本發(fā)明涉及中藥化學及醫(yī)藥技術(shù)領域，具體涉及從海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)中得到的一個新化合物、制備方法和藥物用途。

背景技術(shù)：

海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)為天南星科海芋屬植物，主要分布于我國廣東、四川等地，喜生于溪谷濕地或田邊，是著名的壯藥，最早記載于《廣西實用中草藥新選》，其味微苦，大寒，有毒，有解毒退熱，消腫鎮(zhèn)痛之功效。臨床多用于治療鉤端螺旋體病、毒蛇咬傷等，也可配伍甘草等治療哮喘^[3]。值得關注的是，其根莖在中醫(yī)臨床被用于治療乳腺癌，效果良好，且四川等地民間常用其水煎液口服治療各種癌癥，亦有良好效果。迄今，海芋的化學研究只有2篇文獻見諸報道：Kaur等從卜芥中分離得到一種對人宮頸癌細胞有一點細胞毒活性(IC₅₀＝100μg/mL)的外源凝集素N-acetyl-D-lactosamine。我們利用氣質(zhì)聯(lián)用的方法對其50％乙醇提取物的石油醚部位進行化學研究，鑒定了其中43個化學成分的結(jié)構(gòu)，主要成分為長鏈不飽和脂肪。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一個新化合物的結(jié)構(gòu)及其在制備抗腫瘤藥物中的運用，屬于醫(yī)藥領域。

本發(fā)明目的在于提供一個從海芋中得到的新化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供提取、分離本發(fā)明新化合物的方法。

本發(fā)明的另一目的是上述新化合物在制備抗腫瘤的藥物方面的用途。

本發(fā)明的目的通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)。

發(fā)明人從尖尾芋中分離得到一個新化合物，其結(jié)構(gòu)如附圖1所示。

該新化合物從尖尾芋中分離得到，其方法包括以下步驟：

(1)取海芋根莖，用溶劑提取，回收提取液，得到稠浸膏。

(2)將稠浸膏經(jīng)過大孔樹脂、正相和反相以及凝膠色譜層析分離，得到目標化合物。

提取溶劑可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶劑以及任意比例混合的醇水溶劑，優(yōu)選5％-100％的含水甲醇或乙醇。提取方法可以是煎煮、回流、冷浸、滲漉、微波提取或超聲提取，優(yōu)選是回流和超聲提取。

提取液濃縮后可通過極性或非極性大孔吸附樹脂，用水洗去雜質(zhì)，用含水低于95％的甲醇或乙醇進行洗脫，將含有目標化合物1和2的洗脫液進行濃縮，得 到精制液。也可以用正相和反相硅膠，優(yōu)選反相硅膠，用洗脫液洗脫，收集含有目標化合物1和2的濃縮，分別得到精制液。

濃縮后的精制液分別可在硅膠、氧化鋁等正相吸附材料中進行色譜分離，也可在硅烷鍵合硅膠、含有氰基或氨基的硅烷鍵合硅膠等反相材料中進行色譜分離，收集含有目標化合物的洗脫液，洗脫液重結(jié)晶或蒸干溶劑后分別得到該新化合物。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該化合物對腫瘤細胞具有顯著的抑制生長作用。

附圖說明

附圖1.化合物1的結(jié)構(gòu)式

附圖2.化合物1的HMBC譜

具體實施例

實施例1.新化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide的制備。

干燥海芋根莖粉末4kg，用50％的含水乙醇提取三次，每次10升，合并提取液，提取液過濾，濾液減壓回收溶劑，得稠浸膏200g。稠浸膏用D101柱層析進行分離，分別用水、20％和40％含水乙醇進行洗脫，40％含水乙醇洗脫液減壓回收溶劑，得稠浸膏35g。該稠浸膏用正相硅膠柱層析分離、梯度洗脫，洗脫劑為氯仿-甲醇-水，根據(jù)薄層層析情況分成5個部分(fr.A-fr.E)。fr.B(2.6g)進行反復硅膠和凝膠柱層析分離得到化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide。

實施例2.新化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物1為白色無定型粉末，茴香醛-硫酸顯色顯綠色，以及Ehrlich反應呈陽性提示該化合物含有吲哚基團。

UV光譜在223、280、270和299nm的特征強吸收揭示該化合物含有吲哚基團。

IR光譜在1619、1489、1480cm^-1處有強烈吸收提示該化合物有吲哚苯環(huán)存在，3486cm^-1、1646cm^-1處有強吸收提示有酰胺羰基官能團存在。

由負離子高分辨HR-ESI-MS(m/z 365.1138)推定分子式為C₂₁H₂₀O₅N₂，不飽和度為12。

¹H NMR給出2個芳環(huán)ABX系統(tǒng)，1對反式雙鍵，1個雜環(huán)質(zhì)子，4個活潑氫質(zhì)子，1個亞甲基雙氫質(zhì)子，分別為(δ ppm)：[6.92(d，J＝8.0)，7.15(d d， J＝1.6，8.0)，7.29(d，J＝1.6)]，[7.38(d，J＝8.8)，6.82(d d，J＝2.4，8.8)，7.68(d，J＝2.4)]，[7.48(d，J＝15.6)，6.80(d，J＝15.6)]，8.45(d，J＝3.2)，11.7(s)，9.57(s)，9.31(s)，8.34(t，J＝5.6)，4.68(2H，d，J＝5.6)，提示該化合物含雙取代吲哚和鄰位雙取代苯反式乙稀結(jié)構(gòu)片段。¹³C NMR和DEPT譜給出21個碳，其中有16個芳香碳和烯碳，2個羰基碳，1個甲氧基碳，1個甲乙基碳，1個亞甲基碳；據(jù)HMQC把其碳譜和氫譜化學位移對應起來和文獻數(shù)據(jù)比對，結(jié)合上述顯色反應，紫外和紅外光譜，推斷化合物1含(反式)N-阿魏酸?；鶊F^[12]，6′-羥基吲哚基團；如前所述，化合物1還含有1個羰基(δ(C)190.4)和1個亞甲基((δ(C)46.3，δ(2H)4.68)，HMBC譜(表1，圖2)顯示δ 190.4和δ 166.1兩個羰基均和亞甲基氫相關，所以該亞甲基4.68(2H，d，J＝5.6)連接δ 190.4羰基和(反式)N-阿魏酸?；鶊F中的酰胺基，又δ 190.4羰基和6′-羥基吲哚基團中的2′位質(zhì)子(δ 8.45)相關，并且其中的4′位C(δ 113.1)也和它相關，所以羰基δ 190.4連接于6′-羥基吲哚基團的2′位和亞甲基之間，即乙酮基連接了(反式)N-阿魏酸酰基和6′-羥基吲哚2個化合物1主要結(jié)構(gòu)片段。并如HMBC譜(圖2)所示δ 131.1和A′B′X′自旋系統(tǒng)中的B′質(zhì)子6.82(d d，J＝2.4，8.8)相關，而126.96不和該質(zhì)子相關，δ153.6和A′B′X′自旋系統(tǒng)中3個質(zhì)子7.38(d，J＝8.8)，6.82(d d，J＝2.4，8.8)，7.68(d，J＝2.4)均相關，所以δ 131.05，126.96，153.6分別定位于4′a，7′a，6′位，即證實了該結(jié)構(gòu)片段是6′-羥基吲哚基團。δ 148.3碳和甲氧基質(zhì)子(δ 3.94)相關，但它和ABX自旋系統(tǒng)中的B質(zhì)子(δ 7.15)不相關，所以甲氧基連于6位，δ 148.8碳和ABX自 旋系統(tǒng)中的三個質(zhì)子6.92(d，J＝8.0)，7.15(d d，J＝1.6，8.0)，7.29(d，J＝1.6)均相關，所以該碳定位于7位并連接羥基，即證實了該結(jié)構(gòu)片段是(反式)N-阿魏酸?；鶊F。綜上所述化合物1結(jié)構(gòu)推斷為(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3--(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acry-lamide。該化合物氫譜、碳譜及HMBC譜全歸屬如表1所示。

表1、化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acry-lamide氫譜、碳譜及HMBC譜全歸屬(DMSO-d₆，δ，ppm.O-TMS).

實施例5.新化合物1對腫瘤細胞生長抑制作用

1.材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1儀器

SF-160 B型高速粉碎機(上海中聯(lián)制藥裝備有限公司)；R200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)；QL-9010旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；FA 2104 N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)

1.1.2試藥

二甲亞砜(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；胰蛋白酶(Thermo公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(Thermo公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；超純水(自制)；尖尾芋藥材(2010年4月采自四川)；其余試劑均為分析純(國藥集團化學試劑廠)

1.1.3實驗材料

P-388、HT-29。

1.2實驗方法

1.2.1 MTT法檢測：

1.2.1.2.腫瘤細胞培養(yǎng)和檢測方法：

接板：收集對數(shù)生長期的待篩選細胞(除K-562人骨髓性的白血病細胞外)， 胰蛋白酶消化，吸取適量含細胞的培養(yǎng)液至加樣槽中，加適量空白培養(yǎng)液，用排槍接取加入96孔板中，每孔100μL，5％CO₂，37℃孵育。

加樣：待細胞貼壁后后，加入梯度濃度(孔濃度100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL)供試品，設置5個梯度，每個濃度設4個平行孔，每孔100μL。

檢測：分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT 10uL(0.5g/L)，孵育4-6h，棄去上清，每孔加入DMSO溶液150uL，振蕩15min，待結(jié)晶充分溶解后，在450nm波長處讀取吸光光度(OD)值，計算樣品抑制率(inhibitory rate，IR)，以及腫瘤細胞存活率(survival rate，SR)。

IR＝(空白組OD值-加藥組OD值)/空白組OD值×100％

SR＝(1-IR)×100％

檢測結(jié)果表明新化合物對P-388和HT-29有顯著的抑制作用，IC₅₀分別為2.9±0.3、1.6±0.8(ug/mL)。

以上藥理實驗結(jié)果表明：上述來自中藥海芋得到的新化合物具有顯著的細胞毒活性，因為常規(guī)抗腫瘤化合物的體外活性篩選是以化合物的細胞毒活性來體現(xiàn)的，所以本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，可以與藥用載體混合，制備抗腫瘤藥物。