本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，涉及一種獲得溫敏雄性不育玉米的方法，特別涉及一種利用基因組編輯技術(shù)定點突變玉米溫敏雄性育性相關(guān)基因，獲得玉米溫敏雄性不育材料的方法。

背景技術(shù)：

玉米是一種主要的糧食作物和經(jīng)濟作物，是人類賴以生存的重要谷類作物之一，種植面積遍及世界大部分地區(qū)。2010年，玉米是世界上總產(chǎn)量位居第一的糧食作物(8.44億噸)。

植物通過不同品種間雜交，產(chǎn)生的雜種在生長勢，適應性，抗逆性、產(chǎn)量等方面具有優(yōu)于兩個親本的性狀，這種現(xiàn)象就屬于雜種優(yōu)勢。玉米屬于異花授粉作物，是世界上最早利用雜種優(yōu)勢的作物，雜種優(yōu)勢是提高玉米產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)的重要方法。

玉米生產(chǎn)中利用雜種優(yōu)勢的途徑有：一、通過人工去雄或者機械去雄來產(chǎn)生雜交種，該方法消耗大量的人力、物力和財力，而且存在去雄不及時，不徹底的問題；二、利用細胞質(zhì)雄性不育產(chǎn)生雜交種，例如T型胞質(zhì)雄性不育的育性穩(wěn)定且易恢復，因此在美國利用的不育系多數(shù)是T型。但是科學家忽略了該T型胞質(zhì)雄性不育的使用會導致雜交種胞質(zhì)專一化，從而導致雜交種易受玉米小斑病T小種的?；郧秩?。美國在大面積生產(chǎn)中曾使用T型胞質(zhì)不育系制種，然而1970年，玉米小斑病大面積流行，給美國的玉米生產(chǎn)帶來巨大損失，致使玉米雄性不育育種技術(shù)的應用在生產(chǎn)上處于停滯狀態(tài)，如何尋找一種新的可以利用的雄性不育的方法來充分發(fā)揮玉米的雜種優(yōu)勢是科研工作者亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種獲得溫敏雄性不育玉米的方法。

本發(fā)明所提供的獲得溫敏雄性不育玉米的方法，具體可包括如下步驟：使玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的ZmTMS5蛋白的能力，所得所述ZmTMS5蛋白功能降低或喪失的玉米即為所述溫敏雄性不育玉米。

其中，所述ZmTMS5蛋白為如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列為序列表中序列1所示的蛋白；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與玉米溫敏雄性不育相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

在所述方法中，所述使玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的ZmTMS5蛋白的能力是通過基因組定點編輯技術(shù)實現(xiàn)的。

基因組定點編輯技術(shù)可在靶序列上產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細胞啟動修復機制，通過非同源末端連接(NHEJ)這種不精確的修復方式可以產(chǎn)生基因定點突變。相對于傳統(tǒng)的突變體創(chuàng)制方法，基因定點編輯技術(shù)具有高效率、高精度、高通量等優(yōu)點。

在本發(fā)明中，所述ZmTMS5蛋白的編碼基因可為如下(a1)-(a5)中任一所示DNA分子：

(a1)序列表中序列2所示DNA分子；

(a2)序列表中序列3所示DNA分子；

(a3)序列表中序列4所示DNA分子；

(a4)在嚴格條件下與(a1)-(a3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與玉米溫敏雄性不育相關(guān)蛋白的DNA分子；

(a5)與(a1)-(a4)中任一限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且編碼與玉米溫敏雄性不育相關(guān)蛋白的DNA分子。

其中，序列2為ZmTMS5基因在玉米基因組中的序列，共由4962個核苷酸組成，其中第1-2000位為啟動子區(qū)域，第2001-2290位為5’-UTR，第2291-2270位、第2880-2975位、第3084-3197位、第3375-3443位、第3533-3607位、第4027-4101位為外顯子，第2271-2879位、第2976-3083位、第3198-3374位、第3444-3532位、第3608-4026位為內(nèi)含子，第4102-4413位為3’-UTR，第4414-4962位為終止子區(qū)域。

序列3為ZmTMS5基因的cDNA序列，共由1511個核苷酸組成，其中第1-290位為5’-UTR，第291-1199位為ZmTMS5基因的CDS，第1200-1511位為3’-UTR。

序列4為ZmTMS5基因的CDS，共由909個核苷酸組成。

在所述方法中，所述靶標片段可位于所述ZmTMS5蛋白的編碼基因(基因組序列，如序列2)中的任意位置，只要能夠使所述核酸酶特異性切割所述靶標片段從而使所述玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的所述ZmTMS5蛋白的能力即可。

所述核酸酶對所述靶標片段進行特異性切割，可能會造成插入突變、和/或缺失突變、和/或替換突變。

在實際操作中，根據(jù)需要所述靶標片段既可為一個也可為多個，只要通過所述核酸酶對所述靶標片段的特異性切割使得所述玉米降低或喪失產(chǎn)生有功能的所述ZmTMS5蛋白的能力即可。

在本發(fā)明中，所述核酸酶具體為CRISPR/Cas9核酸酶，所述靶標片段為序列表中序列2所示DNA分子序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規(guī)則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(shù)，N_X表示X個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。在本發(fā)明的一個實施例中，所述功能區(qū)段的序列為序列表中序列5；所述遺傳物質(zhì)為在pBUN411載體的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI的切割位點之間插入序列 表中序列5的第1-20位所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。

在所述方法中，所述細胞可為任何能作為導入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細胞；所述組織可為任何能作為導入受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織；具體的，所述細胞為原生質(zhì)體細胞或懸浮細胞；所述組織為愈傷組織、幼胚或成熟胚。

在所述方法中，向所述玉米的細胞或組織中導入所述遺傳物質(zhì)或所述非遺傳物質(zhì)的方法為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG誘導原生質(zhì)體法擊或其他任何導入方法。

在本發(fā)明中，所述玉米具體為玉米品種HiII。

在本發(fā)明中，所述溫敏雄性不育體現(xiàn)為：在30-35℃的高溫條件下，花粉敗育。具體為：將處于花粉母細胞時期的玉米植株置于30-35℃的高溫處理，經(jīng)此處理所產(chǎn)生的花粉敗育。

本發(fā)明利用基因組編輯技術(shù)定點突變玉米中的育性基因ZmTMS5，獲得了玉米溫敏雄性不育材料。本發(fā)明為充分發(fā)揮玉米的雜種優(yōu)勢提供了新的材料。

附圖說明

圖1為ZmTMS5基因結(jié)構(gòu)示意圖及利用CRISPR/Cas9技術(shù)的靶點的設(shè)定。

圖2為ZmTMS5基因靶位點的gRNAs在玉米原生質(zhì)體中的活性檢測。a為原生質(zhì)體中PCR/RE檢測結(jié)果；b為測序結(jié)果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量(小寫字母為插入的核苷酸)，M1-M4表示4種突變類型。

圖3為用PCR/RE檢測CRISPR介導的玉米品種HiII的ZmTMS5基因突變體以及測序結(jié)果。a為突變體的PCR/RE檢測結(jié)果(其中CK為未做酶切處理的野生型PCR產(chǎn)物)；b為測序結(jié)果，其中，WT表示野生型基因序列，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量(小寫字母為插入的核苷酸)。

圖4為玉米ZmTMS5基因的純合突變體在高溫(30-35℃)下不育的照片。a為tms5純合突變體株系T0-1；b為野生型對照。

圖5為玉米ZmTMS5基因的純合突變體在適溫(22-26℃)下可育的照片。a為tms5純合突變體株系；b為野生型對照。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

pBUN411質(zhì)粒：在文獻“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338 (2014)”中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。該質(zhì)粒可同時用于轉(zhuǎn)錄向?qū)NA和表達Cas9蛋白。

玉米品種HiII：在文獻“Armstrong,C.L.,Green,C.E.Phillips,R.L.Development and availability of germplasm with high type II culture formation response.Maize Genet.Coop.News Lett.65,92–93(1991)”中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。

實施例1、玉米ZmTMS5靶位點的選擇并構(gòu)建敲除載體

一、ZmTMS5靶位點的選擇

ZmTMS5基因座位號是GRMZM2G147727，位于玉米第4條染色體，包含6個外顯子，5個內(nèi)含子，共編碼302個氨基酸，構(gòu)建敲除載體選擇的靶位點位于第1外顯子中(圖1)。ZmTMS5基因在玉米基因組中的序列如序列表中序列2所示，共由4962個核苷酸組成，其中第1-2000位為啟動子區(qū)域，第2001-2290位為5’-UTR，第2291-2270位、第2880-2975位、第3084-3197位、第3375-3443位、第3533-3607位、第4027-4101位為外顯子，第2271-2879位、第2976-3083位、第3198-3374位、第3444-3532位、第3608-4026位為內(nèi)含子，第4102-4413位為3’-UTR，第4414-4962位為終止子區(qū)域。ZmTMS5基因的cDNA序列如序列表中序列3所示，共由1511個核苷酸組成，其中第1-290位為5’-UTR，第291-1199位為ZmTMS5基因的CDS，第1200-1511位為3’-UTR。ZmTMS5基因的CDS序列如序列表中序列4所示，共由909個核苷酸組成。序列2-4均編碼序列表中序列1所示的ZmTMS5蛋白。

利用CRISPR技術(shù)敲除的靶標雙鏈中的一條鏈具有如下結(jié)構(gòu)：5-Nx-NGG-3，PAM(NGG)中的N表示A、T、C和G中的任一種，Nx中的N表示A、T、C和G中的任一種，x＝20。ZmTMS5基因的靶序列如下，帶下劃線的堿基為PAM(原型間隔序列毗鄰基序)。

ZmTMS5-1：TTCCCATGTATGCGCGG(序列5)；

該敲除載體轉(zhuǎn)化玉米后，在gRNA的介導下，Cas9蛋白在靶序列區(qū)域切割，形成DNA雙鏈斷裂，觸發(fā)機體內(nèi)的自我損傷修復機制，細胞自發(fā)修復該缺口的過程中會引入突變(本處“突變”指的是廣義突變，包括插入、缺失、狹義突變等形式，這些突變中絕大多數(shù)為基因功能失活突變)。

上述靶序列ZmTMS5-1含有MscI酶切識別序列(方框內(nèi)的序列)，可以被MscI限制性內(nèi)切酶切割。靶序列區(qū)域被切割后，如果發(fā)生了突變，則MscI酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶MscI切割；如果沒有發(fā)生突變，將可以被限制性內(nèi)切酶MscI切割。

二、重組載體的構(gòu)建

1、用限制性內(nèi)切酶BsaI酶切pBUN411質(zhì)粒，回收約12.5kb的載體骨架，命名為BUN411。

2、根據(jù)設(shè)計的靶位點ZmTMS5-1序列，合成如下帶有粘性末端(下劃線部分)的引物：

ZmTMS5-1F：GGCGTTCCCATGTATGTGGCCACG；

ZmTMS5-1R：AAACCGTGGCCACATACATGGGAA。

3、將ZmTMS5-1F和ZmTMS5-1R進行退火，形成有粘性末端的雙鏈DNA命名為ZmTMS5-1，將其和步驟1中的膠回收產(chǎn)物BUN411連接，得到重組質(zhì)粒pBUN411-TMS5-1。重組質(zhì)粒pBUN411-TMS5-1的結(jié)構(gòu)描述為：將pBUN411質(zhì)粒的兩個限制性內(nèi)切酶BsaI的識別序列之間的片段(約1.2kb)替換為序列表中序列5的第1-20位所示DNA片段后所得的重組質(zhì)粒。

實施例2、轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體及檢測重組載體在原生質(zhì)體中的活性

將實施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBUN411-TMS5-1通過PEG介導的方式轉(zhuǎn)入玉米品種HiII的原生質(zhì)體，然后提取原生質(zhì)體的基因組DNA，用特異引物通過PCR擴增包含靶位點的ZmTMS5基因，然后將含有靶位點ZmTMS5-1的PCR擴增產(chǎn)物用MscI酶切(如果PCR擴增產(chǎn)物有部分條帶不能被切開，說明實施例1中設(shè)計的靶位點有活性)，將不能被限制性內(nèi)切酶切開的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

用于擴增含有靶位點ZmTMS5-1的引物序列如下：

上游引物TMS-1F：CAGCCTAAAGCCCTTCCTCTC(序列2的第2256-2276位)；

下游引物TMS-1R：TGGCTGGGTATGGCGTGATAG(序列2的第2749-2769位的反向互補序列)。

原生質(zhì)體中檢測重組載體活性的酶切結(jié)果見圖2中a，泳道1為轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體，其中含有不能被MscI切開的PCR條帶(大小約為514bp，與預期一致)，說明靶位點ZmTMS5-1有活性；泳道2為野生型對照PCR產(chǎn)物經(jīng)由MscI酶切，可以被MscI完全酶切開；泳道3為未做酶切處理的野生型PCR產(chǎn)物對照。測序(圖2中b)結(jié)果表明靶位點處產(chǎn)生了少量堿基的插入與缺失，證實重組載體pBUN411-TMS5-1在靶位點處進行了基因定點編輯。

實施例3、轉(zhuǎn)化玉米

將實施例1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBUN411-TMS5-1通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法導入玉米品種HiII。以HiII的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，轉(zhuǎn)化后經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得完整再生植株。

提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，用含有靶位點ZmTMS5-1的特異引物對轉(zhuǎn)化含有pBUN411-TMS5-1的基因組DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用MscI單酶切，具體操作參見實施例2。

經(jīng)PCR、酶切檢測后，T0代共獲得30條ZmTMS5-1位點純合突變的植株。部分酶切結(jié)果見圖3中a，圖3中是部分檢測結(jié)果：其中共有6株ZmTMS5-1位點純合突變的植株，如T0-1，T0-4，T0-5，T0-9，T0-12，T0-14(分別對應圖3中a的泳道1、4、5、9、12和14，僅檢測到大小約為514bp的目的條帶)，其余編號植株(分別對應圖3中的泳道2、3、6、7、8、10、11、13、15)為野生型。對上述6株ZmTMS5-1位點純合突變體的測序結(jié)果見圖3中b，4株(T-1，T-4，T-5，T-9)在設(shè)計的靶位點處含有1個堿基的插入，2株(T-12，T-14)含有1bp和27bp堿基的刪除，這些突變都最終改變ZmTMS5基因的閱讀框，使其失去功能，獲得ZmTMS5基因缺失的突變體。

實施例4、tms5純合突變體的花粉育性鑒定

通過繁殖，我們得到了實施例3中tms5純合突變體株系的T1代種子。將這些T1代突變體與野生型HiII玉米種植于溫室中，所有植物被分為兩組，每組中都包含相同數(shù)量的各條突變體株系植株及野生型植株。當植株處于對溫度敏感的花粉母細胞時期，一組進行高溫(30-35℃)處理，另一組進行適溫(22-26℃)處理。

花粉粒中淀粉含量是育種中檢測花粉育性的主要指標，沒有淀粉積累的花粉沒有育性。玉米花粉一般在上午十點左右達到最大散粉量，待tms5純合突變體植株及野生型對照植株揚粉后，用紙袋采集花粉。tms5純合突變體的花粉和野生型對照花粉分別用碘-碘化鉀溶液進行染色，5分鐘后用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

結(jié)果顯示：經(jīng)過高溫(30-35℃)處理的所有tms5純合突變體株系所產(chǎn)生的花粉均敗育(圖4中a是其中T1突變體株系一株植物的花粉染色結(jié)果，用碘-碘化鉀溶液染色后顏色不發(fā)生改變，說明花粉中缺少淀粉積累，花粉敗育)，而野生型對照產(chǎn)生的花粉育性正常(圖4中b是其中野生型株系一株植物的花粉染色結(jié)果，用碘-碘化鉀溶液染色后呈藍黑色，說明有大量淀粉積累，花粉可育)；經(jīng)適溫(22-26℃)處理的所有tms5純合突變體株系所產(chǎn)生的花粉均為可育花粉(圖5中a是其中T1突變體株系另一株植物的花粉染色結(jié)果，用碘-碘化鉀溶液染色后呈藍黑色，說明有大量淀粉積累，花粉可育)，其育性與野生型對照無明顯差異(圖5中b是其中野生型株系另一株植物的花粉染色結(jié)果，用碘-碘化鉀溶液染色后呈藍黑色)。