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一種獲得溫敏雄性不育玉米的方法與流程

文檔序號:11809205閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種獲得溫敏雄性不育玉米的方法,包括如下步驟:使玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的ZmTMS5蛋白的能力,所得所述ZmTMS5蛋白功能降低或喪失的玉米即為所述溫敏雄性不育玉米。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于:所述ZmTMS5蛋白為如下(a)或(b):

(a)氨基酸序列為序列表中序列1所示的蛋白;

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與玉米溫敏雄性不育相關的由序列1衍生的蛋白質。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述方法中,所述使玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的ZmTMS5蛋白的能力是通過如下實現(xiàn)的:向所述玉米的細胞或組織中導入遺傳物質或非遺傳物質,再將導入后的細胞或組織培養(yǎng)成完整植株;

所述遺傳物質為能夠表達核酸酶的DNA環(huán)狀質?;駾NA線性片段或體外轉錄的RNA;所述非遺傳物質為所述核酸酶或表達所述核酸酶的mRNA;所述核酸酶能夠特異性剪切所述ZmTMS5蛋白的編碼基因中的靶標片段。

4.根據(jù)權利要求3所述的方法,其特征在于:所述核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實現(xiàn)基因組編輯的核酸酶。

具體的,所述核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶,所述遺傳物質為如下(a1)或(a2),所述非遺傳物質為如下(a3):

(a1)能轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體;

(a2)由分別轉錄crRNA和tracrRNA的重組載體以及表達所述Cas9蛋白的重組載體構成;

(a3)由所述Cas9蛋白和所述向導RNA組成;

所述向導RNA為由crRNA和tracrRNA通過部分堿基配對結合而成的具有回文結構的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段;

具體的,所述核酸酶為TALEN核酸酶,所述遺傳物質為如下(b1),所述非遺傳物質為如下(b2):

(b1)能表達成對TALEN蛋白的重組載體;

(b2)所述TALEN核酸酶,或能表達所述成對TALEN蛋白的mRNA;

所述TALEN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和Fok I結構域組成;

具體的,所述核酸酶為鋅指核酸酶,所述遺傳物質為如下(c1),所述非遺傳物質為如下(c2):

(c1)能表達成對ZFN蛋白的重組載體;

(c2)所述鋅指核酸酶,或能表達所述成對ZFN蛋白的mRNA;

所述ZFN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和Fok I結構域組成。

5.根據(jù)權利要求3或4所述的方法,其特征在于:所述ZmTMS5蛋白的編碼基因為如下(a1)-(a5)中任一所示DNA分子:

(a1)序列表中序列2所示DNA分子;

(a2)序列表中序列3所示DNA分子;

(a3)序列表中序列4所示DNA分子;

(a4)在嚴格條件下與(a1)-(a3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與玉米溫敏雄性不育相關蛋白的DNA分子;

(a5)與(a1)-(a4)中任一限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且編碼與玉米溫敏雄性不育相關蛋白的DNA分子。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法,其特征在于:所述靶標片段位于所述ZmTMS5蛋白的編碼基因中的任意位置,只要能夠使所述核酸酶特異性切割所述靶標片段從而使所述玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的所述ZmTMS5蛋白的能力即可;

所述核酸酶對所述靶標片段的特異性切割造成插入突變、和/或缺失突變、和/或替換突變。

7.根據(jù)權利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于:所述核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶,所述靶標片段為序列表中序列2所示DNA分子序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列規(guī)則的片段;

N表示A、G、C和T中的任一種,14≤X≤30,且X為整數(shù),NX表示X個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。

8.根據(jù)權利要求7所述的方法,其特征在于:所述靶標片段的序列為序列表中序列5;或

所述遺傳物質為在pBUN411載體的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點之間插入序列表中序列5的第1-20位所示DNA片段后得到的重組質粒。

9.根據(jù)權利要求3-8中任一所述的方法,其特征在于:所述細胞為任何能作為導入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細胞;所述組織為任何能作為導入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織;

具體的,所述細胞為原生質體細胞或懸浮細胞;所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚。

10.根據(jù)權利要求3-9中任一所述的方法,其特征在于:向所述玉米的細胞或組 織中導入所述遺傳物質或所述非遺傳物質的方法為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG誘導原生質體法擊或其他任何導入方法。

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