本發(fā)明涉及中藥提取得到中藥提取物，具體涉及一種經(jīng)過分離提取得到的新的丹酚酸類化合物。

背景技術(shù)：

丹參為唇形科鼠尾草屬植物的根部，性味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效?，F(xiàn)代藥理研究證明，丹參具有擴(kuò)張冠脈、改善微循環(huán)、保護(hù)心臟的作用，能抑制和解除血小板聚集，提高機(jī)體耐缺氧能力以及抗肝炎、抗腫瘤和抗病毒等活性。2001年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所報道了丹參及其同屬植物的水溶性活性成分共計13種酚酸類化合物及其藥理作用(黎蓮娘等人，醫(yī)學(xué)研究通訊，2001年，第30卷，第7期)；2012年，南開大學(xué)藥學(xué)院報道了丹參總酚酸提取物中15種酚酸類化合物，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、L、紫草酸、迷迭香酸及異丹酚酸B/E等(趙洪芝等人《藥物分析雜志》2012年第32卷第4期)。2014年，李偉等報道了丹酚酸U和丹酚酸T的化學(xué)結(jié)構(gòu)(李偉等人Fitoterapia 98(2014)248–253)。國外也對丹參水溶性活性成分進(jìn)行了研究。1999年，美國喬治頓大學(xué)就“丹參酚酸類13個化學(xué)結(jié)構(gòu)抗HIV整合酶和其他病毒”申請并獲得了美國專利，表明丹參是一種極具潛力和開發(fā)價值的藥用植物資源。丹參酚酸類中，還有許多尚未分離的成分，為此，本發(fā)明人經(jīng)過研究，分離出本發(fā)明所述的一種新的丹酚酸化合物，在此命名為化合物W，該結(jié)構(gòu)的化合物及藥理作用迄今尚未見有報道，本發(fā)明對該化合物進(jìn)行了藥效實驗，意外的發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的藥理效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的丹酚酸化合物W。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供含有化合物W的藥物組合物。

本發(fā)明的又一目的是提供化合物W的制備方法。

本發(fā)明的再一目的是提供化合物W在制備治療癌癥化學(xué)預(yù)防、小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的疾病、氧化應(yīng)激介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的疾病至少包括選自下列組中的一種：由缺氧引起的血管舒張功能障礙，缺氧、缺糖和過氧化狀態(tài)引起的體外神經(jīng)細(xì)胞損傷、心腦血管疾病，和急性心肌缺 血、慢性腦供血不足及由心血淤阻引起的心絞痛；所述小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病至少包括選自下列組中的一種：慢性炎癥、帕金森病、阿茲海默癥和多發(fā)性硬化等神經(jīng)退行性疾病。

本發(fā)明涉及的一種具有式(Ⅰ)結(jié)構(gòu)的丹酚酸化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯或溶劑化物：

本發(fā)明的化合物W，經(jīng)過化合物的理化性質(zhì)、利用NMR、MS、ECD等波譜技術(shù)對注射用丹參多酚酸(SAFI)物質(zhì)組中分離得到的新化合物樣品的鑒定，確證了其結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的化合物為性狀：褐色粉末。

本發(fā)明的化合物(c 0.07,MeOH)。

本發(fā)明的化合物HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 741.1426[M+Na]+:(calcd.for C36H30O16Na,741.1439)，得其分子式為C36H30O16，不飽和度為22。

本發(fā)明的化合物1H-NMR(400MHz,CD3OD)：δH 7.68(1H,d,J＝15.7Hz),7.15(1H,d,J＝8.4Hz),6.85–6.55(10H,m),6.45(1H,d,J＝7.7Hz),6.23(1H,d,J＝15.7Hz),5.82(1H,d,J＝4.0Hz),5.17(1H,br.s),5.07(1H,br.s),4.39(1H,d,J＝4.0Hz),3.10(2H,br.t,J＝14.2Hz),2.97(2H,m)。

本發(fā)明的化合物13C-NMR(100MHz,CD3OD)：174.3,172.8,149.0,146.8,146.6,146.1,146.1,145.1,145.1,145.1,143.9,133.7,130.4,129.6,126.6,125.2,121.9,121.8,121.7,118.6,118.5,117.9,117.7,117.1,116.6,116.5,116.5,113.5,88.4,77.1,76.9,57.5,38.5,37.9。

本發(fā)明的化合物ECD(0.03,MeOH)：([θ])250.5nm(-12.7389×104)。

本發(fā)明化合物1H-NMR(400MHz,CD3OD)(Table 1)中低場區(qū)顯示一組反式雙鍵質(zhì)子信號：δH 7.68(1H,d,J＝15.7Hz),6.23(1H,d,J＝15.7Hz)；δH 7.15(1H,d,J＝8.4Hz),6.85–6.55(10H,m),6.45(1H,d,J＝7.7Hz)為苯環(huán)上質(zhì)子信號,1H NMR中還給出δH 5.82(1H,d,J＝4.0Hz),4.39(1H,d,J＝4.0Hz)為一組二氫苯并呋喃環(huán)上質(zhì)子信號；5.17(1H,br.s),5.07(1H,br.s),3.10(2H,br.t,J＝14.2Hz),2.97(2H,m)顯示兩組-CH(O-)-CH2-信號。13C-NMR(100MHz,CD3OD)(Table 1)中低場區(qū)174.3,172.8為羧基或酯基碳信號，δC 110～150區(qū)間顯示26個碳信號，除去一對反式雙鍵碳信號δC 143.9,116.5外，還存在24個碳信號，提示可能存在4個苯環(huán)，其中δC 149.0,146.8,146.6,146.1,146.1,145.1,145.1,145.1為8個鄰二氧取代芳香碳信號，說明4個苯環(huán)均為鄰二氧取代。結(jié)合氫譜，δC 88.4,57.5為二氫苯并呋喃環(huán)上碳信號。13C-NMR高場區(qū)還顯示2個連氧碳信號δC 77.1,76.9。1H-NMR和13C-NMR核磁數(shù)據(jù)與丹酚酸B基本一致[3]。但該化合物δC 77.1(C-8″),76.9(C-8″′)表明C-8″,C-8″′位為S構(gòu)型[1]。1H-NMR中δH 5.82(1H,d,J＝4.0Hz,H-7′),4.39(1H,d,J＝4.0Hz,H-8′)的二者的耦合常數(shù)為4.0Hz，說明兩個次甲基為反式構(gòu)型(7′S,8′S or 7′R,8′R)[2]。本發(fā)明化合物的ECD(0.03,MeOH)([θ])250.5nm(-12.7389×104)說明C-7′位為R構(gòu)型[2]。

HMBC譜中δH7.15(1H,d,J＝8.4Hz,H-6)與δC 126.6(C-2),143.9(C-7),145.2(C-4)相關(guān)；δH 7.68(1H,d,J＝15.7Hz,H-7)與δC 117.1(C-8),121.9(C-6),126.6(C-2),168.5(C-9)相關(guān)；δH 6.23(1H,d,J＝15.7Hz,H-8)與δC 125.2(C-1),168.5(C-9)相關(guān)證明有2-取代咖啡酸基片段存在；δH 6.76(1H,br.s,H-2′)與δC 88.4(C-7′),118.5(C-6′),146.8(C-3′)相關(guān)；δH 5.82(1H,d,J＝4.0Hz,H-7′)與δC 57.5(C-8′),113.5(C-2′),118.5(C-6′),133.7(C-1′),172.8(C-9′)相關(guān)；δH 4.39(1H,d,J＝4.0Hz,H-8′)與δC 88.4(C-7′),133.7(C-1′),57.5(C-8′),172.8(C-9′)相關(guān)證明二氫苯并呋喃環(huán)存在，且與B苯環(huán)通過單鍵相連。δH 6.70(1H,br.s,H-2″)與δC38.5(C-7″),121.9(C-6″)相關(guān)；δH 3.10(2H,br.t,J＝14.2Hz,H-7″)與δC117.7(C-2″),121.9(C-6″),130.4(C-1″)相關(guān)證明7″-CH2連在C苯環(huán)上。δH 6.45(1H,br.d,J＝7.7Hz,H-6″′)與δC 37.9(C-7″′),117.9(C-2″′),146.1(C-4″′)相關(guān)；δH 3.10(2H,br.t,J＝14.2Hz,H-7″′)與δC117.9(C-2″′),121.7(C-6″′),129.6(C-1″′)相關(guān)證明7″′-CH2連在D苯 環(huán)上。并通過HSQC和HMBC譜對本發(fā)明化合物進(jìn)行了全歸屬。

但本發(fā)明化合物δC 77.1(C-8″),76.9(C-8″′)表明C-8″,C-8″′位為S構(gòu)型[1]。1H-NMR中δH 5.82(1H,d,J＝4.0Hz,H-7′),4.39(1H,d,J＝4.0Hz,H-8′)的二者的耦合常數(shù)為4.0Hz，說明兩個次甲基為反式構(gòu)型(7′S,8′S or 7′R,8′R)[2]。本發(fā)明化合物的ECD(0.03,MeOH)([θ])250.5nm(-12.7389×104)說明C-7′位為R構(gòu)型[2]。所以確定本發(fā)明化合物為(7′R,8′R,8″S,8″′S)-epi-丹酚酸B，經(jīng)文獻(xiàn)檢索為一新化合物。

所以，通過與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的化合物為一新的丹酚酸類化合物，將其命名為化合物W。

本發(fā)明化合物的NMR信號歸屬：見下表

1H(400MHz)and 13C NMR(100MHz)data for compound 2in CD3OD

a Overlapping peaks

在提取制備過程中，由于本發(fā)明的化合物可能發(fā)生構(gòu)型、構(gòu)象的變化，因此，波譜數(shù)據(jù)可能會有所變化。但由構(gòu)型、構(gòu)象變化所產(chǎn)生的各種異構(gòu)體均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

根據(jù)本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的化合物W還可以利用其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物的形式。本發(fā)明的化合物W的藥學(xué)上可接受的鹽包括常規(guī)的、藥學(xué)上可接受的無機(jī)堿或有機(jī)堿生成的鹽，所述的鹽通過常規(guī)的成鹽方法制備而得。適合的鹽的實例包括鈉、鉀、鋰、鎂、鋁、鈣、鋅等的鹽，或與N,N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普魯卡因、黃連素形成的鹽。下文所提到的化合物W包括式(I)所表示的化合物W及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和可水解的酯。

本發(fā)明的化合物W適宜以藥物組合物的形式給藥。這類組合物可以按照常規(guī)方式與一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑混合使用。若有可能，在治療上將本發(fā)明的化合物W作為原料藥給藥，優(yōu)選活性成分直接作為藥物制劑。在與其他成分相容和對服藥者無害的意義上，載體必須是藥學(xué)上可接受的。

因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明的化合物W的藥物制劑，包括本發(fā)明的化合物W和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，以及含有或不含其他治療和/或預(yù)防性成分。這些制劑適用于口服、胃腸外(包括皮下例如注射或藥庫片；真皮內(nèi)；鞘內(nèi)；肌內(nèi)例如藥庫；靜脈內(nèi)等)、直腸和局部(如舌下)給藥，但最適合的給藥途徑應(yīng)取決于患者的病癥。該制劑可以是單位制劑，并且可以通過用藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任一種方法制備。所有方法包括使本發(fā)明的化合物W與載體結(jié)合的步驟，該載體構(gòu)成一種或多種輔助成分。一般來說，該制劑的制備過程如下：使本發(fā)明的化合物W與液體載體、或微細(xì)粉碎的固體載體、或二者的結(jié)合均勻而緊密的結(jié)合，然后，如果必要的話，使產(chǎn)物成型為所必須的制劑。

通?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的制藥技術(shù)，即可將本發(fā)明的化合物W和藥用載體制得本發(fā)明藥物組合物，這些方法包括混合、制粒和壓制。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的是，可藥用載體或稀釋劑的形式和特性取決于與其混合的活性成分的量、給藥途徑和其他已知因素。在此，所用的藥用載體是可與組合物聯(lián)用給藥的各種有機(jī)或無機(jī)載體，例如：用于固體制劑的賦形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑和包衣劑；也可使用藥用添加劑，例如著色劑和甜味劑。所述藥用載體選自：甘露醇、山梨醇等糖醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、 蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉、一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。

其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括：片劑，例如糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑；膠囊劑，例如硬膠囊劑、軟膠囊劑；口服液；口含劑；顆粒劑；沖劑；丸劑；散劑；膏劑；丹劑；混懸劑；粉劑；溶液劑；注射劑；栓劑；膏劑，例如軟膏劑、硬膏劑；霜劑；噴霧劑；滴劑以及貼劑。本發(fā)明的制劑優(yōu)選：口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等；以及注射劑，如粉針劑、注射液、輸液等。本發(fā)明的制劑最優(yōu)選為片劑。

其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑、粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進(jìn)行包衣。

優(yōu)選的示例賦形劑包括：乳糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉如α-淀粉、糊精、結(jié)晶纖維素、低取代的羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、阿拉伯膠、支鏈淀粉、輕質(zhì)無水硅酸、合成硅酸鋁、硅酸鋁鎂等。

優(yōu)選的示例潤滑劑包括：硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉、硅膠等。

優(yōu)選的示例粘合劑包括：α-淀粉、蔗糖、明膠、阿拉伯膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支鏈淀粉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、吡咯烷酮等。

優(yōu)選的示例崩解劑包括：乳糖、糖、淀粉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、氨烷基鈉、羧甲基淀粉鈉、輕質(zhì)無水硅酸、低取代的羥丙基纖維素等。

優(yōu)選的示例包衣劑包括：羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯醇等。

優(yōu)選的示例著色劑包括：水溶性食用枸櫞黃染料(食用染料例如食用紅No.2和No.3，食用黃No.4和No.5，食用藍(lán)No.1和No.2)；水不溶性色沉染料(例如上述水溶性食用枸櫞黃染料的鋁鹽)；天然染料(例如β-胡蘿卜素、葉綠素、鐵丹)等。

優(yōu)選的示例甜味劑包括：糖精鈉、甘草次酸、阿斯帕坦、甜菊等。

片劑的制備方法一般為，本發(fā)明的化合物W與一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料一起壓制或模制。

本發(fā)明的化合物W還可以制成口服液體制劑，例如水性或油性懸液、溶液、乳劑、糖漿劑等。本發(fā)明的化合物W還可以是干燥產(chǎn)品，使用前用水或其他適合的載體混合。這類液體制劑可以含有常規(guī)的添加劑，可以包括懸浮劑，例如山梨醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪；乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(可以包括食用油)，如杏仁油、分餾椰子油、油性酯、丙二醇或乙醇；以及防腐劑，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。

用于胃腸道外給藥的制劑包括水性與非水性無菌注射液，其中可以含有抗氧化劑、緩沖劑、制菌劑、等滲劑等；以及水性與非水性無菌混懸液，其中可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以存放在單劑量或多劑量容器內(nèi)，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以貯存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在臨時用前加入無菌的液體載體，例如注射用水。

用于直腸給藥的制劑可以是栓劑，含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂、硬脂肪酸或其他甘油酯，或乙二醇。

用于口腔局部、例如頰部或舌下給藥的制劑包括錠劑，其中在加味的基質(zhì)中包含活性成分，該基質(zhì)例如蔗糖和阿拉伯膠；還包括軟錠劑，其中在基質(zhì)中含有活性成分，該基質(zhì)可以是明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠。

本發(fā)明的化合物W還可以配制成藥庫制劑。這類長效制劑可以通過植入(如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射給藥。所以，本發(fā)明化合物W可以與適合的聚合物或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂進(jìn)行配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。

根據(jù)本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所涉及的治療包括預(yù)防和既定疾病或癥狀的治療。而且，用于治療所需的本發(fā)明化合物W的量應(yīng)根據(jù)所治療病癥的性質(zhì)和患者條件而異，或遵醫(yī)囑。一般來說，用于成人治療的劑量通常將在0.02-5000mg/天的范圍，優(yōu)選1-1500mg/天。所需劑量可以是單一的劑量或多次的劑量，按適當(dāng)?shù)拈g隔給藥，例如每天給予兩次、三次、四次或更多。根據(jù)本發(fā)明的制劑可以含有0.1-99wt％的活性成分，對片劑和膠囊劑優(yōu)選含有30-95wt％的活性成分，液體制劑優(yōu)選含有3-50wt％的活性成分。

本發(fā)明的化合物是通過如下方法制備的：

(1)提?。簩⒌⑺幉幕蛘叩⑴c其他藥材的混合物進(jìn)行水提，合并提取液用鹽酸調(diào)節(jié)至酸性，放置，過濾，得澄明藥液；

(2)分離：將所述步驟(1)中所得藥液經(jīng)水稀釋后過聚酰胺柱層析，以碳酸氫鈉溶液洗脫并收集，調(diào)PH值至酸性后再過大孔吸附樹脂，以乙醇溶液洗脫，回收乙醇后冷凍、靜置并過濾，濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0—6.5，冷凍干燥，即得丹參多酚酸提取物；

(3)純化：將所述步驟(2)所得丹參多酚酸提取物用流動相溶解配置成樣品溶液，使用高壓制備液相色譜儀進(jìn)行初步分離得到含有所述化合物W的組合物；然后將分離所得組合物，再使用高壓制備液相色譜儀經(jīng)過先后兩步純化得到所述的目標(biāo)化合物化合物W；其中，色譜填料為C18反相硅膠柱，洗脫液為初步分離和第一步純化使用乙腈-水-甲酸，第二步純化使用甲醇：乙腈：水：甲酸，進(jìn)行等度洗脫或梯度洗脫，檢測波長288nm或254nm，；用高效液相色譜監(jiān)測洗脫過程，收集含有化合物W的洗脫液，濃縮后得所述化合物W。

所述步驟(1)中，將所述丹參藥材或者丹參與其他藥材的混合物切成飲片；所述水提步驟為加入4-8倍藥材量體積的水，煎煮提取三次，每次0.5-3h，濾過；藥渣繼續(xù)用3-6倍量水煎煮0.5-3h，濾過；合并濾液，冷卻，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至酸性，放置2～10小時后過濾；所述步驟(2)中，過大孔吸附樹脂柱，原藥材與大孔吸附樹脂重量比為5:1-1:1，用8-15倍量柱床體積的水沖洗；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，所得濃縮液冷藏12～48小時后過濾；所述大孔吸附樹脂選自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附樹脂中的一種。

所述步驟(3)中的樣品溶液濃度為20-50mg/ml，每次進(jìn)樣量1ml，流速5-10ml/min；初步分離所采用的色譜條件為乙腈：水：甲酸＝25:75:0.1％；第一步純化所采用的色譜條件為乙腈：水：甲酸＝21:79:0.1％，第二步純化所采用的色譜條件為甲醇：乙腈：水：甲酸＝2:20:78:0.1％。

上述制備方法中所述的實驗儀器和試劑如下：

(1)制備型HPLC液相色譜儀：島津L-6AD半制備型高效液相色譜儀

(2)制備型HPLC液相色譜柱：島津ODS(C18250mm*20mm/5μm)色譜柱YMC(C18250mm*20mm/5μm)色譜柱

(3)色譜純試劑：Sigma-Aldrich色譜乙腈(4L)

Sigma-Aldrich色譜甲醇(4L)

實驗方法：將SAFI固體粉末，用流動相溶解，配置成25mg/ml的樣品溶液，

每次進(jìn)樣量1ml，流速10ml/min，檢測波長288nm和254nm均可。

以下通過藥效實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果：

實驗一、本發(fā)明化合物W(16號)醌還原酶誘導(dǎo)活性測試

一實驗?zāi)康模?

鼠肝癌細(xì)胞株Hepa 1c1c7中所能誘導(dǎo)出的醌還原酶(NQO1)很容易被測定。NQO1的誘導(dǎo)往往與二相酶水平的升高有關(guān)，因此在確定化合物的腫瘤化學(xué)預(yù)防作用時二相酶可以作為一種可信的生物指標(biāo)。

針對SAFI物質(zhì)組和從SAFI中分離鑒定的新化合物11號、16號和丹酚酸B，應(yīng)用鼠肝癌細(xì)胞株Hepa 1c1c7，測定其NQO1誘導(dǎo)活性。

二實驗材料：

1.受試品：

2.實驗細(xì)胞株及來源：

鼠肝癌細(xì)胞株Hepa 1c1c7

3.實驗試劑與主要儀器：

小牛血清(購自Hyclone)

胎牛血清(TBD公司)；

四甲基偶氮唑鹽(MTT)美國Sigma(St.Louis,MO)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(上海生工)

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)

三實驗方法：

鼠肝癌細(xì)胞株Hepa 1c1c7的培養(yǎng)：

每孔種104個細(xì)胞，在包含10％(v/v)胎牛血清、0.01％青霉素G、0.15％碳酸氫鈉、0.01％硫酸鏈霉素的培養(yǎng)液中生長24小時，環(huán)境條件為37℃、含5％CO2的潮濕空氣。

藥物的配制

4種化合物均為粉末狀，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1濃度為50mM，化合物SAFI 50mg/ml，儲存于-20℃。臨用時用IMDM培養(yǎng)液將其進(jìn)行稀釋，化合物11-1、16-1及B-1依次稀釋為10μM、20μM，物質(zhì)組SAFI 40μg/ml、20μg/ml。DMSO終濃度<1‰。

結(jié)晶紫法確定細(xì)胞存活率

將已知濃度的待測化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小時。每孔加入DMSO后應(yīng)保證DMSO的終濃度<0.5％(v/v)。之后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200μL 0.2μM結(jié)晶紫(2％乙醇溶液)。常溫下放置染色10分鐘左右，棄掉結(jié)晶紫溶液，用水迅速洗滌3次，將水甩干并用吹風(fēng)機(jī)吹干。每孔加入200μL 0.5％SDS(50％乙醇溶液)，常溫下振蕩5～10分鐘，595nm下測定吸光度。測得的吸光度經(jīng)空白組(沒有種細(xì)胞的孔)進(jìn)行校正，并以相當(dāng)于對照組(沒有處理的孔中細(xì)胞)吸光度的百分率表示細(xì)胞存活率。每組實驗應(yīng)至少獨立重復(fù)3次并取平均值作為最后結(jié)果。

細(xì)胞成活率％＝給藥組OD值的平均值/空白乳組OD值的平均值×100％

4.醌還原酶誘導(dǎo)活性測定

NQO1誘導(dǎo)測定的基本原理是葡萄糖-6-磷酸可在輔因子NADP存在的條件下被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶還原，這時可產(chǎn)生NADPH，NADPH一旦形成便作為一種供電子體使甲萘醌還原為甲萘氫醌，甲萘氫醌可使MTT還原為甲臜，最后可對甲臜進(jìn)行吸光度的測定。NADP和甲萘醌在該催化循環(huán)過程中可再生，所以實驗中不用對其進(jìn)行補(bǔ)充。NQO1誘導(dǎo)劑可增加甲萘氫醌的 產(chǎn)生，從而使更多的甲臜形成。在該實驗中，所采用化合物的濃度要預(yù)先經(jīng)過Hepa 1c1c7細(xì)胞篩選，其濃度應(yīng)滿足使細(xì)胞存活率>55％。

NQO1活性的測定在96孔板上用鼠肝癌細(xì)胞進(jìn)行，過程如下所述：細(xì)胞培養(yǎng)后將已知濃度的待測化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小時。每孔加入DMSO后應(yīng)保證DMSO的終濃度<0.5％(v/v)。在這之后，將培養(yǎng)液倒出并加入含有0.8％(w/v)洋地黃皂苷和2mM EDTA，攪動10分鐘以消化細(xì)胞。在每孔加入“完全反應(yīng)混和液”200μl。該混和液應(yīng)臨用前配置，配置方法如下：將7.5mL 0.5M的Tris-Cl(pH＝7.4)、100mg小牛血清、1mL 1.5％的吐溫20、0.1mL 7.5mM的FAD、1mL 150mM的葡萄糖-6-磷酸、90μL 50mM的NADP、300單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、45mg MTT用去離子水配置成150mL的溶液。在加入混和液之前加入0.2μL甲萘醌(50mM，溶解在乙腈中)。待加入完成后96孔板輕輕振搖5分鐘。將0.3mM雙香豆素溶解在0.5％DMSO和5mM磷酸二氫鉀中(pH＝7.4)吸取50μL加入板上每孔中以終止反應(yīng)。在590nm波長下測定吸光度?？瞻捉M中不含細(xì)胞，對照組為Hepa 1c1c7細(xì)胞和含0.5％DMSO基質(zhì)液但不含待測化合物。待測化合物的NQO1誘導(dǎo)活性的計算方法：先將給藥組和對照組的吸光度減去空白組的吸光度，然后用給藥組的吸光度指比上對照組的吸光度值(IR)作為NQO1誘導(dǎo)活性的指標(biāo)。每組實驗應(yīng)至少獨立重復(fù)3次。

四實驗結(jié)果：

表1 SAFI物質(zhì)組和從中分離的單體化合物的NQO1誘導(dǎo)活性測試結(jié)果

4'-Bromoflavone作為陽性對照藥

六實驗結(jié)論：

在保證細(xì)胞存活率高于55％的情況下，IR大于2即表明測試樣品具有顯著地NQO1誘導(dǎo)作用，IR值介于1和2之間表示具有一定程度的NQO1誘導(dǎo)活性。由上表結(jié)果可知，SAFI物質(zhì)組和 從中分離得到的三個單體化合物在測試濃度下未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，其中化合物1在20μM濃度下表現(xiàn)出了顯著的NQO1誘導(dǎo)活性，化合物2和3表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的誘導(dǎo)活性。

實驗二、本發(fā)明化合物W(16號)清除DPPH自由基作用

一、實驗?zāi)康?

氧化應(yīng)激與體內(nèi)多種疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，如心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。酚酸類化合物因其結(jié)構(gòu)中具有還原性的酚羥基而表現(xiàn)出顯著的抗氧化、清除自由基的活性。本實驗中根據(jù)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)特點，測試其清除DPPH自由基的活性。DPPH·(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)為一種穩(wěn)定的自由基，具有使空余電子轉(zhuǎn)移的作用。當(dāng)存在狀態(tài)為1時，其乙醇或甲醇溶液呈現(xiàn)深紫色，在517nm處有最大吸收。當(dāng)DPPH·溶液加入供氫化合物時，即存在狀態(tài)為2時，由于picryl基團(tuán)存在，呈現(xiàn)淺黃色，紫色減退至消失。

以Z·代表DPPH·，AH代表供氫分子，其主要的反應(yīng)如下：

Z·+AH＝ZH+A·

據(jù)此可檢測自由基被消除的情況。

二、實驗材料

1.受試品：

2.實驗試劑與儀器：

三、實驗方法：

1.DPPH自由基清除實驗

量取1mL 1×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液，并加入1mL試樣液，搖勻，氮氣保護(hù)下，暗處反應(yīng)40min后，用甲醇做參比液，測定反應(yīng)體系在517nm處的吸光度Ai。同時測定1mL DPPH·溶液與等體積甲醇混合液的吸光度Ac及試樣液與等體積甲醇混合液的吸光度Aj。根據(jù)公式(1)計算樣品的清除率，以Vc作為陽性對照重復(fù)上述實驗。

抗氧化活性的大小主要通過DPPH·的減少率來表示：

2.藥物配制方法

4種化合物均為粉末狀，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1濃度為100mM，儲存于-20℃。臨用時用甲醇將其進(jìn)行稀釋，化合物11-1、16-1及B-1依次稀釋為2mM、0.5mM、0.125mM。

四、實驗結(jié)果

1. 3種化合物DPPH自由基清除活性的測試結(jié)果

表1 三種化合物清除DPPH自由基活性測試結(jié)果

Vc為陽性對照藥

五、實驗結(jié)論

化合物2、3在三個測試濃度下(0.125mM，0.5mM，2mM)均具有顯著的DPPH自由基清除活性，其作用強(qiáng)度強(qiáng)于陽性對照藥Vc。化合物1在2mM濃度下具有顯著的DPPH自由基清除活性。SAFI物質(zhì)組因本底顏色干擾過大，在中、高濃度均未得到有效數(shù)據(jù)，在低濃度(0.125mM)表現(xiàn)出了中等強(qiáng)度的DPPH自由基清除活性。

實驗三、本發(fā)明化合物W(16號)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化作用

一、實驗?zāi)康?

小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能成為藥物發(fā)現(xiàn)的一個新的靶點。LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO、促炎癥細(xì)胞因子和活性氧等[1,2]。

本實驗通過建立體外LPS激活N9小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨暮Y選模型，以激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO為指標(biāo)，在4種化合物中篩選對小膠質(zhì)細(xì)胞活化有抑制作用的化合物。

二、實驗材料

1.受試品：

2.實驗細(xì)胞株及來源：

N9：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株。

3.實驗試劑與儀器：

三、實驗方法：

1.小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系N9的培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金屬器械(培養(yǎng)瓶，移液管，溶液瓶等)，均經(jīng)過121℃高壓滅菌30min，以徹底去除污染的LPS。以IMDM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)配制成內(nèi)含5％胎牛血清及50μg/ml 2-巰基乙醇的細(xì)胞培養(yǎng)液。小膠質(zhì)細(xì)胞以約4×105cells/ml的濃度在5％CO2，37℃培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，至第三天貼壁細(xì)胞約占培養(yǎng)瓶底面積50-60％，以胰酶消化貼壁細(xì)胞，傳代至另一培養(yǎng)瓶。以-80℃超低溫冰箱凍存復(fù)蘇后的N9作為第一代，選擇第3-8代N9細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.藥物配制方法

4種化合物均為粉末狀，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1濃度為100mM，化合物SAFI 100mg/ml，儲存于-20℃。臨用時用IMDM培養(yǎng)液將其進(jìn)行稀釋，化合物11-1、16-1及B-1依次稀釋為100μM、30μM、10μM、3μM、1μM，化合物SAFI 100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml。DMSO終濃度<1‰。

3.Griess法檢測化合物對LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用[1,3]

取對數(shù)生長期的N9小膠質(zhì)細(xì)胞，用含5％胎牛血清的新鮮IMDM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至5×105cells/ml，接種于96孔板內(nèi)，100μl/well，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后換成無血清的新鮮培養(yǎng)液，同時進(jìn)行加藥處理。4種化合物設(shè)劑量100、30、10、3、1μM(μg/ml)與LPS共同作用。同時設(shè)空白對照。各給藥組中LPS終濃度為100ng/ml。細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集上清液，Griess比色法檢測上清液中NO2-含量。

4.MTT法檢測化合物對小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞成活率的影響[2]

取對數(shù)生長期培養(yǎng)的N9小膠質(zhì)細(xì)胞，用含5％胎牛血清的新鮮IMDM培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至5×105cells/ml，接種于96孔板內(nèi)，100μl/well，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后換成新鮮培養(yǎng)液，同時進(jìn)行加藥處理。4種化合物設(shè)劑量100、30、10、3、1μM(μg/ml)與LPS共同作用。同時設(shè)空白對照。各給藥組中LPS終濃度為100ng/ml。細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后向細(xì)胞液中加入MTT溶液，10μl/well，將細(xì)胞與0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培養(yǎng)液，然后加入100μl的DMSO溶液，測定其光密度OD值。數(shù)據(jù)處理，利用酶標(biāo)儀相應(yīng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計算每一種樣品6個孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式計算細(xì)胞成活率(cell viability，CV％)。

細(xì)胞成活率％＝樣品組OD值的平均值/空白對照組OD值的平均值×100％

5.統(tǒng)計方法

全部資料采用SPSS(13.0)統(tǒng)計軟件包進(jìn)行檢驗分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，評 價整體性差異，組間均數(shù)采用One-Way ANOVA分析法進(jìn)行方差齊性分析，并結(jié)合Dunnett’s test分析方法進(jìn)行組間比較。多樣本方差齊性檢驗采用Levene檢驗，方差齊性時采用Dunnett’s雙側(cè)T檢驗多組間均數(shù)的差異，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗多組間均數(shù)的差異。

四、實驗結(jié)果

1. 4種化合物對LPS激活N9小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮釋放的影響

實驗結(jié)果顯示，化合物1、2、3作用24h后對LPS活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株N9的NO釋放有抑制作用(見表1)。

表1. 4種化合物對LPS激活N9小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一氧化氮(％)的影響(Mean±SE)

Significance:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001compared to LPS groups.###P<0.001compared to control groups.

2. 4種化合物對LPS活化的N9小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

實驗結(jié)果顯示，測試樣品均不降低LPS活化的N9細(xì)胞存活率(見表2)。

表2. 4種化合物對LPS活化的N9小膠質(zhì)細(xì)胞存活率(％)的影響(Mean±SE)

Significance:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001compared to control groups.

五、實驗結(jié)論

化合物1、2、3能夠顯著抑制LPS刺激的N9小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放，并且在其發(fā)揮抑制作用的濃度范圍內(nèi)不影響小膠質(zhì)細(xì)胞存活率。提示以上樣品能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其可能具有減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如神經(jīng)退行性疾病)的潛在作用。

從以上實驗結(jié)果可知，本發(fā)明化合物具有優(yōu)良的藥理效果，和現(xiàn)有技術(shù)相比副作用低，療效好，物理化學(xué)性質(zhì)特別適合開發(fā)成適宜的藥物。

附圖說明

圖1：7個組分分離情況

圖2：Fr.5HPLC色譜圖

15——丹酚酸B；16——16號目標(biāo)化合物W

圖3：Fr.6HPLC色譜圖

15——丹酚酸B；16——16號目標(biāo)化合物W

圖4：對Fr.6進(jìn)行二次制備(色譜條件：甲醇：乙腈：水：甲酸2:20:78:0.1％)，譜圖

圖5：對16號目標(biāo)峰純度驗證，譜圖

圖6為本發(fā)明化合物的質(zhì)譜圖

具體實施方式

以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。

實施例1

化合物W的制備

(1)提取：將丹參藥材加水進(jìn)行水提，方法如下：加入4-8倍藥材量體積的水，煎煮提取三次，每次0.5-3h，濾過；藥渣繼續(xù)用3-6倍量水煎煮0.5-3h，濾過；合并濾液，冷卻，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至酸性，放置2-10小時后過濾；

(2)分離：將所述步驟(1)中所得藥液經(jīng)水稀釋后過聚酰胺柱層析，以碳酸氫鈉溶液洗脫并收集，調(diào)PH值至酸性后再過大孔吸附樹脂，其中原藥材與大孔吸附樹脂重量比為5:1-1:1，用8-15倍量柱床體積的水沖洗；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脫，洗脫液濃縮至無醇味，所得濃縮液冷藏12～48小時后過濾；所述大孔吸附樹脂選自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附樹脂中的一種。過濾后的濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0—6.5，冷凍干燥，即得丹參多酚酸提取物；

(3)純化：將所述步驟(2)所得丹參多酚酸提取物用流動相溶解配置成樣品溶液，樣品溶液濃度為20-50mg/ml，使用高壓制備液相色譜儀進(jìn)行初步分離得到含有所述化合物W的混合物；然后繼續(xù)分離所得混合物，再使用高壓制備液相色譜儀經(jīng)過先后兩步純化得到所述的目標(biāo)化合物化合物W；其中，色譜填料為C18反相硅膠柱，每次進(jìn)樣量1ml，流速5-10ml/min；初步分離所采用的色譜條件為乙腈：水：甲酸＝25:75:0.1％；第一步純化所采用的色譜條件為乙腈：水：甲酸＝21:79:0.1％，第二步純化所采用的色譜條件為甲醇：乙腈：水：甲酸＝2:20:78:0.1％。

實施例2

續(xù)實施例1

應(yīng)用制備型HPLC法對樣品溶液進(jìn)行了初步分離，按照色譜峰保留時間和相對分離度將其分為6個目標(biāo)組分。6個組分分離情況如圖1中所示，色譜條件：乙腈：水：甲酸25:75:0.1％。對粗分的到的6個組分(Fr.1，F(xiàn)r.2，F(xiàn)r.3，F(xiàn)r.4，F(xiàn)r.5，F(xiàn)r.6)進(jìn)行分析檢測Fr.5和Fr.6中含有本發(fā)明化合物W(16號)目標(biāo)峰。圖2為Fr.5HPLC色譜圖，圖3為Fr.6HPLC色譜圖；對Fr.6進(jìn)行二次制備(色譜條件：甲醇：乙腈：水：甲酸2:20:78:0.1％)，譜圖見圖4，對16號目標(biāo)峰純度驗證，譜圖見圖5。

實驗材料和方法

1.實驗儀器和試劑

(1)制備型HPLC液相色譜儀：島津L‐6AD半制備型高效液相色譜儀

(2)制備型HPLC液相色譜柱：島津ODS(C18250mm*20mm/5μm)色譜柱

YMC(C18250mm*20mm/5μm)色譜柱

(3)色譜純試劑：Sigma‐Aldrich色譜乙腈(4L)

Sigma‐Aldrich色譜甲醇(4L)

2.實驗方法：將SAFI固體粉末，用流動相溶解，配置成25mg/ml的樣品溶液，每次進(jìn)樣量1ml，流速10ml/min，檢測波長288nm和254nm均可。

實施例3化合物W制劑

取實施例1的化合物W0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。

實施例4化合物W制劑

取實施例1的化合物W0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水1ml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。

實施例5化合物W制劑

取實施例1的化合物W0.5g、微晶纖維素20g、淀粉20g，上述組分混勻后，制粒壓片制備成500片片劑，即得。

實施例6，

將化合物W和以下的堿性物質(zhì)反應(yīng)根據(jù)酸堿中和反應(yīng)的原理形成相應(yīng)的鹽：

鈉、鉀、鋰、鎂、鋁、鈣、鋅等的氫氧化物，N,N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普魯卡因、黃連素。