本發(fā)明涉及一種源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白、具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法、除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法、維持具有多能性的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法、iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法、iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法、以及這些方法中使用的試劑盒。

背景技術(shù)：

在將人iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)時(shí)，通過一系列的擴(kuò)增培養(yǎng)(傳代培養(yǎng))的重復(fù)而制備許多未分化的細(xì)胞。已知的是，在該一系列的培養(yǎng)中，有從未分化狀態(tài)逸脫的細(xì)胞即“未分化逸脫細(xì)胞”偶然地產(chǎn)生。

已知有該未分化逸脫細(xì)胞具有與未分化細(xì)胞大致同等的分裂能力，且誘發(fā)從未分化細(xì)胞向未分化逸脫細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。即，未分化逸脫細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，其增殖速度超過未分化細(xì)胞的增殖速度，抑制未分化細(xì)胞的增殖。

未分化逸脫細(xì)胞的產(chǎn)生在不熟練的培養(yǎng)操作者的培養(yǎng)中較多地觀察到。另外，已知集落尺寸過大、集落彼此的合并為產(chǎn)生的一個(gè)原因。因此，通過在低匯合下傳代、維持播種時(shí)的均勻性，可以某種程度上降低未分化逸脫細(xì)胞的產(chǎn)生頻率。另外，通過近年來所開發(fā)的培養(yǎng)基，也某種程度上抑制未分化逸脫細(xì)胞的產(chǎn)生頻率。但是，盡管如此，未分化逸脫細(xì)胞仍偶然地產(chǎn)生，在產(chǎn)生的情況下，除去含有未分化逸脫細(xì)胞的集落還是必須的。

含有未分化逸脫細(xì)胞的集落維持未分化狀態(tài)，因此，在傳代時(shí)通過顯微鏡下的移液操作而仔細(xì)地被除去。模仿這種集落除去手法的裝置、例如組合有觀察裝置和機(jī)器人操作的移液的裝置也已經(jīng)被開發(fā)出來。

另外，專利文獻(xiàn)1中公開有：為了一邊維持iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的未分化一邊使其增殖，在活化素存在下將多能性干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本特開2012-143229號公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

如上所述，在人iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)中，容易引起脫離未分化的現(xiàn)象，難以維持未分化，在數(shù)次傳代后，引起許多iPS細(xì)胞集落脫離未分化的現(xiàn)象，可能形成含有脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的集落。因此，仔細(xì)的培養(yǎng)、及仔細(xì)的集落選擇這樣的繁瑣的操作變得不可缺少。從促進(jìn)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)方面考慮，也期望繁瑣的操作少、即使不是熟練者也可以的、多能性干細(xì)胞的未分化維持方法。

另外，從再生醫(yī)療或?qū)?chuàng)新藥物開發(fā)研究的實(shí)用化方面考慮，期待穩(wěn)定地大量供給人iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的高品質(zhì)細(xì)胞。因此，近年來，嘗試通過懸浮培養(yǎng)進(jìn)行的培養(yǎng)，但在細(xì)胞塊分割時(shí)對細(xì)胞造成損傷等成為問題。因此，期望可以簡便且有效地大量培養(yǎng)人iPS細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的方法。

源自肉毒桿菌的血凝素(HA)為肉毒神經(jīng)毒素復(fù)合體的成分。近年來發(fā)現(xiàn)：該HA具有與作為細(xì)胞粘附分子的E-鈣粘著蛋白特異性地結(jié)合、由此破壞腸管上皮細(xì)胞的細(xì)胞間屏障的分子機(jī)制。本發(fā)明人等嘗試了使用該HA所具有的分子機(jī)制來除去具有多能性(“pluripotency”，以下同樣)的干細(xì)胞的培養(yǎng)中的集落中產(chǎn)生的“脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞”。

本發(fā)明在一方式中，提供能夠除去具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中的集落中產(chǎn)生的“脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞”的新的血凝素。

本發(fā)明在一方式中，提供使用血凝素的、具有多能性的干細(xì)胞的新的培養(yǎng)方法。

用于解決課題的技術(shù)方案

本發(fā)明在一方式中涉及一種變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分(subcomponent)HA2及HA3，構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異。

本發(fā)明在一方式中涉及一種變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白由亞成分HA1、HA2及HA3形成，相當(dāng)于所述亞成分HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相當(dāng)于所述亞成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述亞成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸產(chǎn)生變異。

本發(fā)明在一方式中涉及一種具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在本發(fā)明的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明在一方式中涉及一種除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法，其中，包含在本發(fā)明的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明在一方式中涉及一種源自人的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

本發(fā)明在一方式中涉及一種源自人的iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，在一方式中，可以發(fā)揮能夠除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中的集落中產(chǎn)生的“脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞”的效果。

根據(jù)本發(fā)明，在一方式中，可以發(fā)揮能夠簡便且有效地大量培養(yǎng)具有多能性的干細(xì)胞的效果。

附圖說明

圖1是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例2)。

圖2是在第三天添加B型變異型HA復(fù)合體1(HA1 N286A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例2)。

圖3是在第三天添加B型變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例2)。

圖4是在第三天添加B型變異型HA復(fù)合體3(HA1 N286A/HA3 R528A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例2)。

圖5是在第三天添加B型變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(比較例1)。

圖6是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體1時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例3)。

圖7是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體2時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例3)。

圖8是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體3時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例3)。

圖9是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體4時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例3)。

圖10是在第三天添加B型野生型HA復(fù)合體5時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例3)。

圖11是在懸浮培養(yǎng)中添加B型野生型及B型變異型HA復(fù)合體時(shí)的iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的顯微鏡觀察照片的一例(300個(gè)細(xì)胞/孔、實(shí)施例4)。

圖12是在懸浮培養(yǎng)中添加B型野生型及B型變異型HA復(fù)合體時(shí)的iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的顯微鏡觀察照片的一例(500個(gè)細(xì)胞/孔、實(shí)施例4)。

圖13是在懸浮培養(yǎng)中B型野生型HA復(fù)合體的各種添加時(shí)間(6、12、18及24小時(shí))中的、iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例5)。

圖14是說明實(shí)施例6中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的流程的圖。

圖15示出表示實(shí)施例6中的培養(yǎng)天數(shù)和活細(xì)胞濃度的關(guān)系的圖表的一例。

圖16是說明實(shí)施例7中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的流程的圖。

圖17示出表示實(shí)施例7中的培養(yǎng)天數(shù)和活細(xì)胞濃度的關(guān)系的圖表的一例。

圖18是在第三天添加A型變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例7)。

圖19是在第三天添加A型變異型HA復(fù)合體3(HA1 N285A/HA3 R528A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(實(shí)施例7)。

圖20是在第三天添加A型變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)時(shí)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例(比較例3)。

圖21是對照(不添加HA)的iPS細(xì)胞的集落的顯微鏡觀察照片的一例。

具體實(shí)施方式

已知源自肉毒桿菌的野生型血凝素為由HA1(33K、HA-33)、HA2(17K、HA-17)及HA3(70K、HA-70)的3種亞成分所構(gòu)成的復(fù)合體。其中，源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA1、HA2及HA3以2：1：1的比例形成12聚物復(fù)合體。另外，已知：源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素與E-鈣粘著蛋白結(jié)合，介由E-鈣粘著蛋白而抑制細(xì)胞間粘附；為HA2和HA3的復(fù)合體時(shí)也可得到E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性。

本發(fā)明在一方式中，基于如下見解：只要是至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列、且使構(gòu)成糖鏈識(shí)別部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的血凝素(變異型血凝素)，則可以選擇性地抑制在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中的集落內(nèi)已產(chǎn)生的和/或產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞(以下，也稱為“未分化逸脫細(xì)胞”)的細(xì)胞間粘附，進(jìn)而可以選擇性地除去未分化逸脫細(xì)胞。

另外，本發(fā)明在一方式中，基于如下見解：在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將具有多能性的干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，即使如人iPS細(xì)胞那樣為纖細(xì)的細(xì)胞，也可以將細(xì)胞團(tuán)塊容易且有效地分割成小塊，進(jìn)而可以由小塊形成新的細(xì)胞團(tuán)塊。

另外，本發(fā)明在一方式中，基于如下見解：與B型野生型血凝素相比，至少含有源自A型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列、且使構(gòu)成糖鏈識(shí)別部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的血凝素(A型變異型血凝素)可以有效地除去未分化逸脫細(xì)胞。

[具有多能性的干細(xì)胞]

本發(fā)明中，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，具有多能性的干細(xì)胞為人多能性(pluripotent)干細(xì)胞。本發(fā)明中，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，人多能性干細(xì)胞為人iPS細(xì)胞或人ES細(xì)胞。

[脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞(未分化逸脫細(xì)胞)]

本發(fā)明中，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞(未分化逸脫細(xì)胞)的細(xì)胞的形態(tài)與未分化狀態(tài)的細(xì)胞的形態(tài)不同，可以辨別。在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，成為未分化逸脫細(xì)胞可以通過未分化標(biāo)記物的消失而確認(rèn)。在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，未分化標(biāo)記物為Oct3/4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60。

[變異型血凝素(HA)復(fù)合體蛋白]

就本發(fā)明而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中涉及一種源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白(以下，也稱為“本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白”)。本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白為至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列、且構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。另外，就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性、且構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。另外，就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為具有E-鈣粘著蛋白功能抑制活性、且構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以發(fā)揮如下效果：在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中，能夠抑制在集落內(nèi)已產(chǎn)生的和/或產(chǎn)生的未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附。本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白優(yōu)選可以從集落中除去未分化逸脫細(xì)胞，另外可以發(fā)揮如下效果：在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中，能夠使所構(gòu)成的集落維持在未分化狀態(tài)(可以持續(xù)形成由維持在未分化狀態(tài)的具有多能性的干細(xì)胞構(gòu)成的集落)。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，還可以含有亞成分HA1。就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為由HA2及HA3的2成分所構(gòu)成的復(fù)合體，從更有效地抑制細(xì)胞間粘附、可以更有效地除去未分化逸脫細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，為由HA1、HA2及HA3的3成分所構(gòu)成的復(fù)合體。

本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異。就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以也稱為使源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素中的糖鏈結(jié)合活性的至少一部分或全部缺失的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。作為源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素中的構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了HA1的氨基酸序列(序列號1)的第286位的天冬酰胺及HA3的氨基酸序列(序列號3)的第528位的精氨酸等。另外，作為其它的氨基酸，已知有HA1的氨基酸序列(序列號1)的第264位的天冬酰胺等(例如KwangKook Lee et al,Biochem Biophys Res Commun 2014 Apr 4,Vol 446,Issue 2,pp.568-573等)。就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，這些氨基酸或相當(dāng)于這些氨基酸的氨基酸產(chǎn)生變異，從可以自集落中有效地除去未分化逸脫細(xì)胞方面考慮，優(yōu)選HA3的氨基酸序列(序列號3)的第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異，更優(yōu)選HA3的氨基酸序列(序列號3)的第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸和HA1的氨基酸序列(序列號1)的第286位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異。本發(fā)明中，“相當(dāng)于這些氨基酸的氨基酸”是指立體結(jié)構(gòu)上與上述的構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的野生型的氨基酸同等的位置的氨基酸。就本發(fā)明中的氨基酸的變異而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含置換為不識(shí)別糖鏈的氨基酸，優(yōu)選包含置換為丙氨酸。

本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白具有源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素中的構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列。即，就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性。因此，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性、且構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。作為E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位，與源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素同樣地具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性的源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素中的E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位已經(jīng)被解析(例如KwangKook Lee et al,Science 2014 Jun 20,Vol.344,no.6190 pp.1405-1410等)。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA3，包含在HA3的野生型(野生型HA3)的氨基酸序列(序列號3)中第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異的氨基酸序列的一部分或全部。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA2，包含HA2的野生型(野生型HA2)的氨基酸序列(序列號2)的一部分或全部。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA1，包含在HA1的野生型(野生型HA1)的氨基酸序列(序列號1)中第264位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸和/或第286位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異的氨基酸序列的一部分或全部。

就本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為由亞成分HA1、HA2及HA3形成、相當(dāng)于所述亞成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述亞成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。

作為本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的第1實(shí)施方式，可舉出包含在野生型HA1的氨基酸序列(序列號1)中第264位的天冬酰胺和/或第286位的天冬酰胺產(chǎn)生變異的HA1(變異型HA1)、野生型HA2及野生型HA3的變異型HA復(fù)合體(變異型HA復(fù)合體1)。在變異型HA復(fù)合體1的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，只要變異型HA復(fù)合體1中所含的亞成分HA1的至少1個(gè)為變異型HA1即可，優(yōu)選全部的HA1為變異型HA1。

作為本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的第2實(shí)施方式，可舉出包含在野生型HA1、野生型HA2、及野生型HA3的氨基酸序列(序列號3)中第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異的HA3(變異型HA3)的變異型HA復(fù)合體(變異型HA復(fù)合體2)。在變異型HA復(fù)合體2的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，只要變異型HA復(fù)合體2中所含的亞成分HA3的至少1個(gè)為變異型HA3即可，優(yōu)選全部的HA3為變異型HA3。

作為本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的第3實(shí)施方式，可舉出包含變異型HA1、野生型HA2及變異型HA3的變異型HA復(fù)合體(變異型HA復(fù)合體3)，從更有效地抑制細(xì)胞間粘附、更有效地除去未分化逸脫細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選列舉在野生型HA1的氨基酸序列(序列號1)中第286位的天冬酰胺變異為丙氨酸的HA1(序列號4)、野生型HA2(序列號2)及在野生型HA3的氨基酸序列(序列號3)中第528位的精氨酸變異為丙氨酸的HA3(序列號5)。在變異型HA復(fù)合體3的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，只要變異型HA復(fù)合體3中所含的亞成分HA1的至少1個(gè)為變異型HA1即可，優(yōu)選全部的HA1為變異型HA1。另外，只要變異型HA復(fù)合體3中所含的亞成分HA3的至少1個(gè)為變異型HA3即可，優(yōu)選全部的HA3為變異型HA3。

就本發(fā)明的變異型復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以在亞成分HA1的C末端結(jié)合有標(biāo)簽。作為結(jié)合于C末端的標(biāo)簽，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出FLAG標(biāo)簽、D4標(biāo)簽(DDDD、序列號15)等。就本發(fā)明的變異型復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選不在亞成分HA1的N末端結(jié)合標(biāo)簽，優(yōu)選不在亞成分HA1的N末端結(jié)合His標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。

[具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法]

本發(fā)明在一方式中，包含一種具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)(以下，也稱為“本發(fā)明的培養(yǎng)方法”)。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，由于在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因此，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，能夠除去未分化逸脫細(xì)胞，另外，可以發(fā)揮如下效果：在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中，使所構(gòu)成的集落維持在未分化狀態(tài)。另外，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，由于在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因此，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，即使如源自人的iPS細(xì)胞那樣為纖細(xì)的細(xì)胞，也可以將球形的細(xì)胞團(tuán)塊有效地分割，優(yōu)選可以將具有多能性的干細(xì)胞有效且大量地進(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，就細(xì)胞培養(yǎng)而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出粘附培養(yǎng)(平面培養(yǎng))及懸浮培養(yǎng)等。

[粘附培養(yǎng)]

作為本發(fā)明的培養(yǎng)方法的第一實(shí)施方式，可舉出通過粘附培養(yǎng)而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)為粘附培養(yǎng)的情況下，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以發(fā)揮如下效果：從形成于培養(yǎng)面上的集落中除去未分化逸脫細(xì)胞。因此，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法，其中，包含在本發(fā)明的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。另外，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種由脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞所產(chǎn)生的集落來形成由未分化狀態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成的集落的方法，其中，包含將在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下所述脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞產(chǎn)生的集落進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明在其它的方式中涉及一種維持具有多能性的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法，其中，包含在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法、除去方法、集落形成方法和/或維持方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以從集落中有效地除去未分化逸脫細(xì)胞，可以僅將未分化細(xì)胞有效地培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法及除去方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以一邊在用培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)中維持封閉空間，一邊除去未分化逸脫細(xì)胞，可以進(jìn)行集落選拔，即，使構(gòu)成集落的細(xì)胞實(shí)質(zhì)上僅為未分化細(xì)胞。

第一實(shí)施方式中的細(xì)胞培養(yǎng)可以采用目前所使用的和/或今后所開發(fā)的、具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基等，可以通過使本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白存在于該培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基中來進(jìn)行。在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以將本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白添加于培養(yǎng)中的培養(yǎng)基，或者，可以使用預(yù)先添加有本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白可以在確認(rèn)了集落中產(chǎn)生未分化逸脫細(xì)胞的情況下隨時(shí)添加。培養(yǎng)基、培養(yǎng)板等可以使用市售的培養(yǎng)基、培養(yǎng)板。

就本發(fā)明的培養(yǎng)方法、除去方法、集落形成方法和/或維持方法中使用的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從有效地除去未分化逸脫細(xì)胞方面考慮，優(yōu)選含有變異型HA3，更優(yōu)選含有變異型HA1及變異型HA3。存在于培養(yǎng)基的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的濃度在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從有效地除去未分化細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，可舉出5nM以上、10nM以上、或15nM以上。從同樣的觀點(diǎn)出發(fā)，為200nM以下，150nM以下，或100nM以下。

在本發(fā)明的培養(yǎng)方法、除去方法、集落形成方法和/或維持方法中，就添加于培養(yǎng)基中的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以通過細(xì)胞內(nèi)吸收(內(nèi)吞作用等)而自發(fā)地被除去。另外，通過裝備以變異型HA復(fù)合體蛋白所附帶的標(biāo)簽為目標(biāo)的吸附柱并使培養(yǎng)基循環(huán)，可以將變異型HA復(fù)合體蛋白強(qiáng)制地從培養(yǎng)基中進(jìn)行回收。通過這樣將變異型HA復(fù)合體蛋白自發(fā)和/或強(qiáng)制地除去、回收，可以適時(shí)且暫時(shí)地或連續(xù)地進(jìn)行未分化逸脫細(xì)胞的除去。就本發(fā)明的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含通過生物反應(yīng)器的自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)而進(jìn)行具有多能性的干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。

第一實(shí)施方式中的細(xì)胞培養(yǎng)在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以為使用飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)，也可以為無飼養(yǎng)培養(yǎng)。就飼養(yǎng)細(xì)胞而言，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出：MEF(Mouse Embryo Fibroblast，鼠胚成纖維細(xì)胞)細(xì)胞、SL10、及SNL76/7飼養(yǎng)細(xì)胞等。就飼養(yǎng)細(xì)胞而言，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，在飼養(yǎng)細(xì)胞中，優(yōu)選具有多能性的干細(xì)胞的遷移速度比較緩慢的飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從具有多能性的干細(xì)胞的遷移比較緩慢、在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中的集落中可以使未分化逸脫細(xì)胞產(chǎn)生于集落中央部方面考慮，優(yōu)選SNL 76/7飼養(yǎng)細(xì)胞。

[懸浮培養(yǎng)]

作為本發(fā)明的培養(yǎng)方法的第二實(shí)施方式，可舉出通過懸浮培養(yǎng)而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)為懸浮培養(yǎng)的情況下，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，即使為如源自人的iPS細(xì)胞那樣纖細(xì)的細(xì)胞，也可將細(xì)胞團(tuán)塊有效地分割，優(yōu)選可以將具有多能性的干細(xì)胞有效且大量地進(jìn)行培養(yǎng)。因此，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種具有多能性的干細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法，其中，包含在本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下，將具有多能性的干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

就第二實(shí)施方式中的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含：通過將所述干細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊在源自肉毒桿菌的血凝素存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而將所述干細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊分割成小塊；及將所述小塊進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而形成新的細(xì)胞團(tuán)塊。就第二實(shí)施方式中的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，在與細(xì)胞團(tuán)塊的分割相同的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊的形成。就添加于培養(yǎng)基中的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以通過細(xì)胞內(nèi)吸收(內(nèi)吞作用等)而自發(fā)地除去。因此，就第二實(shí)施方式中的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以不清洗變異型HA復(fù)合體蛋白，通過連續(xù)培養(yǎng)而進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊的分割和新的細(xì)胞團(tuán)塊的形成。就第二實(shí)施方式中的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，不包含清洗變異型HA復(fù)合體蛋白的工序。另外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，通過裝備以本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白所附帶的標(biāo)簽為目標(biāo)的吸附柱，并使培養(yǎng)基循環(huán)，可以強(qiáng)制地從培養(yǎng)基中回收本物質(zhì)。通過這樣可以自發(fā)和/或強(qiáng)制地除去、回收變異型HA復(fù)合體蛋白、能夠控制細(xì)胞團(tuán)塊的分割并適時(shí)且暫時(shí)地或連續(xù)地發(fā)揮分割效果的本發(fā)明的培養(yǎng)方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含通過生物反應(yīng)器的自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)而進(jìn)行具有多能性的干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。

第二實(shí)施方式中的細(xì)胞培養(yǎng)可以采用目前所使用的和/或今后所開發(fā)的、具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基等，可以通過使本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白存在于該培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基中而進(jìn)行。在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以將本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白添加于培養(yǎng)中的培養(yǎng)基，或者，也可以使用預(yù)先添加有本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基及培養(yǎng)容器等可以使用市售的培養(yǎng)基及培養(yǎng)容器。

就存在于培養(yǎng)基的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白的濃度而言，在沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，從有效地除去未分化細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，可舉出5nM以上、10nM以上、或15nM以上。從同樣的觀點(diǎn)出發(fā)，為200nM以下、150nM以下、或100nM以下。

就懸浮培養(yǎng)而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以采用目前所使用的和/或今后所開發(fā)的、具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基等，通過使本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白存在于該培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基中而進(jìn)行。

[iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法]

就本發(fā)明而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中涉及一種iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(以下，也稱為“本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法”)。根據(jù)本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法，即使如源自人的iPS細(xì)胞那樣為纖細(xì)的細(xì)胞，也可以將球形的細(xì)胞團(tuán)塊有效地分割，因此，可以將iPS細(xì)胞有效且大量地進(jìn)行培養(yǎng)。因此，就本發(fā)明而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中涉及一種iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將iPS干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(以下，也稱為“本發(fā)明的分割方法”)。

就本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含：通過將iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊在源自肉毒桿菌的血凝素存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，將iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊分割成小塊；及將所述小塊進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而形成新的細(xì)胞團(tuán)塊。就本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，在與細(xì)胞團(tuán)塊的分割相同的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊的形成。就添加于培養(yǎng)基的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以通過細(xì)胞內(nèi)吸收(內(nèi)吞作用等)而自發(fā)地除去。因此，就本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以不清洗變異型HA復(fù)合體蛋白，通過連續(xù)培養(yǎng)而進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊的分割和新的細(xì)胞團(tuán)塊的形成。就本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，不包含清洗變異型HA復(fù)合體蛋白的工序。另外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，通過裝備以本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白所附帶的標(biāo)簽為目標(biāo)的吸附柱，并使培養(yǎng)基循環(huán)，可以從培養(yǎng)基中強(qiáng)制地回收本物質(zhì)。通過這樣可以自發(fā)和/或強(qiáng)制地除去、回收變異型HA復(fù)合體蛋白、可以控制細(xì)胞團(tuán)塊的分割而適時(shí)且暫時(shí)地或連續(xù)地發(fā)揮分割效果的本發(fā)明的培養(yǎng)方法，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含通過生物反應(yīng)器的自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)而進(jìn)行具有多能性的干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。

作為本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法及分割方法中使用的源自肉毒桿菌的血凝素，作為一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式，可舉出源自A型肉毒桿菌的血凝素及源自B型肉毒桿菌的血凝素等。作為源自B型肉毒桿菌的血凝素，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選含有在C末端結(jié)合有標(biāo)簽的亞成分HA1。就源自B型肉毒桿菌的血凝素而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白等。

在本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法及分割方法中，從能夠以低濃度將細(xì)胞團(tuán)塊有效地分割方面考慮，優(yōu)選源自A型肉毒桿菌的血凝素。作為源自A型肉毒桿菌的血凝素，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出源自A型野生型肉毒桿菌的血凝素及后述的源自A型變異型肉毒桿菌的血凝素。

在本發(fā)明的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法及分割方法中，懸浮培養(yǎng)條件、HA的添加條件等可以與第二實(shí)施方式的培養(yǎng)方法同樣地進(jìn)行。

[組合物]

本發(fā)明在其它的方式中涉及一種含有源自肉毒桿菌的血凝素的組合物(以下，也稱為“本發(fā)明的組合物”。)。本發(fā)明的組合物可以用于本發(fā)明的培養(yǎng)方法、本發(fā)明的除去方法、本發(fā)明的集落形成方法、本發(fā)明的維持方法、和/或本發(fā)明的分割方法。因此，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種用于本發(fā)明的培養(yǎng)方法、本發(fā)明的除去方法、本發(fā)明的集落形成方法、本發(fā)明的維持方法、和/或本發(fā)明的分割方法的組合物，其中，包含源自肉毒桿菌的血凝素。另外，本發(fā)明在其它的方式中涉及一種源自肉毒桿菌的血凝素在本發(fā)明的培養(yǎng)方法、本發(fā)明的除去方法、本發(fā)明的集落形成方法、本發(fā)明的維持方法、和/或本發(fā)明的分割方法中的用途。作為源自肉毒桿菌的血凝素，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出上述的源自A型肉毒桿菌的血凝素及源自B型肉毒桿菌的血凝素以及它們的復(fù)合體，作為源自B型肉毒桿菌的血凝素，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體、及野生型HA復(fù)合體。

[試劑盒]

本發(fā)明在其它的方式中涉及一種試劑盒，其包含具有多能性的干細(xì)胞用的培養(yǎng)基成分和本發(fā)明的變異型血凝素復(fù)合體蛋白(以下，也稱為“本發(fā)明的試劑盒”。)。本發(fā)明的試劑盒中的“變異型血凝素復(fù)合體蛋白”如上所述。本發(fā)明的試劑盒可以用于本發(fā)明的培養(yǎng)方法、除去方法、集落形成方法、和/或維持方法。具有多能性的干細(xì)胞用的培養(yǎng)基成分沒有特別限定，可以使用目前所使用的或今后所開發(fā)的培養(yǎng)基成分。

[用于具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)的組合物]

本發(fā)明在其它的方式中涉及一種含有源自肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的、用于具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)的組合物(以下，“本發(fā)明的培養(yǎng)用組合物”)。本發(fā)明的培養(yǎng)用組合物可以用于本發(fā)明的培養(yǎng)方法、本發(fā)明的除去方法、本發(fā)明的集落形成方法、本發(fā)明的維持方法、和/或本發(fā)明的分割方法。

本發(fā)明的培養(yǎng)用組合物中所含的源自肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白為至少含有源自肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列、且構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。構(gòu)成變異型血凝素復(fù)合體蛋白的血凝素只要是具有與E-鈣粘著蛋白的相互作用的血凝素，其肉毒桿菌的類型沒有特別限制。作為肉毒桿菌，在沒有特別限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出A型肉毒桿菌或B型肉毒桿菌。

就源自肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出作為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的本發(fā)明的變異型HA復(fù)合體蛋白。

就源自肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出源自A型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白(以下，也稱為“A型變異型HA復(fù)合體”)。

作為A型變異型HA復(fù)合體，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異的公知的A型變異型HA復(fù)合體。作為源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素中的構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸，例如有：HA1的氨基酸序列(序列號16)的第285位的天冬酰胺、及HA3的氨基酸序列(序列號18)的第528位的精氨酸、HA1的氨基酸序列(序列號16)的第263位的天冬酰胺等。

A型變異型HA復(fù)合體至少含有源自A型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以還含有亞成分HA1。就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，為由HA2及HA3的2成分構(gòu)成的復(fù)合體，從更有效地抑制細(xì)胞間粘附、可以更有效地除去未分化逸脫細(xì)胞的觀點(diǎn)出發(fā)，為由HA1、HA2及HA3的3成分構(gòu)成的復(fù)合體。

A型變異型HA復(fù)合體的構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異。就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以也稱為使源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素中的糖鏈結(jié)合活性的至少一部分或全部缺失的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸或相當(dāng)于這些氨基酸的氨基酸產(chǎn)生變異，從可以從集落中有效地除去未分化逸脫細(xì)胞方面考慮，優(yōu)選HA3的氨基酸序列(序列號18)的第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異，更優(yōu)選HA3的氨基酸序列(序列號18)的第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸和HA1的氨基酸序列(序列號16)的第285位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異。

A型變異型HA復(fù)合體具有源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素中的構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列。即，就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性。

就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA3，包含在A型-HA3的野生型(野生型HA3)的氨基酸序列(序列號18)中第528位的精氨酸或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異的氨基酸序列的一部分或全部。

就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA2，包含A型-HA2的野生型(野生型HA2)的氨基酸序列(序列號17)的一部分或全部。

就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，作為亞成分HA1，包含在A型-HA1的野生型(野生型HA1)的氨基酸序列(序列號16)中第264位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸、和/或第286位的天冬酰胺或相當(dāng)于其的氨基酸產(chǎn)生變異的氨基酸序列的一部分或全部。

就A型變異型HA復(fù)合體而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可以在亞成分HA1的C末端結(jié)合有標(biāo)簽。作為與C末端結(jié)合的標(biāo)簽，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，可舉出FLAG標(biāo)簽、D4標(biāo)簽(DDDD、序列號15)等。就本發(fā)明的變異型復(fù)合體蛋白而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選不在亞成分HA1的N末端結(jié)合標(biāo)簽，優(yōu)選不在亞成分HA1的N末端結(jié)合His標(biāo)簽或FLAG標(biāo)簽。

就本發(fā)明而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中涉及：使用本發(fā)明的培養(yǎng)用組合物的、將具有多能性的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法、除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法、及維持具有多能性的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法。就這些方法而言，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，包含在本發(fā)明的培養(yǎng)用組合物的存在下將具有多能性的干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及以下的沒有限定的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式。

[A1]一種變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，

所述復(fù)合體蛋白至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3，

構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異。

[A2]一種變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，

所述復(fù)合體蛋白至少含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3，

具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列，且

構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異。

[A3]根據(jù)[A1]所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白還含有源自B型肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA1。

[A4]根據(jù)[A3]所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸選自由相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸構(gòu)成的組。

[A5]一種變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其為源自B型肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，

所述復(fù)合體蛋白由亞成分HA1、HA2及HA3形成，

相當(dāng)于所述亞成分HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述亞成分HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸中的一個(gè)氨基酸或兩個(gè)氨基酸產(chǎn)生變異。

[A6]根據(jù)[A1]～[A5]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，在所述亞成分HA1的C末端結(jié)合有標(biāo)簽。

[A8]根據(jù)[A1]～[A7]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白具有E-鈣粘著蛋白功能抑制活性。

[A9]根據(jù)[A1]～[A8]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白具有E-鈣粘著蛋白結(jié)合活性。

[A10]根據(jù)[A1]～[A9]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白，其中，所述復(fù)合體蛋白具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列。

[B1]一種具有多能性(pluripotency)的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

[B2]根據(jù)[B1]所述的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)為粘附培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。

[C1]一種除去在具有多能性(pluripotency)的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

[C2]一種維持具有多能性(pluripotency)的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法，其中，包含在[A1]～[A10]中任一項(xiàng)所述的變異型HA復(fù)合體蛋白的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

[D1]一種源自人的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

[D2]根據(jù)[D1]所述的方法，其中，包含：通過在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而將所述細(xì)胞團(tuán)塊分割成小塊；及

將所述小塊進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而形成新的細(xì)胞團(tuán)塊，

在與所述細(xì)胞團(tuán)塊的分割相同的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行所述細(xì)胞團(tuán)塊的形成。

[D3]一種源自人的iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法，其中，包含在源自肉毒桿菌的血凝素存在下將所述iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

[D4]根據(jù)[D1]～[D3]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述源自肉毒桿菌的血凝素通過內(nèi)吞作用而被攝入。

[D5]根據(jù)[D1]～[D4]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述源自肉毒桿菌的血凝素選自由源自A型肉毒桿菌的血凝素及源自B型肉毒桿菌的血凝素構(gòu)成的組。

[D6]根據(jù)[D5]所述的方法，其中，所述源自B型肉毒桿菌的血凝素包含權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。

[E1]一種含有源自肉毒桿菌的血凝素的組合物，其用于[B1]、[B2]、[C1]、[C2]及[D1]～[D6]中任一項(xiàng)所述的方法。

[F1]一種試劑盒，其包含具有多能性的干細(xì)胞用的培養(yǎng)基成分和[A1]～[A10]中任一項(xiàng)所述的變異型血凝素復(fù)合體蛋白。

[F2]根據(jù)[F1]所述的試劑盒，其用于[B1]、[B2]、[C1]、[C2]及[D1]～[D6]中任一項(xiàng)所述的方法。

[G1]一種含有源自肉毒桿菌的變異型血凝素復(fù)合體蛋白的組合物，其中，

所述復(fù)合體蛋白為如下變異型血凝素復(fù)合體蛋白：

至少含有源自肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA2及HA3、

具有構(gòu)成E-鈣粘著蛋白結(jié)合部位的氨基酸序列、且

構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸中的至少一個(gè)產(chǎn)生變異，

所述組合物用于選自由如下方法構(gòu)成的組中的任一種方法：

除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法、

維持具有多能性的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法、

將源自人的iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的方法、及

源自人的iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊的分割方法。

[G2]根據(jù)[G1]所述的組合物，其中，所述肉毒桿菌為A型肉毒桿菌或B型肉毒桿菌。

[G3]根據(jù)[G1]或[G2]所述的組合物，其中，所述復(fù)合體蛋白還含有源自肉毒桿菌的血凝素的亞成分HA1。

[G4]根據(jù)[G3]所述的組合物，其中，在A型肉毒桿菌的情況下，所述構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸選自由相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第263位的天冬酰胺的氨基酸、相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第285位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸構(gòu)成的組，

在B型肉毒桿菌的情況下，所述構(gòu)成糖鏈結(jié)合部位的氨基酸選自由相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第264位的天冬酰胺的氨基酸、相當(dāng)于所述HA1的野生型的氨基酸序列的第286位的天冬酰胺的氨基酸、及相當(dāng)于所述HA3的野生型的氨基酸序列的第528位的精氨酸的氨基酸構(gòu)成的組。

[H1]一種具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一項(xiàng)所述的組合物的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

[H2]根據(jù)[H1]所述的方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)為粘附培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。

[H3]一種除去在具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的或可能產(chǎn)生的脫離了未分化狀態(tài)的細(xì)胞的方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一項(xiàng)所述的組合物的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

[H4]一種維持具有多能性的干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的方法，其中，包含在[G1]～[G4]中任一項(xiàng)所述的組合物的存在下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

實(shí)施例

以下，通過實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例為例示性的，本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。

(實(shí)施例1)

[B型肉毒HA復(fù)合體的制作]

按照以下的步驟制作下述表1所示的源自B型肉毒桿菌的野生型HA復(fù)合體及變異型HA復(fù)合體1～4。這些HA復(fù)合體(野生型HA復(fù)合體及變異型HA復(fù)合體)使用源自B型肉毒桿菌的野生型HA亞成分(HA1、HA2、HA3)、變異型HA1(HA1 N286A、序列號4)、變異型HA3(HA3 R528A、序列號5)及變異型HA3X(HA3 K607A、序列號6)而制作。

(1)質(zhì)粒的制作

就野生型而言，分別使用下述的引物，以Clostridium botulinum B-Okra株的基因組DNA為模板，通過PCR法對編碼作為HA1、HA2及HA3的各自的蛋白質(zhì)的以下的蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

(各亞成分的蛋白質(zhì))

HA1：在由序列號1的氨基酸序列的7-294位的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的C末端結(jié)合有FLAG標(biāo)簽的重組蛋白

HA2：在由序列號2的氨基酸序列的2-146位的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合有FLAG標(biāo)簽的重組蛋白

HA3：在由序列號3的氨基酸序列的19-626位的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的N末端結(jié)合有Strep標(biāo)簽的重組蛋白

(標(biāo)簽序列)

FLAG標(biāo)簽：DYKDDDDK(序列號7)

Strep標(biāo)簽：WSHPQFEK(序列號8)

(HA1擴(kuò)增用引物)

HA1正向引物：catgccatgggcatccaaaattcattaaatgac(序列號9)

HA1反向引物：cgggatccttacttgtcgtcatcgtctttgtagtctgggttactcatagtccatatc(序列號10)

(BHA2擴(kuò)增用引物)

HA2正向引物：tgaataagctttcagctgaaagaacttttc(序列號11)

HA2反向引物：cactttggtaccttatattttttcaagtttga(序列號12)

(HA3擴(kuò)增用引物)

HA3正向引物：gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg(序列號13)

HA3反向引物：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc(序列號14)

變異型HA復(fù)合體1～4(表1)中，將插入有野生型HA的載體為模板，利用通過PCR的定點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis)法而進(jìn)行變異體的制作。

關(guān)于擴(kuò)增的DNA片段，HA1插入于pET52b(+)的NcoI-BamHI site，HA2插入于pT7-FLAG-1(Sigma)的HindIII-SalI site，關(guān)于HA3，插入于pET52b(+)(Novagen)的KpnI-SalI site(pET-BHA3)。

(2)蛋白質(zhì)表達(dá)

制作的質(zhì)粒分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸菌株Rosetta2(DE3)(Novagen)。蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)使用Overnight Express Autoinduction system1(Novagen)而進(jìn)行。HA1及HA3在30℃下進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)36小時(shí)，關(guān)于HA2，在18℃下進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)誘導(dǎo)40小時(shí)。大腸菌通過離心而回收，在-80℃下保存。

(3)蛋白質(zhì)純化及復(fù)合體制作

HA1及HA2使用Anti-FLAG M2 agarose(Sigma)進(jìn)行純化。HA3使用StrepTrap HP(GE Healthcare)進(jìn)行純化。

將分別純化的重組體蛋白質(zhì)以HA1：HA2：HA3＝4：4：1的摩爾比進(jìn)行混合，在37℃下孵育3小時(shí)后，利用StrepTrap HP進(jìn)行純化，由此得到HA復(fù)合體。

[表1]

(實(shí)施例2)

[B型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞帶來的影響]

在飼養(yǎng)細(xì)胞上播種iPS細(xì)胞(day0)，每24小時(shí)用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換。在3天后(day3)，添加HA復(fù)合體(野生型HA復(fù)合體或變異型HA復(fù)合體)，孵育24小時(shí)，用PBS清洗2次，用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換(day4)。其后，每24小時(shí)用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換，至9天后(day9)。培養(yǎng)后，用免疫細(xì)胞染色法確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞的Oct3/4的表達(dá)。使用的細(xì)胞、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下所述。

[細(xì)胞]

iPS細(xì)胞：Tic NP29(將用MEF維持的Tic進(jìn)行了傳代的細(xì)胞)

飼養(yǎng)細(xì)胞：SNL 76/7

[培養(yǎng)基]

iPS細(xì)胞：Repro Stem(商品名，ReproCELL公司制)、5ng/mLbFGF(ReproCELL公司制)

飼養(yǎng)細(xì)胞：DMEM(Sigma公司制)(7％FBS(GIBCO公司制)，1％Penicillin-streptomycin solution(NACALAI TESQUE公司制))

[容器]

12孔板(培養(yǎng)面積：3.8cm²/孔，Corning公司制)

[HA制備、添加方法]

用PBS將HA復(fù)合體進(jìn)行逐級稀釋，進(jìn)而，使用培養(yǎng)基(Repro Stem)進(jìn)行稀釋(終濃度：100nM)。進(jìn)一步加入bFGF(終濃度5ng/ml)，將其添加于孔中。

[培養(yǎng)條件]

37℃、5％CO₂氣氛下

iPS細(xì)胞傳代后，在3天后(day3)的培養(yǎng)基交換中，以各濃度添加HA復(fù)合體，培養(yǎng)24小時(shí)。其后，在4天后(day4)的培養(yǎng)基交換中，更換為不添加HA復(fù)合體的培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

[觀察]

在day3、day4、day5及day9，用IN Cell Analyzer 2000(商品名，GE衛(wèi)生保健生物科學(xué)公司制)觀察培養(yǎng)細(xì)胞，取得圖像。將得到的顯微鏡觀察照片示于圖1～4。圖1～4中，將在上圖中用實(shí)線包圍的部分示于下圖。

(比較例1)

使用變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)，進(jìn)行與實(shí)施例2同樣的實(shí)驗(yàn)。將其結(jié)果示于圖5。圖5中，將在上圖中用實(shí)線包圍的部分示于下圖。

圖1表示野生型HA復(fù)合體的顯微鏡照片，圖2表示變異型HA復(fù)合體1的顯微鏡照片，圖3表示變異型HA復(fù)合體2的顯微鏡照片，以及圖4表示變異型HA復(fù)合體3的顯微鏡照片。

已知亞成分HA1中的第286位天冬酰胺及HA3中的第528位的精氨酸為糖鏈識(shí)別部位。如圖2～4所示，在使糖鏈結(jié)合活性缺失的任一種變異型HA復(fù)合體1～3中，自變異型HA復(fù)合體添加24小時(shí)后(day3)，未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附變得松弛，可以確認(rèn)未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附的抑制。特別是變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)抑制集落中心的未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附，同時(shí)確認(rèn)了細(xì)胞的剝離，另外，在變異型HA復(fù)合體3(HA1 N286A/HA3 R528A)中，如圖4所示，自變異型HA復(fù)合體添加24小時(shí)后(day3)，細(xì)胞間粘附變得松弛，在48小時(shí)后(day4)，與其它變異型HA及野生型HA相比，可看到細(xì)胞剝離的效果高(圖4的箭頭所示的部分)。進(jìn)而得知：在培養(yǎng)第9天(day9)，形成未分化維持集落。另一方面，作為鈣粘著蛋白結(jié)合活性消失變異體的比較例1的變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)不能確認(rèn)細(xì)胞間粘附的抑制及細(xì)胞的剝離(圖5)。因此表明：通過使糖鏈結(jié)合活性缺失的變異型HA復(fù)合體1～3，可以抑制局部的細(xì)胞-細(xì)胞間粘附，同時(shí)，特別是通過變異型HA復(fù)合體2及3，可以進(jìn)行有效的未分化逸脫細(xì)胞的剝離。

使用DAPI和未分化標(biāo)記物(Oct3/4、TRA-1-60及SSEA-4)或內(nèi)胚層、中胚層或外胚層的初期分化標(biāo)記物(α-SAM、Serumalbumin或Nestin)將集落進(jìn)行染色。其結(jié)果，在集落中心產(chǎn)生的未分化逸脫細(xì)胞，其未分化標(biāo)記物及上述的初期分化標(biāo)記物均為陰性，其周邊的細(xì)胞，確認(rèn)未分化標(biāo)記物為陽性。

(實(shí)施例3)

[B型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞帶來的影響(其2)]

如下述表2所示，在不同的位置上結(jié)合有標(biāo)簽，除此之外，通過與實(shí)施例1同樣的步驟制作野生型HA復(fù)合體1～5。

使用制備的野生型HA復(fù)合體1～5，與實(shí)施例2同樣地操作，確認(rèn)給iPS細(xì)胞帶來的影響。將其結(jié)果示于圖6～10。圖6表示野生型HA復(fù)合體1的顯微鏡照片，圖7表示野生型HA復(fù)合體2的顯微鏡照片，圖8表示野生型HA復(fù)合體3的顯微鏡照片，圖9表示野生型HA復(fù)合體4的顯微鏡照片，以及圖10表示野生型HA復(fù)合體5的顯微鏡照片。

[表2]

如圖6～10的箭頭所示，在任一個(gè)野生型HA復(fù)合體中，自野生型HA復(fù)合體添加24小時(shí)后(day3)，可以確認(rèn)未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附的松弛(細(xì)胞間粘附的抑制)。特別是野生型HA復(fù)合體1、3及4，自添加24小時(shí)后(day3)，可確認(rèn)細(xì)胞的剝離，其中，野生型HA復(fù)合體1在培養(yǎng)第5天(day5)，可確認(rèn)未分化逸脫細(xì)胞被除去，并形成未分化維持集落。因此表明：通過野生型HA復(fù)合體1，可以進(jìn)行有效的未分化逸脫細(xì)胞的剝離。

(實(shí)施例4)

[B型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞團(tuán)塊帶來的影響(其1)]

使用V形底96孔板制作iPS細(xì)胞團(tuán)塊，每天進(jìn)行半量培養(yǎng)基交換。在培養(yǎng)第3天(day3)，對iPS細(xì)胞團(tuán)塊添加HA復(fù)合體。在培養(yǎng)第4天(day4)，將iPS細(xì)胞團(tuán)塊移至平底96孔板，進(jìn)行輕柔移液，確認(rèn)細(xì)胞團(tuán)塊是否分裂。使用的細(xì)胞、培養(yǎng)基、HA復(fù)合體及培養(yǎng)條件等如下所述。

[細(xì)胞]

人iPS細(xì)胞(用Tic NP41(iMatrix-511(nippi)維持的iPS細(xì)胞))

[培養(yǎng)基]

mTeSR1(STEMCELL Technologies)

[容器]

V形底96孔板(Sumitomo Bakelite)

[HA]

野生型HA復(fù)合體

變異型HA復(fù)合體1(HA1 N286A)

變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)

變異型HA復(fù)合體3(HA1 N286A/HA3R528A)

變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)

[HA制備、添加方法]

將用PBS對HA復(fù)合體進(jìn)行逐級稀釋、進(jìn)而使用培養(yǎng)基(mTeSR1)進(jìn)行了稀釋的物質(zhì)(終濃度：100nM)添加于孔中。

[培養(yǎng)條件]

37℃、5％CO₂氣氛下

[觀察]

對全視野，使用In Cell Aanalyzer(商品名，GE衛(wèi)生保健生物科學(xué)公司制)觀察細(xì)胞團(tuán)塊，取得圖像。在變異型HA復(fù)合體添加前后(day3及day4)以倍數(shù)4倍進(jìn)行拍攝。將得到的顯微鏡照片示于圖11及12。

將分裂的細(xì)胞團(tuán)塊在層粘連蛋白包覆的培養(yǎng)面上進(jìn)行培養(yǎng)(飼養(yǎng)細(xì)胞：SNL)，每天進(jìn)行總量培養(yǎng)基交換。在培養(yǎng)第5天，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，同時(shí)利用使用mouse monoclonal Oct3/4antibody(Santa Cruz Biotechnology，sc-5279)的免疫細(xì)胞染色法確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞的Oct3/4的表達(dá)，另外，進(jìn)行DAPI染色。

作為對照，除不添加HA復(fù)合體以外，與上述同樣地進(jìn)行。將以上的結(jié)果示于下述表3。

[表3]

[評價(jià)基準(zhǔn)]

◎：可以將細(xì)胞團(tuán)塊分割成更小的塊。

○：可以分割細(xì)胞團(tuán)塊。

△：幾乎不能確認(rèn)細(xì)胞團(tuán)塊的分割。

×：細(xì)胞團(tuán)塊沒有分割。

如圖11及12所示，通過添加野生型HA復(fù)合體及變異型HA復(fù)合體1～3，可以使人iPS細(xì)胞團(tuán)塊分割成更小的尺寸的細(xì)胞團(tuán)塊。特別是通過變異型HA復(fù)合體1～3的添加，可以使人iPS細(xì)胞團(tuán)塊分割成更小的塊。另一方面，在作為鈣粘著蛋白結(jié)合活性消失變異體的比較例1的變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)的添加中，幾乎沒有看到細(xì)胞團(tuán)塊的分割，在對照(不添加HA復(fù)合體)中，細(xì)胞團(tuán)塊沒有進(jìn)行分割。

(實(shí)施例5)

[B型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞團(tuán)塊帶來的影響(其2)]

作為前培養(yǎng)，在30ml反應(yīng)器中將iPs細(xì)胞培養(yǎng)5天。將培養(yǎng)第5天的細(xì)胞移至24孔板，添加HA復(fù)合體。自HA復(fù)合體添加經(jīng)過6、12、18或24小時(shí)后，通過培養(yǎng)基交換而除去HA，進(jìn)行移液而使細(xì)胞團(tuán)塊分割。其后進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)胞團(tuán)塊的形態(tài)。使用的細(xì)胞、培養(yǎng)基、HA及培養(yǎng)條件等如下所述。將得到的顯微鏡照片示于圖13。

[細(xì)胞]

人iPS細(xì)胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)

[培養(yǎng)基]

mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)

[培養(yǎng)環(huán)境]

37℃，5％CO₂氣氛下

[培養(yǎng)容器]

24孔板(Corning，Cat.No.3526)

[播種密度]

1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml

[HA]

野生型HA復(fù)合體5(His-BHA1-FLAG：His-BHA2：Strep-BHA3)

添加濃度：40nM

[觀察裝置]

IN Cell Analyzer(GE Healthcare)

如圖13所示，將通過HA復(fù)合體的添加而較小地分割成的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行培養(yǎng)，由此再次形成凝團(tuán)塊。另外，確認(rèn)有如下傾向：相對于HA復(fù)合體的添加時(shí)間(從HA添加至培養(yǎng)基交換的時(shí)間)，添加時(shí)間為6小時(shí)的情況下，分割的程度最強(qiáng)，在12小時(shí)以后，不易被分割。由此表明：就培養(yǎng)基內(nèi)的HA復(fù)合體而言，可能是通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用等HA復(fù)合體消化或失活。因此表明：通過HA復(fù)合體而使細(xì)胞團(tuán)塊分割之后，即使在不進(jìn)行HA的除去操作的情況下，也可以使iPS細(xì)胞再次凝集而形成細(xì)胞團(tuán)塊。另一方面，添加于培養(yǎng)基中的HA復(fù)合體通過裝備以HA復(fù)合體所附帶的標(biāo)簽為目標(biāo)的吸附柱并使培養(yǎng)基循環(huán)，可以強(qiáng)制地從培養(yǎng)基中回收HA復(fù)合體。因此表明：可以自發(fā)或強(qiáng)制地除去、回收HA復(fù)合體，因此，可以適時(shí)且暫時(shí)地或連續(xù)地發(fā)揮逸脫細(xì)胞的除去或細(xì)胞團(tuán)塊的分割效果，可以進(jìn)行生物反應(yīng)器中的自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)。

(實(shí)施例6)

[B型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞團(tuán)塊帶來的影響(其3)]

通過圖14所示的步驟進(jìn)行iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。首先，在生物反應(yīng)器中將iPS細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)120小時(shí)，形成iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊。接著，添加B型變異型HA復(fù)合體，進(jìn)行HA處理6小時(shí)后，通過移液將細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行分割，接著添加10μM ROCK抑制劑，進(jìn)一步進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。另外，每24小時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞濃度的測定。將其結(jié)果的一例示于圖15。

[細(xì)胞]

人iPS細(xì)胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)

[培養(yǎng)基]

mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)

[培養(yǎng)環(huán)境]

37℃，5％CO₂氣氛下

[培養(yǎng)容器]

24孔板(Corning，Cat.No.3526)

[播種密度]

1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml

[HA]

B型變異型HA復(fù)合體(標(biāo)簽(結(jié)合部位、種類)HA1：C末端FLAG、HA2：N末端FLAG、HA3：N末端Strep)

添加濃度：10nM

[觀察裝置]

IN Cell Analyzer(GE Healthcare)

可以確認(rèn)：通過HA處理后的移液而分割成小的塊的細(xì)胞團(tuán)塊，通過其后的培養(yǎng)進(jìn)行再凝集而形成細(xì)胞團(tuán)塊。因此表明：通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用等，HA復(fù)合體消化或失活。另外，可以確認(rèn)：如圖15所示，活細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)天數(shù)而增加。因此，通過有效利用基于HA處理的細(xì)胞分割操作，可以實(shí)現(xiàn)iPS細(xì)胞的高密度培養(yǎng)工藝。

(實(shí)施例7)

[B型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞團(tuán)塊帶來的影響(其4)]

通過圖16所示的步驟進(jìn)行iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。首先，在生物反應(yīng)器中放入iPS細(xì)胞，接著添加10μM ROCK抑制劑，進(jìn)行24小時(shí)ROCK抑制劑處理之后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)120小時(shí)，形成iPS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊。接著添加B型變異型HA復(fù)合體，進(jìn)行HA處理6小時(shí)后，通過移液將細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行分割。接著添加10μM ROCK抑制劑，進(jìn)行ROCK抑制劑處理18小時(shí)后，進(jìn)一步進(jìn)行懸浮培養(yǎng)12小時(shí)。予以說明，每24小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基交換及活細(xì)胞濃度的測定。將其結(jié)果的一例示于圖17。

[細(xì)胞]

人iPS細(xì)胞(Tic，National Center for Global Health and Medicine，Np.52)

[培養(yǎng)基]

mTeSR1(Cata #0580/05896，STEMCELL TECHNOLOGIES)

[培養(yǎng)環(huán)境]

37℃，5％CO₂氣氛下

[培養(yǎng)容器]

24孔板(Corning，Cat.No.3526)

[播種密度]

1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml

[HA]

B型變異型HA復(fù)合體(標(biāo)簽(結(jié)合部位、種類)HA1：C末端FLAG、HA2：N末端FLAG、HA3：N末端Strep)

添加濃度：10nM

[觀察裝置]

IN Cell Analyzer(GEHealthcare)

作為對照，如圖16所示，進(jìn)行通過通常的傳代培養(yǎng)法的iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。即，不進(jìn)行HA處理及培養(yǎng)開始后150小時(shí)及198小時(shí)的ROCK抑制劑處理，除此之外，與實(shí)施例7同樣地進(jìn)行iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。將其結(jié)果的一例示于圖17。

實(shí)施例7中，可以確認(rèn)通過HA處理后的移液導(dǎo)致的細(xì)胞團(tuán)塊的分割和通過其后的培養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞團(tuán)塊的再凝集。如圖17所示，實(shí)施例6及對照均確認(rèn)了從培養(yǎng)開始24h后活細(xì)胞濃度增加、迅速增殖，但在培養(yǎng)開始144h附近，增殖速度平穩(wěn)地減少，就不進(jìn)行HA處理的對照而言，在144h以后，增殖(活細(xì)胞濃度的增加)變慢，在168h以后，活細(xì)胞濃度在1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml附近，幾乎不能確認(rèn)增殖。另一方面，在培養(yǎng)開始144h后進(jìn)行了HA處理的實(shí)施例6，暫時(shí)降低了的增殖速度再次恢復(fù)，在144h以后也確認(rèn)細(xì)胞的增殖。另外，在培養(yǎng)開始192h后，進(jìn)行第二次HA處理，結(jié)果可確認(rèn)緩慢的增殖速度的恢復(fù)，實(shí)施例6中，培養(yǎng)216h后的最終的活細(xì)胞濃度為3.36×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml(對照為1.68×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml)。由以上得知：利用了基于HA處理的細(xì)胞分割操作法的培養(yǎng)法與通常的傳代培養(yǎng)法相比，維持細(xì)胞增殖能力，可以進(jìn)行iPS細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。

(實(shí)施例8)

[A型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞帶來的影響]

制作下述表4所示的A型野生型HA復(fù)合體及A型變異型HA復(fù)合體。這些HA復(fù)合體基于T.Matsumura et al.,Nature Communications 2015 Feb 17；6:6255.doi:10.1038/ncomms7255而制作。予以說明，作為質(zhì)粒制作時(shí)的各亞成分的蛋白質(zhì)，HA1使用在C末端結(jié)合有FLAG標(biāo)簽的重組蛋白，HA2使用在N末端結(jié)合有FLAG標(biāo)簽的重組蛋白，HA3使用在N末端結(jié)合有Strep標(biāo)簽的重組蛋白。

[表4]

在飼養(yǎng)細(xì)胞上播種iPS細(xì)胞(day0)，每24小時(shí)用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換。在3天后(day3)，添加HA復(fù)合體(A型野生型HA復(fù)合體或A型變異型HA復(fù)合體)，孵育24小時(shí)，用PBS清洗2次，用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換(day4)。其后，每24小時(shí)用維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換，至7天后(day7)。使用的細(xì)胞、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下所述。

[細(xì)胞]

iPS細(xì)胞：Tic(將用MEF維持的Tic進(jìn)行傳代并播種在SNL細(xì)胞上的細(xì)胞，NP13)

飼養(yǎng)細(xì)胞：SNL

[培養(yǎng)基]

iPS細(xì)胞：Repro Stem(商品名，ReproCELL公司制)、5ng/mLbFGF(ReproCELL公司制)

飼養(yǎng)細(xì)胞：DMEM(Sigma公司制)(7％FBS(GIBCO公司制)，1％Penicillin-streptomycin solution(NACALAI TESQUE公司制))

[容器]

12孔板(培養(yǎng)面積：3.8cm²/孔，Corning公司制)

[HA制備、添加方法]

在培養(yǎng)基(Repro Stem)中加入bFGF(終濃度5ng/ml)，準(zhǔn)備稀釋培養(yǎng)基。將上述表4所示的A型變異型HA復(fù)合體2～4使用稀釋培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋(終濃度：100nM)，將其添加于孔中。

[培養(yǎng)條件]

37℃、5％CO₂氣氛下

iPS細(xì)胞傳代后，在3天后(day3)的培養(yǎng)基交換中，添加HA復(fù)合體，培養(yǎng)24小時(shí)。其后，在4天后(day4)的培養(yǎng)基交換中，更換為不添加HA復(fù)合體的培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

[觀察]

在day3、day4、day5及day7，用IN Cell Analyzer 2000(商品名，GE衛(wèi)生保健生物科學(xué)公司制)觀察培養(yǎng)細(xì)胞，取得圖像。以倍數(shù)4倍進(jìn)行拍攝。將得到的顯微鏡觀察照片示于圖18及19。圖18～20中，將在上圖中用實(shí)線包圍的部分示于下圖。

圖18表示A型變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)的顯微鏡照片，以及圖19表示A型變異型HA復(fù)合體3(HA1 N285A/HA3 R528A)的顯微鏡照片。

作為比較例3，使用作為鈣粘著蛋白結(jié)合活性消失變異體的A型變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)，除此之外，與上述實(shí)施例同樣地操作，進(jìn)行iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。作為對照，除不添加HA復(fù)合體以外，與實(shí)施例同樣地操作，進(jìn)行iPS細(xì)胞的培養(yǎng)。將得到的顯微鏡觀察照片分別示于圖20及21。

如圖18及19所示，在使糖鏈結(jié)合活性缺失的任一種A型變異型HA復(fù)合體2及3中，自A型變異型HA復(fù)合體添加24小時(shí)后(day3)，集落中心的未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附變得松弛，可以確認(rèn)未分化逸脫細(xì)胞的細(xì)胞間粘附的抑制，同時(shí)確認(rèn)細(xì)胞的剝離。特別是確認(rèn)了：A型變異型HA復(fù)合體3(HA1 N285A/HA3 R528A)，與A型野生型HA復(fù)合體及A型變異型HA復(fù)合體2相比，細(xì)胞剝離的效果高。另一方面，不添加HA復(fù)合體的對照及作為鈣粘著蛋白結(jié)合活性消失變異體的比較例3的變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)，不能確認(rèn)細(xì)胞間粘附的抑制及細(xì)胞的剝離(圖20及21)。因此表明：通過使糖鏈結(jié)合活性缺失的A型變異型HA復(fù)合體2及3，可以進(jìn)行局部的細(xì)胞-細(xì)胞間粘附的抑制，同時(shí)可以進(jìn)行有效的未分化逸脫細(xì)胞的剝離。

(實(shí)施例9)

[A型變異型HA復(fù)合體給iPS細(xì)胞團(tuán)塊帶來的影響]

在非粘附性培養(yǎng)容器60mm皿(Thermo：Nunclon Sphere)中播種iPS細(xì)胞(4.2×10⁶個(gè)細(xì)胞/60mm皿)，進(jìn)行培養(yǎng)，制作iPS細(xì)胞團(tuán)塊。每天進(jìn)行培養(yǎng)基交換，至培養(yǎng)第4天(day4)。在培養(yǎng)第4天(day4)，將iPS細(xì)胞團(tuán)塊移至24孔板，拍攝HA添加前的照片之后，添加HA復(fù)合體(終濃度：40nM)。自HA添加6、12、18或24小時(shí)后，進(jìn)行移液，在移液前后觀察細(xì)胞團(tuán)塊，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊是否分割的確認(rèn)。移液后，進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)塊的觀察。使用的細(xì)胞、培養(yǎng)基、HA復(fù)合體及培養(yǎng)條件等如下所述。另外，A型野生型HA復(fù)合體及A型變異型HA復(fù)合體使用與實(shí)施例8中制作的物質(zhì)同樣的物質(zhì)。

[細(xì)胞]

人iPS細(xì)胞(Tic(用iMatrix-511(nippi)維持的iPS細(xì)胞、NP19))

[培養(yǎng)基]

mTeSR1(STEMCELL Technologies)

[HA]

A型野生型HA復(fù)合體

A型變異型HA復(fù)合體1(HA1 N285A)

A型變異型HA復(fù)合體2(HA3 R528A)

A型變異型HA復(fù)合體3(HA1 N285A/HA3 R528A)

A型變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)

[HA制備、添加方法]

將用PBS對HA復(fù)合體進(jìn)行逐級稀釋、進(jìn)而使用培養(yǎng)基(mTeSR1)進(jìn)行了稀釋的物質(zhì)(終濃度：100nM)添加于孔中。

[培養(yǎng)條件]

37℃、5％CO₂氣氛下

[觀察]

對全視野使用In Cell Aanalyzer(商品名，GE衛(wèi)生保健生物科學(xué)公司制)觀察細(xì)胞團(tuán)塊。

作為對照，除不添加HA復(fù)合體以外，與上述同樣地進(jìn)行。

將以上的結(jié)果示于下述表5。

[表5]

[評價(jià)基準(zhǔn)]

：可以將細(xì)胞團(tuán)塊分割成更小的塊

◎：可以分割細(xì)胞團(tuán)塊

△：幾乎不能確認(rèn)細(xì)胞團(tuán)塊的分割

×：細(xì)胞團(tuán)塊沒有分割

A型野生型復(fù)合體可以以與B型野生型HA復(fù)合體及B型變異型HA復(fù)合體1～3同樣的水平將細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行分解。就A型變異型HA復(fù)合體1～3而言，在相同的濃度條件中進(jìn)行的情況下，與A型野生型復(fù)合體、B型野生型HA復(fù)合體及B型變異型HA復(fù)合體1～3相比，可以分割成更小的塊。另一方面，作為鈣粘著蛋白結(jié)合活性消失變異體的比較例1的變異型HA復(fù)合體4(HA3 K607A)的添加中，幾乎沒有看到細(xì)胞團(tuán)塊的分割，在對照(HA復(fù)合體未添加)中，細(xì)胞團(tuán)塊沒有進(jìn)行分割。

序列號1：源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA1

序列號2：源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA2

序列號3：源自B型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA3

序列號4：B型變異型HA1(HA1N286A)

序列號5：B型變異型HA3(HA3R528A)

序列號6：B型變異型HA3X(HA3K607A)

序列號7：FLAG標(biāo)簽

序列號8：Strep標(biāo)簽

序列號9～14：引物

序列號15：D4標(biāo)簽

序列號16：源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA1

序列號17：源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA2

序列號18：源自A型肉毒桿菌的野生型血凝素的亞成分HA3

SEQUENCE LISTING

<110> 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)

<120> 變異型血凝素復(fù)合體蛋白、以及使用其的具有多能性的干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

<130> H4322_G20150018

<150> JP2014-133364

<151> 2014-06-27

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 294

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 1

Met Glu His Tyr Ser Thr Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Thr Asp Leu Phe Phe Tyr Gln Val Pro

20 25 30

Gly Asn Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu

35 40 45

Arg Trp Arg Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys

50 55 60

Ser Met Asn Ile Tyr Asn Thr Asn Leu Val Leu Thr Trp Asn Ala Pro

65 70 75 80

Thr His Asn Ile Ser Ala Gln Gln Asp Ser Asn Ala Asp Asn Gln Tyr

85 90 95

Trp Leu Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser

100 105 110

Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asp Thr Val Ala Arg Asn

115 120 125

Leu Lys Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ser Tyr Ile Lys Phe Ile Ile

130 135 140

Glu Asp Tyr Val Ile Ser Asp Phe Lys Asn Phe Thr Cys Arg Ile Ser

145 150 155 160

Pro Ile Leu Ala Gly Gly Lys Val Val Gln Gln Val Ser Met Thr Asn

165 170 175

Leu Ala Val Asn Leu Tyr Ile Trp Asn Asn Asp Leu Asn Gln Lys Trp

180 185 190

Thr Ile Ile Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Lys

195 200 205

Ile Leu Ser Asn Gly Val Leu Thr Trp Ile Phe Ser Asp Gly Asn Thr

210 215 220

Val Arg Val Ser Ser Ser Ala Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu

225 230 235 240

Ile Asn Pro Val Ser Asp Asn Tyr Asp Arg Tyr Thr Ile Thr Asn Leu

245 250 255

Arg Asp Lys Thr Lys Val Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asp

260 265 270

Gly Thr Thr Ile Gln Val Phe Asn Ser Asn Gly Gly Asp Asn Gln Ile

275 280 285

Trp Thr Met Ser Asn Pro

290

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 2

Met Ser Ala Glu Arg Thr Phe Leu Pro Asn Gly Asn Tyr Asn Ile Lys

1 5 10 15

Ser Ile Phe Ser Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Pro Val Ser Gly Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Ser Asn Glu Ser Ser Ala Asn Asn Gln Lys Trp Asn Val Glu

35 40 45

Tyr Met Ala Glu Asn Arg Cys Phe Lys Ile Ser Asn Val Ala Glu Pro

50 55 60

Asn Lys Tyr Leu Ser Tyr Asp Asn Phe Gly Phe Ile Ser Leu Asp Ser

65 70 75 80

Leu Ser Asn Arg Cys Tyr Trp Phe Pro Ile Lys Ile Ala Val Asn Thr

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Tyr Ile Met Leu Ser Leu Asn Lys Val Asn Glu Leu Asp Tyr Ala Trp

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Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Glu Asn Ile Leu Ser Gln Pro Leu Leu Leu

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Leu Pro Asn Phe Asp Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Met Phe Lys Leu Glu

130 135 140

Lys Ile

145

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<211> 626

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 3

Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn His Ile Gln Glu Lys Val

1 5 10 15

Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val

20 25 30

Ser Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg

50 55 60

Val Asn Asp Asn Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr Pro Thr Pro Ser Phe Asn

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Ala Asn Phe Thr

85 90 95

Glu Ala Asn Gln Ile Pro Ile Gly Phe Glu Phe Ser Lys Thr Ala Pro

100 105 110

Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr

115 120 125

Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu

130 135 140

Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile

165 170 175

Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn

180 185 190

Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg

195 200 205

Val Leu Pro Tyr Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Lys Gly Asp Gly

210 215 220

Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ile Gln Pro Arg Leu Arg Asn Thr Thr

245 250 255

Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Ala Lys Phe Ser Gln Gln Tyr

260 265 270

Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asn Lys Asn

290 295 300

Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser

325 330 335

Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val

340 345 350

Val Lys Thr Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu

370 375 380

Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile

385 390 395 400

Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly

405 410 415

Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr

420 425 430

Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys

435 440 445

Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro

450 455 460

Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr

465 470 475 480

Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Lys

485 490 495

Phe Lys Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Asn Leu Met Asn Ser Ser Val

500 505 510

Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg

515 520 525

Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro

530 535 540

Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser

545 550 555 560

Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp

565 570 575

Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu Asn Leu Leu Asn Ser

580 585 590

Thr Lys Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Lys Val

595 600 605

Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Lys Leu His Ile Asp Ile

610 615 620

Thr Asn

625

<210> 4

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA1 N286A

<400> 4

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Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asn Thr Asp Leu Phe Phe Tyr Gln Val Pro

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Gly Asn Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu

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Arg Trp Arg Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys

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Leu Lys Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Ser Tyr Ile Lys Phe Ile Ile

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Pro Ile Leu Ala Gly Gly Lys Val Val Gln Gln Val Ser Met Thr Asn

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Leu Ala Val Asn Leu Tyr Ile Trp Asn Asn Asp Leu Asn Gln Lys Trp

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Thr Ile Ile Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Lys

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210 215 220

Val Arg Val Ser Ser Ser Ala Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu

225 230 235 240

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245 250 255

Arg Asp Lys Thr Lys Val Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asp

260 265 270

Gly Thr Thr Ile Gln Val Phe Asn Ser Asn Gly Gly Asp Ala Gln Ile

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<210> 5

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 5

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Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val

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Ser Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly

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Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg

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65 70 75 80

Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Ala Asn Phe Thr

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Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr

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Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu

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Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile

165 170 175

Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn

180 185 190

Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg

195 200 205

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Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser

325 330 335

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405 410 415

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Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys

435 440 445

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 6

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Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Ala Asn Phe Thr

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245 250 255

Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Ala Lys Phe Ser Gln Gln Tyr

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Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asn Lys Asn

290 295 300

Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser

325 330 335

Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val

340 345 350

Val Lys Thr Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu

370 375 380

Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile

385 390 395 400

Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly

405 410 415

Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr

420 425 430

Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys

435 440 445

Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro

450 455 460

Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr

465 470 475 480

Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Lys

485 490 495

Phe Lys Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Asn Leu Met Asn Ser Ser Val

500 505 510

Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg

515 520 525

Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro

530 535 540

Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser

545 550 555 560

Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp

565 570 575

Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu Asn Leu Leu Asn Ser

580 585 590

Thr Lys Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Ala Val

595 600 605

Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Lys Leu His Ile Asp Ile

610 615 620

Thr Asn

625

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FLAG標(biāo)簽

<400> 7

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Strep標(biāo)簽

<400> 8

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

catgccatgg gcatccaaaa ttcattaaat gac 33

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cgggatcctt acttgtcgtc atcgtctttg tagtctgggt tactcatagt ccatatc 57

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

tgaataagct ttcagctgaa agaacttttc 30

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cactttggta ccttatattt tttcaagttt ga 32

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gaaaaagggt accaatatag tgatactatt g 31

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

cgtgtcgact taattagtaa tatctatatg c 31

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D4標(biāo)簽

<400> 15

Asp Asp Asp Asp

1

<210> 16

<211> 293

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 16

Met Glu His Tyr Ser Val Ile Gln Asn Ser Leu Asn Asp Lys Ile Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Lys Ala Asp Thr Asn Leu Phe Phe Tyr Gln Val Ala

20 25 30

Gly Asn Val Ser Leu Phe Gln Gln Thr Arg Asn Tyr Leu Glu Arg Trp

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Arg Leu Ile Tyr Asp Ser Asn Lys Ala Ala Tyr Lys Ile Lys Ser Met

50 55 60

Asp Ile His Asn Thr Asn Leu Val Leu Thr Trp Asn Ala Pro Thr His

65 70 75 80

Asn Ile Ser Thr Gln Gln Asp Ser Asn Ala Asp Asn Gln Tyr Trp Leu

85 90 95

Leu Leu Lys Asp Ile Gly Asn Asn Ser Phe Ile Ile Ala Ser Tyr Lys

100 105 110

Asn Pro Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asp Thr Val Ala Arg Asn Leu Lys

115 120 125

Leu Ser Thr Leu Asn Asn Ser Asn Tyr Ile Lys Phe Ile Ile Glu Asp

130 135 140

Tyr Ile Ile Ser Asp Leu Asn Asn Phe Thr Cys Lys Ile Ser Pro Ile

145 150 155 160

Leu Asp Leu Asn Lys Val Val Gln Gln Val Asp Val Thr Asn Leu Asn

165 170 175

Val Asn Leu Tyr Thr Trp Asp Tyr Gly Arg Asn Gln Lys Trp Thr Ile

180 185 190

Arg Tyr Asn Glu Glu Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Phe Asn Thr Ile Leu

195 200 205

Ser Asn Gly Val Leu Thr Trp Ile Phe Ser Asn Gly Asn Thr Val Arg

210 215 220

Val Ser Ser Ser Asn Asp Gln Asn Asn Asp Ala Gln Tyr Trp Leu Ile

225 230 235 240

Asn Pro Val Ser Asp Thr Asp Glu Thr Tyr Thr Ile Thr Asn Leu Arg

245 250 255

Asp Thr Thr Lys Ala Leu Asp Leu Tyr Gly Gly Gln Thr Ala Asn Gly

260 265 270

Thr Ala Ile Gln Val Phe Asn Tyr His Gly Asp Asp Asn Gln Lys Trp

275 280 285

Asn Ile Arg Asn Pro

290

<210> 17

<211> 146

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 17

Met Ser Val Glu Arg Thr Phe Leu Pro Asn Gly Asn Tyr Asn Ile Lys

1 5 10 15

Ser Ile Phe Ser Gly Ser Leu Tyr Leu Asn Pro Val Ser Lys Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Ser Asn Glu Ser Ser Ala Asn Asn Gln Lys Trp Asn Val Glu

35 40 45

Tyr Met Ala Glu Asn Arg Cys Phe Lys Ile Ser Asn Val Ala Glu Pro

50 55 60

Asn Lys Tyr Leu Ser Tyr Asp Asn Phe Gly Phe Ile Ser Leu Asp Ser

65 70 75 80

Leu Ser Asn Arg Cys Tyr Trp Phe Pro Ile Lys Ile Ala Val Asn Thr

85 90 95

Tyr Ile Met Leu Ser Leu Asn Lys Val Asn Glu Leu Asp Tyr Ala Trp

100 105 110

Asp Ile Tyr Asp Thr Asn Glu Asn Ile Leu Ser Gln Pro Leu Leu Leu

115 120 125

Leu Pro Asn Phe Asp Ile Tyr Asn Ser Asn Gln Met Phe Lys Leu Glu

130 135 140

Lys Ile

145

<210> 18

<211> 626

<212> PRT

<213> 肉毒桿菌（Clostridium botulinum）

<400> 18

Met Asn Ser Ser Ile Lys Lys Ile Tyr Asn Asp Ile Gln Glu Lys Val

1 5 10 15

Ile Asn Tyr Ser Asp Thr Ile Asp Leu Ala Asp Gly Asn Tyr Val Val

20 25 30

Arg Arg Gly Asp Gly Trp Ile Leu Ser Arg Gln Asn Gln Ile Leu Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ile Ser Asn Gly Ser Thr Gly Ile Val Gly Asp Leu Arg

50 55 60

Val Asn Asp Asn Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr Pro Thr Pro Ser Phe Asn

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Ile Gln Thr Val Phe Thr Asn Phe Thr

85 90 95

Glu Ala Asn Gln Ile Pro Ile Gly Phe Glu Phe Ser Lys Thr Ala Pro

100 105 110

Ser Asn Lys Asn Leu Tyr Met Tyr Leu Gln Tyr Thr Tyr Ile Arg Tyr

115 120 125

Glu Ile Ile Lys Val Leu Gln His Glu Ile Ile Glu Arg Ala Val Leu

130 135 140

Tyr Val Pro Ser Leu Gly Tyr Val Lys Ser Ile Glu Phe Asn Pro Gly

145 150 155 160

Glu Lys Ile Asn Lys Asp Phe Tyr Phe Leu Thr Asn Asp Lys Cys Ile

165 170 175

Leu Asn Glu Gln Phe Leu Tyr Lys Lys Ile Leu Glu Thr Thr Lys Asn

180 185 190

Ile Pro Thr Asn Asn Ile Phe Asn Ser Lys Val Ser Ser Thr Gln Arg

195 200 205

Val Leu Pro Tyr Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ile Asn Lys Gly Asp Gly

210 215 220

Tyr Ile Arg Thr Asn Asp Lys Asp Leu Ile Gly Thr Leu Leu Ile Glu

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ile Gln Pro Arg Leu Arg Asn Thr Thr

245 250 255

Arg Pro Leu Phe Thr Thr Ser Asn Asp Thr Lys Phe Ser Gln Gln Tyr

260 265 270

Thr Glu Glu Arg Leu Lys Asp Ala Phe Asn Val Gln Leu Phe Asn Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Leu Phe Lys Phe Val Glu Glu Ala Pro Ser Asp Lys Asn

290 295 300

Ile Cys Ile Lys Ala Tyr Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Glu Leu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Val Asn Lys Ala Glu Tyr Tyr Leu Pro Ser

325 330 335

Leu Gly Tyr Cys Glu Val Thr Asn Ala Pro Ser Pro Glu Ser Glu Val

340 345 350

Val Lys Met Gln Val Ala Glu Asp Gly Phe Ile Gln Asn Gly Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Val Val Gly Val Ile Asp Pro Ser Glu Asn Ile Gln Glu

370 375 380

Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Asn Ile Pro Gly Ile

385 390 395 400

Val Asn Asn Asn Pro Phe Tyr Ile Leu Phe Thr Val Asn Thr Thr Gly

405 410 415

Ile Tyr Lys Ile Asn Ala Gln Asn Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ile Tyr

420 425 430

Glu Ala Ile Gly Ser Gly Asn Arg Asn Phe Gln Ser Gly Asn Leu Cys

435 440 445

Asp Asp Asp Ile Lys Ala Ile Asn Tyr Ile Thr Gly Phe Asp Ser Pro

450 455 460

Asn Ala Lys Ser Tyr Leu Val Val Leu Leu Asn Lys Asp Lys Asn Tyr

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Tyr Ile Arg Val Pro Gln Thr Ser Ser Asn Ile Glu Asn Gln Ile Gln

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500 505 510

Asn Ile Ile Asp Asn Leu Asn Ser Thr Gly Ala His Tyr Tyr Thr Arg

515 520 525

Gln Ser Pro Asp Val His Asp Tyr Ile Ser Tyr Glu Phe Thr Ile Pro

530 535 540

Gly Asn Phe Asn Asn Lys Asp Thr Ser Asn Ile Arg Leu Tyr Thr Ser

545 550 555 560

Tyr Asn Gln Gly Ile Gly Thr Leu Phe Arg Val Thr Glu Thr Ile Asp

565 570 575

Gly Tyr Asn Leu Ile Asn Ile Gln Gln Asn Leu His Leu Leu Asn Asn

580 585 590

Thr Asn Ser Ile Arg Leu Leu Asn Gly Ala Ile Tyr Ile Leu Lys Val

595 600 605

Glu Val Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Asn Ile Arg Leu His Ile Asp Ile

610 615 620

Thr Asn

625