi)給予所述基因治療構(gòu)建物時的plvegf的劑量依賴性效果。使用較高的劑量引起最明顯的神經(jīng)生理參數(shù)增加和較少的小牛肌肉重量指標降低[23]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些因子在作用上的協(xié)同。例如，在坐骨神經(jīng)損傷模型中vegf基因編碼質(zhì)粒和c-csf基因編碼質(zhì)粒聯(lián)用，證明了在端-端吻合的遠側(cè)區(qū)域中有髓纖維和毛細管數(shù)量的更明顯增加、在脊神經(jīng)節(jié)中保持更多的神經(jīng)元以及運動功能的早期恢復(fù)[24]。然而，當體內(nèi)使用基因治療劑時，只有一部分細胞被質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染。因此，細胞將同時被兩種不同的基因治療構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的幾率降低。因而，在一個質(zhì)粒中組合具有協(xié)同作用的兩種生長因子的遺傳序列是合理的。這種途徑的效力已在脊髓挫傷的動物模型中得到了證明。在該試驗期間，已經(jīng)顯示，在將含有40μg的vegf和fgf2基因的質(zhì)粒直接注射到脊髓中的環(huán)境下，在1.5cm的創(chuàng)傷核心內(nèi)制作的截面中，毛細管數(shù)量有顯著增加。還基于行為測試數(shù)據(jù)，與沒有給予所述含vegf和fgf2基因的質(zhì)粒的對照組動物相比，運動功能的恢復(fù)顯著改善?；诘玫降慕Y(jié)果得出結(jié)論，應(yīng)用所述雙盒質(zhì)粒改善了脊髓血管化并減少了脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)的破壞面積[25]。然而，這些結(jié)果沒有提供使用所述有vegf和fgf2基因的雙盒質(zhì)粒在周圍神經(jīng)損傷中是否有效的想法。這是由于以下事實，即挫傷的機制與伴有神經(jīng)斷傷的創(chuàng)傷在發(fā)病機理和嚴重程度上明顯不同，后者更特定針對周圍神經(jīng)并在周圍神經(jīng)損傷的總結(jié)構(gòu)中占優(yōu)勢。但最重要的差異是脊髓和周圍神經(jīng)的再生潛力不同。因此，有必要確定帶有生長因子基因的質(zhì)粒是否能用于有效改善周圍神經(jīng)再生。附圖說明圖1.重復(fù)途徑。顯現(xiàn)了有自體移植物的整個坐骨神經(jīng)。圖2.手術(shù)前的上肢圖。在右上臂的下、中和上三分之一的前和后外側(cè)表面上看到創(chuàng)傷后和術(shù)后凹陷的不規(guī)則疤痕。圖3.這張照片顯示了2-5手指的中節(jié)指骨缺乏主動運動，圖4.可看出所有手指的抓握受損。圖5.可看到在受正中神經(jīng)和尺神經(jīng)支配的區(qū)內(nèi)手部肌肉的高度萎縮以及只能將手指1與手指2相對的能力。圖6.照片顯示了將重組質(zhì)粒рbud(kan)-covegf-cofgf2注射到修復(fù)的神經(jīng)中(參見正文)。圖7.照片顯示了應(yīng)用纖維蛋白膠來防止所述重組質(zhì)粒漏出。圖8.照片顯示了手和前臂肌肉的萎縮。c)指甲改變：發(fā)育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。圖9.鉤狀抓取(提袋狀)。圖10.拳狀抓取。圖11.指尖抓握(手指i-iii)。圖12.指尖抓握(手指i-iii)。圖13.指尖抓握(手指i-iv)。圖14.顯示了魚際肌群的肌電圖結(jié)果的圖。圖15.小魚際肌群的肌電圖發(fā)現(xiàn)。發(fā)明的詳細說明發(fā)明的范圍是醫(yī)學(xué)，它優(yōu)選的使用領(lǐng)域是神經(jīng)外科、創(chuàng)傷學(xué)和頜面外科，周圍神經(jīng)損傷的治療。本發(fā)明的目的是利用基因治療構(gòu)建物來改善重建治療的結(jié)果。vegf和fgf-2基因的遺傳序列是雙盒優(yōu)化的重組質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2的主要組分。本發(fā)明的物質(zhì)通過利用以seqno.1示出的密碼子優(yōu)化的重組質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2構(gòu)成的藥物以誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生，通過恢復(fù)受損神經(jīng)的運動和靈敏度功能并明顯減少治療期、包括損傷后后期，實現(xiàn)了所要求的技術(shù)結(jié)果。最接近的類似情況是專利ru3459630с1“用遺傳構(gòu)建物的神經(jīng)再生刺激技術(shù)(stimulationtechniqueforneuroregenerationwithgeneticconstructions)”，描述了當注射雙盒質(zhì)粒pbud(kan)-vegf-fgf2時，大鼠脊髓的創(chuàng)傷后再生方法。該發(fā)明是為了保護以下對象。密碼子優(yōu)化的重組質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2，其含有vegf和fgf2編碼基因，由核苷酸序列seqno.1示出，用于周圍神經(jīng)再生；周圍神經(jīng)再生的刺激技術(shù)，其通過在術(shù)中或術(shù)后期間在神經(jīng)內(nèi)、神經(jīng)周和神經(jīng)旁施用由序列seqno.1示出的所述密碼子優(yōu)化的重組質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2來實現(xiàn)。受損人類神經(jīng)的治療方式，其通過將有效量的如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2注射到損傷區(qū)域中來實現(xiàn)?；诨蛑委焺╅_發(fā)經(jīng)驗，我們的研究組目的在于創(chuàng)建治療周圍神經(jīng)損傷患者的有效產(chǎn)品。為此目的，我們開發(fā)了各種基因治療構(gòu)建物，它們通過被編碼的轉(zhuǎn)基因的數(shù)量、轉(zhuǎn)基因以及相同轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列而相互不同。利用基因治療構(gòu)建物來改善周圍神經(jīng)恢復(fù)的經(jīng)驗已有描述[26]。當在分離的周圍神經(jīng)損傷模型中評價使用同時編碼vegf和fgf2基因的質(zhì)粒的效力時，所述藥物均等地以45μg的總劑量直接注射到遠端和近端以及注射到自體神經(jīng)移植物中。大鼠用作實驗動物；它們被分成三組，即未處理組、施用基因治療構(gòu)建物的試驗組和注射磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)溶液而不是研究藥物的對照組。周圍神經(jīng)再生動力學(xué)的評價標準包括神經(jīng)生理參數(shù)例如神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌肉響應(yīng)幅度以及組織學(xué)檢查結(jié)果例如有髓纖維數(shù)量和毛細管網(wǎng)密度。在注射所述質(zhì)粒構(gòu)建物后的第56天，試驗組的神經(jīng)生理參數(shù)優(yōu)于對照組，然而，它們明顯不及完好動物?；谒鼋M織學(xué)檢查結(jié)果，實驗組中每單位橫截面積的有髓纖維數(shù)量明顯高于對照組，然而，盡管這樣，卻沒有觀察到肢體功能的有效恢復(fù)。實驗結(jié)果顯示，使用含有生長因子的遺傳序列的質(zhì)粒基構(gòu)建物發(fā)揮刺激周圍神經(jīng)再生的作用，然而，作用強度達不到最佳。我們認為這主要是由于用于我們研究中的質(zhì)粒本身的缺點。為了改善所述基因治療構(gòu)建物的性質(zhì)，對它的結(jié)構(gòu)做出了很多重大改變。首先，載體被修飾：除去標簽序列并以卡那霉素抗性基因代替。其次，為了增加表達效力，使用了vegf和fgf2基因的密碼子優(yōu)化的cdna序列(seqno.1)。其后，我們利用所述密碼子優(yōu)化的質(zhì)粒，在周圍神經(jīng)損傷模型中再次進行了很多試驗研究?；蛑委煒?gòu)建物在周圍神經(jīng)縫合后立即神經(jīng)內(nèi)施用。結(jié)果在所述手術(shù)干預(yù)和藥物施用后60天內(nèi)評價(圖1)。在我們使用的所有質(zhì)粒dna中，所述含有fgf-2和vegf遺傳序列的密碼子優(yōu)化的雙盒質(zhì)粒得到了最好的結(jié)果?；谒褂玫幕蛑委煒?gòu)建物pbud(kan)-vegf-fgf2改善周圍神經(jīng)再生的效力的非臨床數(shù)據(jù)，我們啟動了一項臨床研究，其結(jié)果在下面給出?；颊遙.，1985年出生，在2011年4月04日被收入韃靼斯坦共和國衛(wèi)生部的共和國臨床醫(yī)院(republicclinicalhospitalofmohoftherepublicoftatarstan)創(chuàng)傷中心，診斷如下：右上臂中三分之一的正中神經(jīng)和尺神經(jīng)損傷后遺癥(圖2)。根據(jù)病史：2009年，患者上臂的中間三分之一被玻璃割傷，正中神經(jīng)和尺神經(jīng)受損。正中神經(jīng)和尺神經(jīng)立即被端-端縫合，然而，在緊接手術(shù)后期間，完全缺乏運動和敏感性功能?？祻?fù)治療過程沒有產(chǎn)生明顯結(jié)果。后來，在7個月時，由于運動和敏感性功能恢復(fù)中缺乏正性改變，在2010年進行了正中神經(jīng)和尺神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)。在術(shù)后隨訪中觀察到稍有再生變化，即，完全缺乏敏感性，同時，出現(xiàn)以手和手指的輕度彎曲為特征的運動功能，因此決定進行手術(shù)治療。在手術(shù)之前，2011年4月21日時，對患者進行了檢查，結(jié)果如下：營養(yǎng)失調(diào)a)皮膚狀態(tài)：正常顏色，手指溫度降低，冰冷感增加；b)手和前臂肌肉與正常手臂相比萎縮；大于2cm(圖2-3)；c)指甲改變：發(fā)育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。在患者由所述神經(jīng)支配的自主區(qū)中的敏感性測試：編號敏感性種類簡要說明1.疼痛無2.溫度無3.觸覺無4.分辨力無5.二維空間感無6.立體感無7.壓力感無8.重量感無程度敏感性恢復(fù)s0神經(jīng)自主區(qū)內(nèi)缺乏敏感性運動功能測試程度運動功能恢復(fù)m2關(guān)節(jié)明顯攣縮且沒有運動手抓握模式；手不能執(zhí)行任何類型的抓握(圖3-4)。診斷：2年前的前臂中三分之一的正中神經(jīng)和尺神經(jīng)損傷持續(xù)。正中神經(jīng)和尺神經(jīng)縫合術(shù)和神經(jīng)松解術(shù)后的狀態(tài)(圖5)。在2011年4月26日進行手術(shù)，包括正中神經(jīng)和尺神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)伴以神經(jīng)內(nèi)施用編碼所述vegf和fgf-2基因的質(zhì)粒dna。手術(shù)運行：在神經(jīng)阻滯麻醉下，按照手術(shù)域的三重處理，在右上臂的內(nèi)表面上進行拱形切開。正中神經(jīng)和尺神經(jīng)有技術(shù)難度地分離開。找出縫合線。沒有觀察到神經(jīng)瘤跡象，然而，所述神經(jīng)參與疤痕成形過程并與周圍組織粘連。用胰島素針注射所述含有重組vegf和fgf-2的質(zhì)粒，每神經(jīng)在2.5ml生理鹽水溶液中250μg。所述注射給入縫合區(qū)以及向近側(cè)和向遠側(cè)10cm(圖6)。然后，在所述分離的神經(jīng)上施加2ml的雙組分纖維蛋白膠“tissucol”(圖7)。止血。傷口縫合。放置橡皮管引流。施加無菌敷料。施加石膏繃帶。在手術(shù)后一個月進行再次檢查。2011年5月25日體檢結(jié)果：營養(yǎng)失調(diào)：a)皮膚狀態(tài)：正常顏色；b)手和前臂肌肉與正常手臂相比萎縮；大于2cm(圖8)；c)指甲改變：發(fā)育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。在患者由所述神經(jīng)支配的自主區(qū)中的敏感性測試：程度敏感性恢復(fù)s1神經(jīng)自主區(qū)內(nèi)的深部痛覺敏感性恢復(fù)運動功能測試程度運動功能恢復(fù)m2關(guān)節(jié)明顯攣縮且沒有運動手抓握模式：手不能執(zhí)行任何類型的抓握。術(shù)后6個月內(nèi)進行定期檢查。日期在2012年11月15日的體檢結(jié)果如下：營養(yǎng)失調(diào)：a)皮膚狀態(tài)：正常顏色；b)手和前臂肌肉與正常手臂相比萎縮-中度(1-2cm)和重度-大于2cm；c)指甲改變：在正常限度內(nèi)；d)分泌功能(出汗)：正常在患者由所述神經(jīng)支配的自主區(qū)中的敏感性測試：程度敏感性恢復(fù)運動功能測試程度運動功能恢復(fù)m3關(guān)節(jié)輕度運動(有效的恢復(fù))手抓握模式：1)圓柱形抓取-是2)球形抓取-是3)鉤形抓取(提袋狀)-是4)拳形抓取-是5)指尖抓握a)末端相對-是b)(近末端相對-否)6)側(cè)抓握a)捏形抓取-否b)(剪形抓取-“夾煙狀”)-否。術(shù)后一年內(nèi)，患者定期檢查。日期為2012年4月20日的體檢結(jié)果如下：營養(yǎng)失調(diào)：a)皮膚狀態(tài)：正常顏色；b)手和前臂肌肉與正常手臂相比萎縮-中度，1-2cm；c)指甲改變：在正常限度內(nèi)；d)分泌功能：在正常限度內(nèi)。在患者由所述神經(jīng)支配的自主區(qū)中的敏感性測試：運動功能測試程度運動功能恢復(fù)m4克服一些阻力的運動手抓握模式：1)圓柱形抓取-是2)球形抓取-是3)鉤形抓取-是(圖9)4)拳形抓取-是(圖10)5)指尖抓握(圖11-13)a)末端相對-是b)近末端相對-是6)側(cè)抓握a)捏形抓取-是b)剪形抓取-是。因此，所述臨床研究結(jié)果顯示，在神經(jīng)內(nèi)施用所述基因治療構(gòu)建物后的一年內(nèi)，肢體功能顯著改善。改善的肢體功能狀態(tài)表現(xiàn)為營養(yǎng)失調(diào)嚴重性降低、在正中神經(jīng)和尺神經(jīng)的神經(jīng)支配區(qū)域內(nèi)所有類型的敏感性發(fā)生、以及運動功能顯著改善?；诩‰妶D學(xué)結(jié)果，在這一年里魚際肌響應(yīng)幅度從0mv增加到5mv并且?guī)缀踹_到對側(cè)肢體的值(圖14和15)。所述雙盒質(zhì)粒使用效力是由于同時傳遞兩種基因vegf和fgf2的可行性，促進了更有效地誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生。被引入所述密碼子優(yōu)化的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的改變使得能夠顯著增加所編碼的基因的表達，確保了這些生長因子在創(chuàng)傷核心所需要的治療濃度，這提高了周圍神經(jīng)恢復(fù)效力。因此，我們推測得到當利用所述質(zhì)粒pbud(kan)-covegf-cofgf2時達到的臨床效果是由于這兩種生長因子的組合和它們密碼子序列的優(yōu)化。令人遺憾的是，在現(xiàn)階段，我們不能依靠上述基因治療構(gòu)建物來明確地確定誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生的機制，這需要進一步研究。然而，在試驗和臨床觀察中，已經(jīng)確定了它們用于改善周圍神經(jīng)損傷的手術(shù)治療結(jié)果的效力。參考文獻1.hudso，a.r.周圍神經(jīng)修復(fù)時程：重要的局部和神經(jīng)病理因素(timingofperipheralnerverepair：importantlocalandneuropathologicalfactors)/a.r.hudson//clinicalneurosurgery.-1977.-24卷.-c.391-405.2.deitch，e.a.112例肢體獵槍傷的經(jīng)驗(experiencewith112shotgunwoundsoftheextremities)/e.a.deitch，w.r.grimes//jtrauma.-1984.-24卷.-600-603頁.3.在有多發(fā)性損傷的患者群體中上下肢周圍神經(jīng)損傷分析(analysisofupperandlowerextremityperipheralnerveinjuriesinapopulationofpatientswithmultipleinjuries)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