一種江蘺菜瓊膠寡糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種江蘺菜瓊膠寡糖及其制備方法。 所述江蘺菜瓊膠寡糖是利用蝙蝠弧菌（ Vampirovibrio sp. ）自身代謝合成的瓊膠酶水解江蘺菜瓊膠溶液，獲得聚合度為六的新瓊六糖。制備時(shí)將蝙蝠弧菌菌株接種至產(chǎn)瓊膠酶液態(tài)培養(yǎng)基中，經(jīng)攪拌培養(yǎng)、離心分離獲得瓊膠酶粗酶液，后將瓊膠酶固定化到乙?；哪в竽z顆粒；以固定化瓊膠酶顆粒為催化劑，水解由江蘺菜制得的瓊膠溶液；瓊膠水解液依次經(jīng)超濾、納濾制得江蘺菜瓊膠寡糖，而固定化瓊膠酶顆粒回收繼續(xù)用于下一批瓊膠水解反應(yīng)。
CCTCC M 2013638
20131208
【專利說明】一種江蘺菜瓊膠寡糖及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種江蘺菜瓊膠寡糖及其制備方法，具體涉及一種利用蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.)自身代謝合成的瓊膠酶經(jīng)固定化后,水解由江蘺菜制得的瓊膠溶液，制備瓊膠寡糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]利用生物技術(shù)從海洋生物中尋求具有防病、治病作用的新藥源，“向海洋要藥物”是海洋生物技術(shù)研究和應(yīng)用的重要方面。海藻中存在著大量的具有各種生物活性的多糖類物質(zhì)，這些多糖類物質(zhì)被廣泛的應(yīng)用于生化、臨床、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。如瓊膠具有凝膠性能，大多數(shù)微生物都不能使其降解，被廣泛用做微生物培養(yǎng)基的膠凝劑；瓊膠類硫酸多糖對B-型流感病毒、腮腺炎病毒和腦膜炎病毒等有抑制作用。瓊膠寡糖(Agaro-oligosaccharide, AOS)是瓊膠多糖經(jīng)水解后聚合度為2?10的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，主要由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成,包括瓊寡糖(Agaroligo saccharides)和新瓊寡糖(Neoagarooligo-saccharides)兩個(gè)系列。瓊膠寡糖具有多種生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、增強(qiáng)免疫和保濕美白等，因此可廣泛地應(yīng)用于藥品、保健品、食品添加劑、飼料添加劑和化妝品等領(lǐng)域。
[0003]采用傳統(tǒng)的酸水解法降解瓊膠時(shí)，反應(yīng)條件劇烈，工藝條件難以控制，活性物質(zhì)易被破壞。而瓊膠酶作為一種有催化活性的蛋白質(zhì)，具有催化效率高、底物專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)，逐漸取代了酸水解。然而，由于瓊膠酶的菌株大多數(shù)來源于海洋，受海洋特殊生長環(huán)境的影響，這些菌種產(chǎn)酶性狀不穩(wěn)定。因此，尋找一種性狀穩(wěn)定，易于培養(yǎng)的高效產(chǎn)瓊膠酶菌株成為整個(gè)問題的關(guān)鍵，具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0004]本發(fā)明利用從鮑魚腸道分離獲得的蝙蝠弧菌(5/7.)，接種至產(chǎn)瓊膠酶特定液體培養(yǎng)基中，通過該菌自身代謝合成瓊膠酶；后采用多點(diǎn)聯(lián)接固定化技術(shù)將瓊膠酶固定到乙?；哪в竽z顆粒上；以固定化瓊膠酶顆粒為催化劑，水解由江蘺菜制得的瓊膠溶液；瓊膠水解液后依次經(jīng)超濾、納濾制得江蘺菜瓊膠寡糖。


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有加工技術(shù)上的不足和存在的問題，提供一種江蘺菜瓊膠寡糖及其制備方法，通過特定產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基發(fā)酵獲得高活性瓊膠酶粗酶液，采用多點(diǎn)聯(lián)接固定化技術(shù)將瓊膠酶固定到乙?；哪в竽z顆粒上制備可反復(fù)使用的催化劑，對由江蘺菜制得的瓊膠溶液進(jìn)行批次水解，制備獲得江蘺菜瓊膠寡糖。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
所述江蘺菜瓊膠寡糖是利用蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.) f jfst-2013001自身代謝產(chǎn)生的瓊膠酶經(jīng)固定化后水解江蘺菜瓊膠溶液，獲得聚合度為六的新瓊六糖；
所述的蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.) f jfst-2013001為從市售鮑魚腸道中分離篩選出的產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌，該菌已于2013年12月8日在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏編號為CCTCC M 2013638。
[0006]本發(fā)明所述江蘺菜瓊膠寡糖的制備方法如下: (1)瓊膠酶粗酶液制備:將蝙蝠弧菌(Vampirovibr1sp.)fjfst-2013001從斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)得種子液，將種子液接種至液體培養(yǎng)基中(接種量為6%)，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm下發(fā)酵48h，發(fā)酵液離心得上清液即為粗酶液；
(2)瓊膠溶液制備:江蘺菜原料經(jīng)清洗、浸泡，充分吸水后用濃度為10wt%的NaOH溶液80°C下處理6h，后經(jīng)清水漂洗后置于濃度為0.10wt%的似(:102溶液中酸化漂白，浙干后經(jīng)煮膠、粗濾、精濾處理，后經(jīng)板式換熱器冷卻至55°C，即制得瓊膠溶液；
(3)瓊膠酶粗酶液固定化:乙?；哪в竽z顆粒浸泡在步驟(I)制備的粗酶液中，室溫下低速攪拌24h，加入少量的NaBH4后繼續(xù)攪拌0.5h使瓊膠酶固定在魔芋膠顆粒上，之后用0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)沖洗固定好瓊膠酶的魔芋膠顆粒，并在4°C下保存?zhèn)溆茫?br> (4)瓊膠水解:以步驟(3)制備的固定化瓊膠酶為催化劑，以步驟(2)制備的瓊膠溶液為反應(yīng)底物，55 °C下水解反應(yīng)50h，攪拌速度150rpm，反應(yīng)pH控制在8.0±0.5 ;
(5)膜過濾:步驟(4)水解反應(yīng)液經(jīng)20目鋼絲網(wǎng)過濾，瓊膠酶顆粒繼續(xù)用于下一批瓊膠水解反應(yīng)，濾液依次經(jīng)超濾、納濾制得江蘺菜瓊膠寡糖。
[0007]在步驟(I)中所述液態(tài)培養(yǎng)基為:瓊脂粉2.5-3.0g/L，牛肉膏1.0?2.0g/L，尿素0.5?1.0g/L,氯化錳0.1?0.2g/L，硫酸鋅0.1?0.3g/L，磷酸二氫鉀0.1?0.2g/L，溶劑為海水，ρΗ7.8?8.2 ;
在步驟(2)中所述煮膠工藝為:將酸化漂白浙干后藻體投至65?70°C清水中(料液比為1:15?20)，熟爛后升溫至90±2°C，開啟打漿，繼續(xù)煮溶約40min直至完全熔化；
在步驟(3)中所述乙?；哪в竽z顆粒的制備方法為:將大小為Imm3的魔芋膠顆粒浸泡在濃度為6mg/mL的NaBH4堿溶液(NaOH濃度為0.16M)中，然后添加一定量的縮水甘油，室溫下攪拌18h用離子水洗凈,之后浸入到35mM Na14溶液中Ih,再次用離子水洗凈,于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下突出效果:
1、本發(fā)明采用多點(diǎn)鏈接固定化技術(shù)，將瓊膠酶固定在乙?；哪в竽z顆粒上，對高濃度、高粘度瓊膠溶液進(jìn)行連續(xù)、高效、專一化水解；而且固定化瓊膠酶可多次重復(fù)使用，生產(chǎn)成本低；
2、本發(fā)明采用的蝙蝠弧菌(Vampirovibr1sp.)f jfst-2013001易于培養(yǎng),產(chǎn)酶性狀穩(wěn)定，利用其制備江蘺菜瓊膠寡糖，操作簡便，工藝參數(shù)易于掌握，易于大量推廣使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為江蘺菜瓊膠溶液生產(chǎn)流程圖；
圖2為江蘺菜瓊膠寡糖HPLC圖。

【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0011]實(shí)施例1
1、瓊膠溶液的制備
圖1為瓊膠溶液制備工藝流程；江蘺菜經(jīng)充分清洗后浸入清水中，浸泡4小時(shí)后浙干，按10wt%濃度配制NaOH溶液，加熱至82°C ;將浸泡過的原料置于堿處理液中，保持6小時(shí)；將原料移至漂洗罐中，以清水浸泡洗滌至PH8.0 ;去除洗滌水，并浙干；在濃度為0.10wt%的NaClO2溶液中加H#04調(diào)pH值至3.0，將堿處理后的原料浸于酸化漂白液中，漂白1min ；將浙干后藻體投入15倍質(zhì)量的水中，水溫65°C，使之熟爛，加溫至92°C并開啟打漿，繼續(xù)煮溶40 min直致完全熔化；將熔膠泵送至篩孔為20目的旋轉(zhuǎn)粗器中進(jìn)行粗過濾，去除膠液中較大的雜質(zhì)；圓筒篩的轉(zhuǎn)速控制在60rpm，粗濾液的溫度控制不低于80°C ;粗濾的膠液進(jìn)入板框過濾機(jī)進(jìn)行精濾，保證出口流出的膠液溫度不低于70°C ;精濾使用的濾布為200目，用GZ220型硅藻土作助濾劑；精濾后的膠液由泵送至板式換熱器進(jìn)行快速冷卻；調(diào)節(jié)膠液的流量，保證其冷卻后經(jīng)板式換熱器出口的溫度為50±5°C ;冷卻用水溫度控制在3-5°C范圍內(nèi)。
[0012]、瓊膠酶粗酶液的制備
用接著環(huán)將蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.) f jfst-2013001斜面試管轉(zhuǎn)接至若干裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基pH為7.4，在25°C下140rpm搖床培養(yǎng)24h ；向50L發(fā)酵罐中裝入30L發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C下滅菌20min后接入種子發(fā)酵液，接種量為6% ；所述液態(tài)培養(yǎng)基為:瓊脂粉3.0g/L，牛肉膏1.0g/L，尿素1.0g/L，氯化錳0.lg/L，硫酸鋅0.3g/L，磷酸二氫鉀0.lg/L，溶劑為海水，ρΗ7.8?8.2。發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm下發(fā)酵48h ;發(fā)酵液經(jīng)6000r/min離心得上清液即為粗酶液。
[0013]、瓊膠酶固定化
將20g大小為Imm3的魔芋膠顆粒浸泡在濃度為6mg/mL的NaBH 4堿溶液(NaOH濃度為0.16M)中，然后添加1ml縮水甘油，室溫下攬祥18h后，用尚子水洗凈，之后浸入到35mMNa14溶液中l(wèi)h，再次用離子水洗凈；之后將上述乙?；哪в竽z顆粒浸泡在瓊膠酶粗酶液中，室溫下低速攪拌24h，加入5ml濃度為6mg/mL似8!14溶液后繼續(xù)攪拌0.5h，使瓊膠酶固定在魔芋膠顆粒上，之后用0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)沖洗固定好的瓊膠酶顆粒，并在4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0014]、江蘺菜瓊膠寡糖制備
將20g固定化瓊膠酶顆粒置于50L夾層發(fā)酵容器中，注入濃度為lwt%的瓊膠溶液，開啟攪拌器，控制攪拌速度150rpm，開啟溫度控制系統(tǒng)，控制恒溫55°C，調(diào)節(jié)瓊膠溶液pH8.0，保溫50h ;其后開啟排料口(排料口內(nèi)層裝有20目鋼絲網(wǎng))排出瓊膠水解液，瓊膠水解液依次用0.45 μ m，0.22 μ m濾膜過濾，之后通過10000?50000D超濾膜和300?600D納濾膜，所得濾出液即為江蘺菜瓊膠寡糖；所得的江蘺菜瓊膠寡糖成分的HPLC圖參見圖2，所制備的寡糖HPLC圖只有一個(gè)峰，瓊膠寡糖為一種單一的寡糖存在，通過對比瓊膠寡糖與標(biāo)品的出峰時(shí)間，證明所制瓊膠寡糖為新瓊六糖。
[0015]HPLC檢測方法:使用Waters高效液相色譜儀，分析質(zhì)量百分濃度為1%的新瓊寡糖標(biāo)品(NA4、NA5和NA6)和瓊膠水解產(chǎn)物，檢測器為301型蒸發(fā)光散色檢測器，色譜柱為Asahinpak NH2 P-50 4E柱(4.6mm x 250mm),流動(dòng)相為乙腈/水溶液(75:25 ),柱溫30°C,進(jìn)樣量為20 μ L,流速1.0ml/min。
[0016]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種江蘺菜瓊膠寡糖，其特征在于:所述江蘺菜瓊膠寡糖是利用蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.) f jfst-2013001代謝產(chǎn)生的瓊膠酶經(jīng)固定化后,水解江蘺菜瓊膠溶液，獲得的聚合度為六的新瓊六糖； 所述的蝙蝠弧菌(Vampirovibr1 sp.) f jfst-2013001已于2013年12月8日在中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，保藏編號為CCTCC M 2013638。
2.一種制備如權(quán)利要求1所述的江蘺菜瓊膠寡糖的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)瓊膠酶粗酶液制備:將蝙蝠弧菌(Vampirovibr1sp.)fjfst-2013001從斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)得種子液，將種子液接種至液體培養(yǎng)基中，接種量為6%，發(fā)酵溫度25°C，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm下發(fā)酵48h，發(fā)酵液經(jīng)離心后，取上清液，即為粗酶液； (2)瓊膠溶液制備:江蘺菜經(jīng)清洗、浸泡、充分吸水后，在濃度為10wt%的NaOH溶液中、80°C下浸泡處理6h ;然后經(jīng)清水漂洗后置于濃度為0.10wt%的似(:102溶液中酸化漂白，浙干后經(jīng)煮膠、粗濾、精濾處理，后經(jīng)板式換熱器冷卻至55°C，即制得瓊膠溶液； (3)瓊膠酶粗酶液固定化:將乙?；哪в竽z顆粒浸泡在步驟(I)制備的粗酶液中，室溫下攪拌24h，加入NaBH4后繼續(xù)攪拌0.5h，使瓊膠酶固定在魔芋膠顆粒上，然后用0.1M，PH7.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗固定好瓊膠酶的魔芋膠顆粒，并在4°C下保存?zhèn)溆茫? (4)瓊膠水解:以步驟(3)制備的固定化瓊膠酶為催化劑，以步驟(2)制備的瓊膠溶液為反應(yīng)底物，55 °C下水解反應(yīng)50h，攪拌速度150rpm，反應(yīng)pH控制在7.5-8.5 ； (5)膜過濾:將步驟(4)的水解反應(yīng)液經(jīng)20目鋼絲網(wǎng)過濾，固定好瓊膠酶的魔芋膠顆粒繼續(xù)用于下一批瓊膠水解反應(yīng)，濾液依次經(jīng)超濾、納濾制得江蘺菜瓊膠寡糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的江蘺菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的液態(tài)培養(yǎng)基其組成為:瓊脂粉2.5-3.0g/L，牛肉膏1.0?2.0g/L，尿素0.5?1.0g/L，氯化錳0.1?0.2g/L，硫酸鋅0.1?0.3g/L，磷酸二氫鉀0.1?0.2g/L，溶劑為海水，pH7.8?8.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的江蘺菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述煮膠工藝為:將酸化漂白浙干后的藻體投至65?70°C清水中，料液比為1:15?20,熟爛后升溫至88~92°C，開啟打漿，繼續(xù)煮溶直至完全熔化。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的江蘺菜瓊膠寡糖的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述的乙?；哪в竽z顆粒其制備方法為:將大小Imm3的魔芋膠顆粒浸泡在濃度為6mg/mL的NaBHJ^溶液中，其中NaOH濃度為0.16M ;然后添加縮水甘油，室溫下攪拌18h，用離子水洗凈，之后浸入到35mM Na14溶液中l(wèi)h，再次用離子水洗凈，于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C08B37/12GK104498563SQ201510019814
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月15日
【發(fā)明者】鄭寶東, 林坤城, 洪清林, 歐洋, 張龍濤 申請人:福建省綠麒食品膠體有限公司