本發(fā)明涉及一種基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片及其制備和使用方法，屬于微流體芯片加工設(shè)計(jì)和生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
研發(fā)安全有效的藥物是一個(gè)長期、艱難和昂貴的進(jìn)程。細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中廣泛使用并極為依賴的兩種實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。藥物進(jìn)入臨床前都要通過離體實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物過渡實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)藥物對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物機(jī)體的效應(yīng)，并反復(fù)進(jìn)行藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)的定性和定量預(yù)測(cè)。然而藥物研發(fā)失敗的一個(gè)重要原因便是當(dāng)前用于藥物評(píng)估的模型與人的疾病模型存在無法回避的差異。通常情況下，細(xì)胞培養(yǎng)模式很難模擬人體微環(huán)境，同時(shí)，使用動(dòng)物模型對(duì)正常和疾病的生理過程進(jìn)行分析，它不但昂貴、耗時(shí)，而且存在倫理上的爭(zhēng)論。通過這兩類實(shí)驗(yàn)平臺(tái)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)性藥物在進(jìn)入臨床試驗(yàn)后被淘汰，或藥效低或毒副作用強(qiáng)，導(dǎo)致藥物研發(fā)中人力和物力的巨大浪費(fèi)。器官芯片可以突破細(xì)胞培養(yǎng)和模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限。它是一個(gè)基于多通道流體芯片的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，由多個(gè)模擬人體組織和器官環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)分區(qū)集合而成。在各分區(qū)通過仿生循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行連接。微通道的尺寸可以與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，可以精確地控制微環(huán)境的成分、溫度等因素，盡可能模擬細(xì)胞外基質(zhì)的情況，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可靠性和可操作性。同時(shí)可以設(shè)計(jì)不同的二維或三維結(jié)構(gòu)和精密加工成微電極等器件實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)、定位、有序、圖案化以及檢測(cè)等多種功能。在芯片上模擬生物體的環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)，研究并控制細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的生物學(xué)行為，并在藥物開發(fā)、疾病診斷和治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景。人體器官芯片的研究在國際上尚處于起步階段，但是歐美日等國家已開發(fā)出不同種類的腦芯片、肺芯片、心臟芯片、腎芯片、肝臟芯片、脾芯片、腸芯片等多種器官的芯片，以期用于器官功能模擬和替代動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選等研究。肝臟是人體最重要的解毒器官，也是藥物實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化和代謝的主要器官，構(gòu)建模擬肝臟器官功能和結(jié)構(gòu)的肝臟芯片將給藥物篩選提供良好的平臺(tái)。然而，目前的肝臟芯片類型非常的少，僅有個(gè)別的可以模擬類血管內(nèi)皮屏障和部分微環(huán)境，還是很難實(shí)現(xiàn)肝臟微環(huán)境的系統(tǒng)模擬并廣泛用于藥物篩選的研究中。肝臟本身就是一個(gè)極佳的肝細(xì)胞反應(yīng)器，肝臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單位為肝小葉，其內(nèi)肝細(xì)胞不僅達(dá)到數(shù)量和密度的要求，還呈現(xiàn)極性有序排列；肝臟細(xì)胞處于一種三維環(huán)境中，肝細(xì)胞與其周圍的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞，庫普弗細(xì)胞，及細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用，細(xì)胞間相互作用也有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和功能分化。肝臟內(nèi)血管和膽管系統(tǒng)為肝臟細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，藥物也在肝臟內(nèi)實(shí)現(xiàn)代謝和轉(zhuǎn)化，同時(shí)帶走肝細(xì)胞的代謝廢物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片及其制備和使用方法，該器官芯片模擬了肝臟復(fù)雜的多種微環(huán)境要素，解決了傳統(tǒng)的藥物篩選中使用細(xì)胞和動(dòng)物模型的固有缺陷，解決了現(xiàn)有肝臟細(xì)胞培養(yǎng)體系存在的結(jié)構(gòu)單一，和模擬功能少的缺點(diǎn)，能夠有效進(jìn)行多細(xì)胞的依次定位植入和培養(yǎng)，并進(jìn)行藥物的安全性和有效性評(píng)價(jià)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片，包括位于上層的微脈管系統(tǒng)，中間的類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)和下層的肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，微脈管系統(tǒng)和肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分別設(shè)置于各自的片基上；其中，所述微脈管系統(tǒng)包括由若干阻流柵欄交錯(cuò)布置構(gòu)成的彎曲脈管，所述彎曲脈管兩端分別設(shè)有微脈管進(jìn)口和微脈管出口；所述類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)由多孔膜組成；所述肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)包括細(xì)胞聚集體富集區(qū)和多種細(xì)胞共培養(yǎng)區(qū)，并在兩端分別設(shè)置有培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口和培養(yǎng)系統(tǒng)出口，肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)位于培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口的內(nèi)部區(qū)域設(shè)置有兩個(gè)分流柵欄，其中，細(xì)胞聚集體富集區(qū)由多個(gè)月牙槽狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)月牙槽狀結(jié)構(gòu)上均設(shè)置有若干縫隙，多個(gè)月牙槽狀結(jié)構(gòu)縱向排列成若干列，且該若干列交錯(cuò)布置，所有月牙槽狀結(jié)構(gòu)的開口均朝著培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口。所述片基為聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、玻璃、聚碳酸酯（PC）、聚四氟乙烯、硝酸纖維素、生物膜、硅片的一種或幾種。所述肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)所用的細(xì)胞粘附和培養(yǎng)基質(zhì)為膠原蛋白、纖維蛋白膠、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、BSA蛋白、絲素蛋白、明膠、殼聚糖、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、基質(zhì)膠（Matrigel）、海藻酸鈉、異甲基丙烯酰胺（NIPAM）、聚乙二醇（PEG）或聚乙二醇丙烯酸酯（PEGDA）的一種或幾種，優(yōu)先選擇為膠原蛋白。所述微脈管系統(tǒng)的微脈管入口和微脈管出口通道深度，阻流柵欄高度和彎曲脈管深度均為100μm；阻流柵欄的寬度為20μm，形狀為半圓形倒角，且與肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中月牙槽狀結(jié)構(gòu)的位置相對(duì)應(yīng)；彎曲脈管是圓滑的通道，通道寬度為600μm，彎曲數(shù)為20。所述多孔膜的材料為聚二甲基硅氧烷（PDMS）、Transwell用的PET或PC膜的一種，厚度為10μm，孔徑為0.4，1,3,5,8μm，優(yōu)先選擇孔徑為1μm的PDMS柔性膜。所述肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)系統(tǒng)入口和培養(yǎng)系統(tǒng)出口通道深度，分流柵欄和月牙槽狀結(jié)構(gòu)的高度均為100μm；分流柵欄為圓滑弧形，與進(jìn)口通道對(duì)齊，并等距對(duì)稱布置；月牙槽狀結(jié)構(gòu)的個(gè)數(shù)為80個(gè)，其外圓環(huán)半徑為350μm，內(nèi)圓環(huán)半徑為150μm，月牙槽狀結(jié)構(gòu)上的縫隙為四個(gè)，并均勻發(fā)散排列，其寬度為20μm，深度100μm，內(nèi)圓環(huán)開口直線距離為100μm，月牙槽狀結(jié)構(gòu)相互之間的間隔距離為100μm。一種基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片的制備方法，包括以下步驟：（1）用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和繪制器官芯片的掩膜板，精確繪制各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形；（2）通過微加工技術(shù)，特別是光刻蝕的方法，制備出上下兩層的掩膜，制備出含有微結(jié)構(gòu)和微通道的芯片；（3）將上層的微脈管系統(tǒng)芯片，中間的多孔膜和下層的肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)齊，加壓，并進(jìn)行等離子體鍵合，形成三維立體的微結(jié)構(gòu)和微通道網(wǎng)絡(luò)；（4）通過微脈管進(jìn)口和培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口通道依次種植不同細(xì)胞種類，并進(jìn)行貼壁和三維聚集體培養(yǎng)，并進(jìn)行肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞形貌和功能性（白蛋白分泌，尿素合成，P450酶活性等）評(píng)價(jià)；（5）通過上層和下層通道依次通入藥物進(jìn)行藥物肝臟毒性和藥物活性評(píng)價(jià)（藥物的長期和短期肝臟毒性，以及藥物的IC50值）。在微脈管系統(tǒng)和類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)形成的密閉區(qū)域中種植血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞密度為1x106個(gè)/mL，貼壁培養(yǎng)2~4小時(shí)，形成血管內(nèi)皮細(xì)胞層。在肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)依次種植多種細(xì)胞，肝臟細(xì)胞聚集體首先通過培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口通道進(jìn)入細(xì)胞聚集體富集區(qū)的月牙槽狀結(jié)構(gòu)，并富集生長為三維聚集體生長；多種細(xì)胞共培養(yǎng)區(qū)通過培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口通道種植共培養(yǎng)細(xì)胞種類，共培養(yǎng)細(xì)胞種類包括肝星形細(xì)胞，庫普弗細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞，細(xì)胞密度為1x106個(gè)/mL，貼壁培養(yǎng)2~4小時(shí)。一種基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片的使用方法，：在進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)時(shí)，藥物通過微脈管系統(tǒng)進(jìn)入芯片，然后穿透類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)，進(jìn)入到下層的肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，從而評(píng)價(jià)其肝臟的毒性作用以及進(jìn)行藥物的代謝和轉(zhuǎn)化；或者，藥物也通過培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)口直接進(jìn)入肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞聚集體和共培養(yǎng)細(xì)胞直接進(jìn)行接觸并實(shí)現(xiàn)代謝和轉(zhuǎn)化，并驗(yàn)證藥物的肝臟毒性和藥物活力。本發(fā)明的有益效果是：（1）肝臟芯片構(gòu)建了微脈管系統(tǒng)，并以多孔膜和內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)制備了類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)，有效模擬了肝血竇內(nèi)部的微脈管和內(nèi)皮屏障功能，可以供給營養(yǎng)和氧氣。（2）肝臟芯片通過多縫隙月牙槽設(shè)計(jì)富集肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞聚集體，并進(jìn)行三維聚集體的長期培養(yǎng)，有效實(shí)現(xiàn)肝臟內(nèi)部細(xì)胞的高密度、定位和三維培養(yǎng)，有助于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的信息交流和相互促進(jìn)作用。（3）肝臟芯片通過多縫隙月牙槽設(shè)計(jì)肝細(xì)胞聚集體富集區(qū)域周圍種植其他肝臟種類的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞的共培養(yǎng)，有效模擬了實(shí)際肝臟器官內(nèi)部多樣的細(xì)胞類型和細(xì)胞間的相互作用。（4）肝臟芯片可以實(shí)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的長期培養(yǎng)，并進(jìn)行有效的藥物評(píng)價(jià)應(yīng)用，透明材質(zhì)可以在線監(jiān)測(cè)細(xì)胞、組織和器官的生物學(xué)行為，從而為細(xì)胞-藥物相互作用和藥物篩選提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)。附圖說明圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是微脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是類血管內(nèi)皮屏障系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是肝臟器官多細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖5是圖4中A部位的放大圖；圖6是基于細(xì)胞聚集體的微脈管肝臟芯片的細(xì)胞定位分布情況，（a）為貼壁生長在多孔膜上的血管內(nèi)皮細(xì)胞層，并進(jìn)行了綠色熒光Calcein-AM染...