馬鈴薯栽培種J3相關專利申請的交叉引用本申請要求提交于2013年5月2日的美國臨時專利申請序列號。61/818,752的優(yōu)先權權益，該臨時專利申請全文以引用方式并入本文。

背景技術：
本發(fā)明涉及一種名為J3的新型馬鈴薯栽培種，并且涉及該馬鈴薯品種生成的塊莖、植物、植物部分、組織培養(yǎng)物和種子。本發(fā)明還涉及由馬鈴薯栽培種J3制成的食品，例如炸薯條、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪花片和馬鈴薯顆粒。本申請中引用的所有出版物均以引用的方式并入本文。馬鈴薯為世界上第四大最重要的糧食作物以及目前為止最重要的蔬菜。當前美國幾乎每個州均商業(yè)種植馬鈴薯。在美國每年的馬鈴薯產量超過一千八百萬噸，整個世界有3億噸。馬鈴薯的普及主要源自其多功能性以及營養(yǎng)價值。馬鈴薯可新鮮、冷凍或干燥使用，或者可加工成面粉、淀粉或酒精。它們含有復雜的碳水化合物并且富含鈣、煙酸和維生素C。在食品產業(yè)中馬鈴薯的品質受兩個關鍵因素的不利影響：(1)馬鈴薯含有大量的天冬酰胺，其在煎炸或烘培時會快速氧化而形成丙烯酰胺(一種致癌物)的非必需游離氨基酸；以及(2)馬鈴薯十分易受酶促褐變和變色的影響，受酶促褐變和變色是在多酚氧化酶從擦傷的馬鈴薯的受損質體泄露出來時發(fā)生的不期望事件。在細胞質中，該酶使酚氧化，后者然后快速聚合而產生暗色素。塊莖含有大量的磷酸化淀粉，在存儲期間一些磷酸化淀粉降解而產生葡萄糖和果糖。這些還原糖在高于120℃的溫度下加熱時會與氨基酸反應生成包含丙烯酰胺的美拉德產物。參與淀粉磷酸化反應的兩種酶是水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。褐變也因為淀粉部分降解成葡萄糖和果糖而以非酶促的方式觸發(fā)。迄今為止，尚沒有可產生具有低的丙烯酰胺含量、增加的黑斑擦傷耐受性以及降低的衰老甜化的塊莖的馬鈴薯植物品種。因而，需要開發(fā)具有降低水平的毒性化合物的馬鈴薯品種，但不使用未知或外來的核酸。本發(fā)明滿足這種需求。上述的相關領域實例以及與其相關的局限性旨在是示例性的以及非排他性的。在閱讀本說明書后相關領域的其他局限性對本領域技術人員將變得顯而易見。

技術實現(xiàn)要素：
下面的實施例及其各方面與系統(tǒng)、工具以及方法結合描述的，所述系統(tǒng)、工具和方法意在是示例性的，不限制范圍。在多個實施例中，已減少或消除了上述問題中的一者或多者，而其他實施例則針對其他改善。為此，本發(fā)明提供了用核酸序列轉化的新型馬鈴薯品種J3，所述核酸序列是馬鈴薯植物基因組天然的并且不包含外來DNA、農桿菌(Agrobacterium)DNA、病毒標志物或載體骨架序列。更確切地說，插入馬鈴薯品種J3基因組的DNA是馬鈴薯、野生馬鈴薯、與馬鈴薯性親和的植物的天然非編碼多核苷酸，其使參與表達黑斑擦傷、天冬酰胺積聚和衰老甜化的基因沉默。因而，在一個實施例中，本發(fā)明提供一種植物載體，稱為pSIM278，其包含：第一沉默盒，第一沉默盒含有兩個拷貝的DNA片段，所述兩個拷貝的DNA片段以反義取向包含天冬酰胺合成酶-1基因(fAsn1)片段和多酚氧化酶-5基因的3'-非翻譯序列；和第二沉默盒，第二沉默盒含有兩個拷貝的DNA片段，所述兩個拷貝的DNA片段以反義取向包含馬鈴薯磷酸化酶-L(pPhL)基因片段和馬鈴薯R1基因片段。該pSIM1278載體包含：一9,511bp骨架區(qū)，其在植物轉化之前支持植物DNA的維持并且在植物細胞轉化后不轉移進植物細胞中；和一10,147bpDNA插入區(qū)，其包含天然的DNA，在轉化后該天然的DNA穩(wěn)定整合進植物細胞的基因組中。在一不同的實施例中，本發(fā)明提供轉化有本發(fā)明的植物載體的植物細胞。在一另外的實施例中，本發(fā)明提供一種馬鈴薯植物品種，其包含一個或多個轉化有本發(fā)明的載體的細胞。在本發(fā)明的一個方面，該馬鈴薯植物品種表達所述載體的兩個沉默盒中的至少一者，并且所述沉默盒的表達導致天冬酰胺合成酶-1基因和多酚氧化酶-5基因在該轉入雜交親和物種基因的(intragenic)植物的塊莖中下調。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，表達至少一個沉默盒的所述馬鈴薯植物品種的塊莖展現(xiàn)出兩種或更多種期望的性狀，所述性狀不存在于相同品種的未轉化植株的塊莖中。在本發(fā)明的最優(yōu)選的方面中，所述兩種或更多種期望的性狀選自低的天冬酰胺積聚、降低的黑斑擦傷以及降低的熱誘導的丙烯酰胺形成。在本發(fā)明的一個不同方面，該馬鈴薯植物品種表達所述植物DNA載體的兩個沉默盒，并且所述沉默盒的表達導致天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因和二激酶R1基因在該馬鈴薯植物品種的塊莖中下調。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，表達所述植物DNA載體的兩個沉默盒的所述馬鈴薯植物品種的塊莖展現(xiàn)出兩種或更多種期望的性狀，所述性狀不存在于相同品種的未轉化植株的塊莖中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，所述兩種或更多種期望的性狀選自低的天冬酰胺積聚、降低的黑斑擦傷、儲存期間降低的還原糖積聚以及降低的熱誘導的丙烯酰胺形成。在本發(fā)明的一個方面，表達植物DNA載體的兩個沉默盒的馬鈴薯植物品種是AtlanticJ3品種。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了名為J3的馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)種屬的新馬鈴薯栽培種。本發(fā)明因此涉及馬鈴薯栽培種J3、馬鈴薯栽培種J3的塊莖、馬鈴薯栽培種J3的植株、馬鈴薯栽培種J3的種子、由馬鈴薯栽培種J3制成的食品、通過將馬鈴薯栽培種J3自交或通過將馬鈴薯栽培種J3與其他馬鈴薯栽培種雜交生成馬鈴薯植株的方法、以及通過馬鈴薯栽培種J3的突變或轉化而引起的變體形成。因此，任何此類使用栽培種J3的方法均是本發(fā)明的實施例：自交、回交、雜交生產、雜交產生群體等等。使用馬鈴薯栽培種J3作為至少一個親本生成的所有植株在本發(fā)明的范圍內。有利的是，可將該馬鈴薯栽培種用于與其他的、不同的馬鈴薯植株雜交以產生具有優(yōu)異特性的第一代(F1)馬鈴薯雜種塊莖、種子和植株。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了馬鈴薯栽培種J3的單個或多個基因轉化植株。在一個實施例中，該轉移基因可以是顯性的或隱性的等位基因。在一些實施例中，該轉移基因將賦予諸如除草劑抗性、昆蟲抗性、對細菌性、真菌性或病毒性病害的抗性、雄性能育性、雌性能育性、增強的營養(yǎng)品質、均一性以及淀粉及其他碳水化合物的濃度增加、擦傷趨勢降低以及淀粉轉化為糖的速率降低之類的性狀。該基因可以是自然存在的馬鈴薯基因或通過遺傳工程技術、回交或突變而引入的轉基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于馬鈴薯栽培種J3的組織培養(yǎng)物中的可再生細胞。在一個實施例中，該組織培養(yǎng)物將能夠再生具有上述馬鈴薯植物的全部生理和形態(tài)特性的植株，以及能夠再生具有與上述馬鈴薯植株基本相同的基因型的植株。在一些實施例中，這種組織培養(yǎng)物中的可再生細胞將是胚、原生質體、分生組織細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、雌蕊、子葉、下胚軸、根、根尖、花、種子、葉柄、塊莖、芽眼或莖。另外，本發(fā)明提供由本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的馬鈴薯植株。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了由馬鈴薯植株品種AtlanticJ3的塊莖制得的食品。優(yōu)選地，該食品為經熱處理的產品。更優(yōu)選地，該食品為炸薯條、薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪花片或馬鈴薯顆粒。除了上述示例性的方面和實施例以外，通過研究如下說明，另外的方面和實施例將變得顯而易見。附圖說明圖1示出了pSIM1278轉化載體。左邊的載體骨架區(qū)為9,511bp長，在位置9,957bp處開始并在位置19,468bp處結束。該骨架DNA主要由細菌DNA組成，在植物轉化之前該細菌DNA支持DNA插入物的維持。DNA插入區(qū)(右邊)(包括旁側邊界序列)為10,147bp長(從19,469bp到19,660bp以及從1bp到9,956bp)。該DNA插入物僅由天然的DNA組成并且在轉化時穩(wěn)定地整合進馬鈴薯基因組中。圖2提供了插入pSIM1278轉化載體中的DNA插入物中的沉默盒的示意圖。每個沉默盒含有由間隔序列分開的兩個拷貝的二基因片段。包含四個靶標基因(即Asn-1、Ppo-5、Phl和R1)的片段的兩個拷貝的DNA片段作為反向重復插入在兩個會聚啟動子(標為Pro)之間，該啟動子主要在塊莖中有活性。含有所得的沉默盒的植物在塊莖中產生多樣的并且未多聚腺苷酸化的大量RNA分子，其動態(tài)地且有力地使預期的靶基因沉默。該RNA分子的大小通常小于所采用的兩個啟動子之間的距離，因為會聚轉錄導致碰撞轉錄。具體實施方式在隨后的說明和表中，使用了許多術語。為了清晰和一致地理解本說明書和權利要求書(包括給予這些術語的范圍)，提供了以下定義：等位基因。等位基因為基因的一種或多種備選形式中的任一者，這些備選形式與一種性狀或特性相關。在二倍體細胞或生物體中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體上的對應基因座。氨基酸序列。如本文所用，包括從植物分離的、植物天然的或植物中自然存在的，或者以合成方式制備但包含內源對應物的核酸序列的寡肽、肽、多肽或蛋白質以及它們的片段。人為操縱。如本文所用，“人為操縱”意指通過手或通過機械手段或重組手段，例如通過遺傳工程技術，移動、布置、操作或控制植物或植物細胞，以便產生與未經操縱的自然存在的對應物相比具有不同生物學、生物化學、形態(tài)學或生理學表型和/或基因型的植物或植物細胞。無性繁殖。通過從葉切片、莖切片、根切片、塊莖芽眼、匍匐莖、單植物細胞原生質體、愈傷組織等生成整株植株來產生子代，不涉及配子融合。骨架。不包括打算轉移的DNA插入序列的二元載體的核酸序列。回交。回交為育種者反復地將雜種子代返回去與其中一個親本雜交，例如，第一代雜種F1與該F1雜種的親本基因型中的一者雜交。細菌環(huán)腐病。細菌環(huán)腐病是一種由細菌密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibactermichiganense)亞種引起的疾病。細菌環(huán)腐病的名字來源于塊莖內維管束環(huán)的特征性破壞。該環(huán)通常以乳黃色到淺褐色干酪質腐爛出現(xiàn)。在馬鈴薯的外表面，嚴重染病的塊莖可能會顯示出稍微凹陷的干裂區(qū)域。受感染塊莖的維管組織中的細菌環(huán)腐病癥狀較于上述可能較不明顯，僅僅以斷裂的、零星出現(xiàn)的暗色線條或以連續(xù)的泛黃的污點出現(xiàn)。黑斑擦傷。存在于擦傷的塊莖組織中的黑斑是稱為黑色素的顏料引起的，黑色素在細胞損傷后產生并且使組織具有褐色、灰色或黑色外觀。黑色素在苯酚底物和適當?shù)拿敢驗榧毎麚p壞而彼此形成接觸時形成。該損壞不要求破裂的細胞。然而，底物和酶的混合必須出現(xiàn)，通常在組織受到碰撞時。黑斑主要是在剛好在維管環(huán)下面的髓周組織中出現(xiàn)，但可以大到足以包括皮層組織的一部分。邊界樣序列?！斑吔鐦印毙蛄蟹蛛x自所選擇的待修飾的植物物種，或分離自與待修飾的植物物種性親和的植物，并且像農桿菌的邊界序列一樣發(fā)揮功能。也就是說，本發(fā)明的邊界樣序列促進和有利于其所連接的多核苷酸的整合。本發(fā)明的DNA插入物優(yōu)選含有邊界樣序列。DNA插入物的邊界樣序列長度介于5-100bp之間、長度介于10-80bp之間、長度介于15-75bp之間、長度介于15-60bp之間、長度介于15-50bp之間、長度介于15-40bp之間、長度介于15-30bp之間、長度介于16-30bp之間、長度介于20-30bp之間、長度介于21-30bp之間、長度介于22-30bp之間、長度介于23-30bp之間、長度介于24-30bp之間、長度介于25-30bp之間或者長度介于26-30bp之間。DNA插入物左邊界序列和右邊界序列分離自待修飾的植物的基因組和/或對待修飾的植物的基因組而言是天然的。DNA插入物邊界樣序列在核苷酸序列方面與任何已知的農桿菌衍生的T-DNA邊界序列不同一。因而，DNA插入物邊界樣序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個不同于來自農桿菌物種如根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的T-DNA邊界序列的核苷酸。也就是說，本發(fā)明的DNA插入物邊界序列或邊界樣序列與來自農桿菌物種如根癌農桿菌或發(fā)根農桿菌的T-DNA邊界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％序列同一性，但不是100％序列同一性。如本文所用，描述性術語“DNA插入物邊界”和“DNA插入物邊界樣”是可互換的。邊界樣序列可分離自植物基因組并且可經修飾或突變以改變其能夠將核苷酸序列整合進另一核苷酸序列中的效率。其他多核苷酸序列可添加或摻入進本發(fā)明的邊界樣序列內。因而，DNA插入物左邊界或DNA插入物右邊界可經修飾以具有5’-和3’-多克隆位點，或額外的限制性位點。DNA插入物邊界序列可經修飾以增加來自伴隨載體的骨架DNA不整合進植物基因組中的可能性?；旧嫌伞M成?！盎旧嫌赡承┰M成”的組合物局限于包括那些元件，以及局限于不實質地影響本發(fā)明組合物的基本特性和新特性的那些元件。因而，只要組合物不影響本發(fā)明的基本特性和新特性，即不含有不來自于所選擇植物物種或與所選擇的植物物種性親和的植物的外來DNA，則該組合物可視為通過語言“基本上由…組成”表征的本發(fā)明組合物的組分。子葉。子葉為種子葉子的一種類型。子葉含有種子的食物儲藏組織。簡并引物?！昂啿⒁铩睘楹凶銐蚝塑账嶙儺惖墓押塑账?，在與相似但非完全同源的序列雜交時該變異可適應堿基錯配。雙子葉植物。其胚具有兩片子葉的顯花植物。雙子葉的例子包括但不限于煙草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿和大豆)、胡蘿卜、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜屬植物、雛菊和仙人掌。DNA插入物。根據(jù)本發(fā)明，待插入進植物基因組中的DNA插入物包含該植物天然的多核苷酸序列或者具有該植物天然的遺傳元件。在一個例子中，例如，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3的DNA插入物是10,147bp的非編碼多核苷酸，該非編碼多核苷酸對于馬鈴薯、野生馬鈴薯、與馬鈴薯性親和的植物而言是天然的，在轉化后穩(wěn)定整合進植物細胞的基因組中，并且使參與表達黑斑擦傷、天冬酰胺積聚和衰老甜化的基因沉默。DNA插入物優(yōu)選包含兩個表達盒并且插入進稱為pSIM1278轉化載體的轉化載體中。第一表達盒包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)二者的片段，所述片段在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動子與顆粒結合合酶基因(Gbss)的Gbss啟動子之間以反向重復排列。這些啟動子主要在塊莖中有活性。第二表達盒的功能是使淀粉相關基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動子沉默。該表達盒由淀粉相關基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動子的片段構成，所述片段有效連接至與第一表達盒相同的Agp和Gbss啟動子。這些表達盒不含外來DNA，并且僅由來自所選植物物種或來自與所選植物物種性親和的植物的DNA組成。胚。胚是成熟種子內所含的未成熟植株。外來的。關于核酸的“外來的”意指該核酸源自非植物生物體，或者源自與待轉化的植物物種不同的植物，或者不源自與待轉化的植物不可雜交的、不屬于目標植物的物種的植物。根據(jù)本發(fā)明，外來DNA或RNA代表自然存在于真菌、細菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥的遺傳組成中、但不天然存在于待轉化植物中的核酸。因而，外來核酸為編碼例如不由轉化植物自然產生的多肽的核酸。外來核酸不必編碼蛋白質產物。根據(jù)本發(fā)明，所需的轉入雜交親和物種基因的植物是不含有任何整合進其基因組中的外來核酸的植物?；颉Ｈ绫疚乃?，“基因”是指編碼區(qū)并且不包括該區(qū)5’或3’的核苷酸序列。功能基因是與啟動子或終止子有效連接的編碼區(qū)?；蚩衫棉D化或各種育種方法引入進物種的基因組中，無論是從不同物種還是從相同物種引入?；蜣D換的(轉換)?；蜣D換的(轉換)植物是指通過稱為回交的植物育種技術開發(fā)的植物，其中除了通過該回交技術、通過遺傳工程改造或通過突變轉移進一品種中的一個或多個基因外，該品種的基本上所有的所需形態(tài)學和生理學特性得以恢復。還可以轉移一個或多個基因座。遺傳重排。是指可體內以及體外自發(fā)發(fā)生的遺傳元件的重新組合，其引入了遺傳物質的新組織。例如，在植物發(fā)育和有性重組過程中不同染色體基因座處的多核苷酸剪接在一起可在體內自發(fā)發(fā)生。因此，體外通過非自然的遺傳修飾技術的遺傳元件重組近似于也可通過體內有性重組發(fā)生的重組事件。金線蟲。馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)(通稱為金線蟲)是影響馬鈴薯植物的根和塊莖的植物寄生線蟲。癥狀包括植物生長差、萎蔫、水脅迫和營養(yǎng)缺乏。下胚軸。下胚軸是胚或籽苗介于子葉與根之間的部分。因此，其可視為介于苗與根之間的過渡區(qū)。框內。核苷酸三聯(lián)體(密碼子)在植物細胞中翻譯成所需重組蛋白質的新生氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明設想在閱讀框內連接至第二核酸的第一核酸，其中第一核苷酸序列為基因而第二核苷酸為啟動子或類似的調控元件。整合。是指來自所選植物物種、或來自物種與所選植物相同的植物、或來自與所選植物物種性親和的植物的核酸序列插入進所選植物物種的細胞的基因組中?！罢稀笔侵竷H天然的遺傳元件摻入進植物細胞基因組中。為了整合天然遺傳元件，例如通過同源重組，本發(fā)明可“利用”非天然DNA作為這種方法中的一個步驟。因而，本發(fā)明在特定DNA分子的“利用”與特定DNA分子“整合”進植物細胞基因組中之間做了區(qū)分。引入。如本文所用，是指核酸序列通過包括感染、轉染、轉化或轉導在內的方法插入進細胞中。分離的。“分離的”是指與其正常的天然環(huán)境物理分離的任何核酸或化合物。分離的物質可維持在含有例如溶劑、緩沖劑、離子或其他組分的合適溶液中，并且可以是以純化的、或不純化的形式。前導序列?；蛑?或基因5’)的轉錄但未翻譯的序列?；蜃?。基因座可賦予一個或多個性狀，例如雄性不育性、除草劑耐性、抗蟲性、抗病性、蠟質淀粉、改良的脂肪酸代謝、改良的植酸代謝、改良的碳水化合物代謝以及改良的蛋白質代謝。性狀可以例如由通過回交、天然的或誘導的突變引入進品種的基因組中的自然存在的基因賦予，或由通過遺傳轉化技術引入的轉基因賦予?；蜃砂趩蝹€染色體位置處整合的一個或多個等位基因。商品產量。商品產量是直徑介于2到4英寸的所有收獲的塊莖的重量。商品產量以cwt(百分比重量)測量，其中cwt＝100磅。單子葉植物。其胚具有一片子葉的顯花植物。單子葉植物的例子包括但不限于草皮草、玉蜀黍、水稻、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾屬植物、百合、洋蔥和棕櫚樹。天然的?！疤烊坏摹边z傳元件是指天然存在于、起源于或屬于待轉化植物的基因組的核酸。因而，分離自待轉化植物或植物物種的基因組或分離自與待轉化植物物種性親和或可雜交的植物或物種的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子對所述植物物種而言是“天然的”，即原生的。換句話講，天然遺傳元件代表植物育種者可及以通過經典的植物育種改善植物的所有遺傳物質。根據(jù)本發(fā)明天然核酸的任何變體也視為“天然的”。就此而論，“天然的”核酸也可分離自植物或其性親和物種并且經修飾或突變以便所得的變體在核苷酸序列上與分離自植物的未經修飾的、天然核酸具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性。天然核酸變體也可在核苷酸序列上具有少于約60％、少于約55％或少于約50％的相似性。分離自植物的“天然”核酸也可編碼從該核酸轉錄并翻譯的自然存在的蛋白質產物的變體。因而，天然核酸可編碼在氨基酸序列上與在分離該核酸的植物中表達的未經修飾的、天然蛋白質具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％的相似性的蛋白質。天然遺傳元件。根據(jù)本發(fā)明可將“天然遺傳元件”摻入和整合進所選擇的植物物種基因組中。天然遺傳元件分離自屬于所選擇的植物物種的植物或分離自與所選擇的植物物種性親和的植物。例如，摻入進栽培馬鈴薯(Solanumtuberosum)中的天然DNA可源自栽培馬鈴薯的任何基因型或與栽培馬鈴薯性親和的野生馬鈴薯物種(例如S.demissum)的任何基因型。自然存在的核酸。自然存在的核酸存在于所選擇的植物物種的基因組中并且可以是DNA分子或RNA分子。可將通常存在于植物物種的基因組中的限制性位點序列工程改造進外源DNA分子(例如載體或寡核苷酸)中，即使該限制性位點不與該基因組物理分離。因而，本發(fā)明允許合成產生核苷酸序列，例如限制性酶識別序列，只要該序列自然存在于所選擇的植物物種的基因組中或者自然存在于與所選擇的待轉化的植物物種性親和的植物中。有效連接。將兩個或更多個分子以使得它們在組合中在植物細胞中正常發(fā)揮功能的方式組合。例如，當啟動子控制結構基因的轉錄時，則該啟動子有效連接至該結構基因。植物。如本文所用，術語“植物”包括但不限于被子植物和裸子植物如馬鈴薯、番茄、煙草、苜蓿、萵苣、胡蘿卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉蜀黍、草坪草、小麥、水稻、大麥、高粱、燕麥、橡樹、桉樹、胡桃和棕櫚樹。因而，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。如本文所用，單詞“植物”還涵蓋植物細胞、種子、植物子代、繁殖體(無論是通過有性生殖生成的還是通過無性生殖生成的)以及這些中任一者的后代，例如扦插物或種子。植物細胞包括懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物可以處于各種成熟階段并且可以在液體或固體培養(yǎng)中生長，或者在罐子、溫室或田地中的土壤或合適介質中生長。引入的前導序列、尾部序列(trailer)或基因序列在植物中的表達可以是暫時的或永久的?！斑x擇的植物物種”可以是但不限于這些“植物”中的任一者的物種。植物部分。如本文所用，術語“植物部分”(或馬鈴薯植物，或其部分)包括但不限于原生質體、葉、莖、根、根尖、花藥、雌蕊、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、下胚軸、花、塊莖、芽眼、組織、葉柄、細胞、分生組織細胞等等。植物物種。屬于各種官方命名的植物物種的植物群體，其展現(xiàn)出至少某些性親和性。植物轉化和細胞培養(yǎng)。廣義地指將植物細胞進行遺傳修飾并轉移至適當?shù)闹参锱囵B(yǎng)基以進行維持、進一步生長和/或進一步發(fā)育的過程。精確育種。是指通過將核酸，例如分離自所選擇的植物物種、或分離自物種與所選擇的植物相同的另一植物、或分離自與所選擇的植物物種性親和的物種的天然基因或調控元件引入進獨立植物細胞中，并隨后使這些經遺傳修飾的植物細胞再生成整株植物來改良植物。因為沒有未知的或外來的核酸被永久地摻入進植物基因組中，所以本發(fā)明技術利用也可通過常規(guī)植物育種可及的相同遺傳物質。子代。如本文所用，子代包括由兩株馬鈴薯植株雜交生成的F1馬鈴薯植株，其中至少一株植株包括馬鈴薯栽培種J3，并且子代還包括但不限于與回歸親本品系的后續(xù)F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9和F10世代雜交。數(shù)量性狀基因座(QTL)。數(shù)量性狀基因座(QTL)是指在一定程度上控制通常連續(xù)分布的可用數(shù)字代表的性狀的遺傳基因座。重組的。如本文所用，廣義地描述借此可以克隆基因、可以對DNA進行測序以及可制備蛋白質產物的各種技術。如本文所用，該術語還描述已在基因轉移進植物宿主系統(tǒng)的細胞中后產生的蛋白質。再生。再生是指從組織培養(yǎng)物發(fā)育植株。調控序列。是指標準的且本領域技術人員已知的可包括在表達載體中以增加和/或最大化植物系統(tǒng)中所關注基因的轉錄或所得的RNA的翻譯的那些序列。這包括但不限于啟動子、肽輸出信號序列、內含子、多腺苷酸化位點和轉錄終止位點。用于修飾核酸構建體以增加在植物中的表達水平的方法也是本領域眾所周知的(參見例如Rogersetal.,260J.Biol.Chem.3731-38,1985(Rogers等人，《生物化學雜志》，第260卷，第3731-38頁，1985年)；Cornejoetal.,23PlantMol.Biol.567：81,1993)(Cornejo等人，《植物分子生物學》，第567卷，第23期，第81頁，1993年)。在工程改造植物系統(tǒng)以影響蛋白質的轉錄速率時，本領域已知的各種因素(包括調控序列如正向作用或負向作用序列、增強子和沉默子，以及染色質結構)可具有影響。本發(fā)明提供，這些因素中的至少一者可用于工程改造植物以表達所關注的蛋白質。本發(fā)明的調控序列是天然遺傳元件，即分離自所選擇的待修飾的植物物種?？蛇x標記?！翱蛇x標記”通常是編碼賦予某種類型的針對抗生素、除草劑或毒性化合物的抗性的蛋白質的基因，并且用于鑒定轉化事件?？蛇x標記的例子包括編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(spt)基因、將甘露糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖異構酶(pmi)基因、編碼卡那霉素和遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶(nptII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(hpt或aphiv)基因、編碼磺酰脲類除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(als)基因、編碼針對用于抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑如草丁瞵或basta的抗性的基因(例如bar基因)、或本領域已知的其他類似基因。有義抑制。通過在轉基因植物中表達一個或多個額外拷貝的內源基因的全部或部分來減少該基因的表達。比重。如本文所用，“比重”是密度的表現(xiàn)并且為馬鈴薯品質的量度。在塊莖比重與淀粉含量和干物質或總固形物的百分比之間存在高的相關性。較高的比重促成較高的回收率以及較好的加工品品質。T-DNA樣?！癟-DNA樣”序列為分離自所選擇的植物物種、或分離自與所選擇的植物物種性親和的植物，并且與農桿菌物種T-DNA具有至少75％、80％、85％、90％或95％但非100％序列同一性的核酸。T-DNA樣序列可含有一個或多個邊界或邊界樣序列，其各自能使核苷酸序列整合進另一多核苷酸中。總產量?？偖a量是指全部收獲的塊莖的總重量。尾部序列?；蛑?或基因3’)的轉錄但未翻譯的序列。轉錄的DNA。既含有基因又含有與該基因相關的非翻譯前導序列和尾部序列的DNA，其通過前面的啟動子的作用轉錄為單條mRNA。植物細胞的轉化。DNA穩(wěn)定整合進植物細胞基因組中的過程?！胺€(wěn)定”是指多核苷酸在細胞基因組中永久或非暫時的保留和/或由細胞基因組永久或非暫時的表達。因而，穩(wěn)定整合的多核苷酸是這樣一種核苷酸：其為轉化細胞基因組內的固定物并且可以復制和遺傳到該細胞或所得的轉化植株的后續(xù)子代。轉化可使用本領域熟知的各種方法在天然或人工條件下進行。轉化可依靠任何已知的用于將核酸序列插入進原核或真核宿主細胞中的方法，包括農桿菌介導的轉化規(guī)程、病毒感染、晶須法(whiskers)、電穿孔、熱休克、脂質轉染、聚乙二醇處理、顯微注射和粒子轟擊。轉基因。將要插入進宿主基因組中的基因，包含蛋白質編碼區(qū)。在本發(fā)明的上下文中，包含轉基因的元件分離自宿主基因組。轉基因植物。含有至少一個轉基因的經遺傳修飾的植物。變體。如本文所用，“變體”理解為意指偏離特定基因或蛋白質的標準的或給定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。術語“同等型”、“同種型”和“類似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“變體”形式。通過添加、移除或置換一個或多個氨基酸進行變更的氨基酸序列，或核苷酸序列的改變可視為“變體”序列。變體可具有“保守”改變，其中置換的氨基酸具有類似的結構或化學特性，例如用異亮氨酸替代亮氨酸。變體可具有“非保守”改變，例如用色氨酸替代甘氨酸。類似的微小變異還可包括氨基酸缺失或插入或這二者。確定哪個氨基酸殘基可以被置換、插入或缺失的指導可使用本領域熟知的計算機程序如VectorNTISuite(InforMax,MD)軟件找到。藤成熟度。藤成熟度是指植物繼續(xù)利用碳水化合物和進行光合作用的能力。藤成熟度在1至5的范圍內打分，其中1＝死藤，而5＝藤綠色，仍開花。所需性狀插入進馬鈴薯植物的基因組中是特別困難的，因為馬鈴薯是四倍體的、高度雜合的并且對近交衰退敏感。因此，在通過常規(guī)育種進行加工的過程中，很難有效培育出可生成較少丙烯酰胺和較少有害美拉德反應產物的轉基因馬鈴薯植物，所述美拉德反應產物包括N-亞硝基-N-(3-酮基-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺(Wangetal.,ArchToxicol70:10-5,1995(Wang等人，《毒理學文獻》，第70卷，第10-5頁，1995年))、5-羥甲基-2-糠醛(Janzowskietal.,FoodChemToxicol38:801-9,2000(Janzowski等人，《食品與化學品毒理學》，第38卷，第801-809頁，2000年))以及其他具有突變特性的美拉德反應產物(Shibamoto,ProgClinBiolRes304:359-76,1989(Shibamoto，《臨床與生物學研究進展》，第304卷，第359-376頁，1989年))。已經測試了若干方法并且正在進行研究以通過工藝改變、右旋糖減少以及添加劑如天冬酰胺酶、檸檬酸鹽和競爭性氨基酸來減少丙烯酰胺。在整個馬鈴薯產業(yè)中實施工藝改變所需的資本支出將耗費數(shù)百萬美元。除了費用以外，工藝改變具有明顯的缺點，包括與添加劑如天冬酰胺酶或檸檬酸鹽相關的潛在不好的味道。通常，油炸食品制造商在炸薯條加工的過程中添加右旋糖來產生所需的金黃色，但右旋糖還可通過美拉德反應增加丙烯酰胺的形成。在該過程中僅省去右旋糖，會使丙烯酰胺顯著減少；但標志性的金黃色稍后必須通過一些其他方式形成(例如通過添加色素如胭脂樹紅)。替代性色素的使用導致缺少通過那些褐變反應形成的典型味道。使用添加劑來減少像天冬酰胺之類的反應物的另一挑戰(zhàn)是冷凍保存期間發(fā)生的水分遷移，結果是天冬酰胺返回至表面而增加丙烯酰胺。最后，在馬鈴薯擦傷后發(fā)生的變黑影響在加工炸薯條和薯片過程中的品質和回收率。在加工之前必須對損壞和擦傷的馬鈴薯進行修整或不要，從而導致質量挑戰(zhàn)或經濟損失。本發(fā)明的“天然技術”策略通過減少多酚氧化酶-5(PPO-5)(其為造成黑斑擦傷的原因)的表達、天冬酰胺合成酶-1(Asn-1)(其為造成天冬酰胺積聚的原因，天冬酰胺為丙烯酰胺形成的前體)的表達和/或磷酸化酶-L和激酶-R1(它們?yōu)榕c還原糖積聚相關的酶，還原糖通常與氨基酸如天冬酰胺反應，并形成毒性美拉德產物，包括丙烯酰胺)的表達解決了馬鈴薯產業(yè)對改善馬鈴薯農藝特性和營養(yǎng)價值的需要。塊莖中這些基因的部分沉默或完全沉默可降低產生丙烯酰胺的可能性。使用本發(fā)明的天然技術使得能通過僅僅用“天然”遺傳物質轉化有商業(yè)價值的馬鈴薯植物品種而使所需性狀摻入進該馬鈴薯的基因組中，所述“天然”遺傳物質是從馬鈴薯植物或與馬鈴薯植物性親和的植物獲得的遺傳物質，其僅含有非編碼調控區(qū)，沒有任何外來遺傳物質整合進該植物的基因組中。所需的性狀包括對碰撞誘導的黑斑擦傷的高耐受性、丙烯酰胺前體天冬酰胺形成減少以及還原糖積聚減少(伴隨后續(xù)的毒性美拉德產物(包括丙烯酰胺)的積聚降低)、改善的品質和食品顏色控制。這些所需性狀摻入進現(xiàn)有的馬鈴薯品種中不可能通過傳統(tǒng)的育種來實現(xiàn)，因為馬鈴薯為四倍體、高度雜合的，并且對近交衰退敏感。本發(fā)明中所用的非編碼馬鈴薯植物DNA插入序列是馬鈴薯植物基因組天然的并且不含有任何農桿菌DNA。DNA插入物優(yōu)選包含兩個表達盒并且插入進稱為pSIM1278轉化載體的轉化載體中。第一表達盒包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)二者的片段，所述片段在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp啟動子與顆粒結合合酶基因(Gbss)的Gbss啟動子之間以反向重復排列。這些啟動子主要在塊莖中有活性。第二表達盒的功能是使淀粉相關基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動子沉默。該表達盒由淀粉相關基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的啟動子的片段構成，所述片段有效連接至與第一表達盒相同的Agp和Gbss啟動子。這些表達盒不含外來DNA，并且僅由來自所選植物物種或來自與所選植物物種性親和的植物的DNA組成。用于本發(fā)明的有商業(yè)價值的馬鈴薯植物品種是Atlantic。Atlantic植株為中等大小，具有直立的粗莖和輕微膨脹、疏生短柔毛的節(jié)點。其葉為亮到中綠色，葉面光滑，被適度短柔毛，帶突出翼瓣，包括大的不對稱一級葉片以及多個二級和三級葉片。其花具有被短柔毛的綠色錐形萼裂片、淡紫色花冠、橙色花藥和豐富的可育花粉。Atlantic栽培種可抗瘡痂病和黃萎病，抗粉紅芽眼，并且高度抗A型金線蟲、病毒、塊莖網形壞死病和黑斑擦傷。Atlantic的塊莖易于發(fā)生內部熱壞死，尤其是在溫暖干燥季節(jié)的砂質土壤中。在一些生長區(qū)域，較大直徑塊莖(>0.83mm)的空心病可能會很嚴重。塊莖為橢圓形至圓形，并具有輕度到重度的鱗狀網格薯皮、適度淺的芽眼和白色薯肉，并且塊莖休眠期為中等長度。Atlantic具有高產潛力、高比重以及均勻的塊莖大小和形狀，是來源于田地或儲存期極短的用于炸片加工的標準品種(Webb等人，1978)。該品種是可育的，主要生長在東北和東南地區(qū)，專用于生產薯片。本發(fā)明提供了具有重要市場價值的馬鈴薯品種，即Atlantic，其使用轉化載體pSIM1278轉化而成，通過聚合酶鏈反應而不是標記鑒定，并成功繁殖。還提供了由本發(fā)明的馬鈴薯植物品種J3的塊莖制成的食品。馬鈴薯栽培種J3具有由經濟合作與發(fā)展組織(OECD)認證的以下唯一植物品種標識符：使用天然DNA實現(xiàn)的定向基因沉默降低了馬鈴薯植物品種J3的塊莖中靶標基因的RNA轉錄物水平。Asn1和Ppo5基因沉默足以顯著減少丙烯酰胺形成二到四倍而不另外抑制淀粉相關基因激酶R1(R1)和磷酸化酶-L(PhL)。因此，本發(fā)明的轉入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種J3的塊莖摻入了高度期望的性狀，包括較低比率的游離酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺，這與煎炸或烘培后減少的丙烯酰胺形成相關。具體地講，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3的特征在于游離天冬酰胺的含量降低至1/2到少于1/4。此外，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3在儲存期間顯示出淀粉降解為還原糖(葡萄糖和果糖)的延遲。淀粉向糖轉化的削弱還可降低衰老甜化和丙烯酰胺形成并可限制熱誘導的褐變。因此，本發(fā)明的馬鈴薯品種J3在馬鈴薯工業(yè)和食品市場中極具價值，這是因為其塊莖在熱加工后產生的丙烯酰胺大大減少并且不攜帶任何可能有害的外來基因。實例本發(fā)明技術使用天然技術來使天然非編碼DNA整合進所選擇的馬鈴薯植物品種的基因組中以開發(fā)新的轉入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種。該方法包括性狀鑒定、載體設計、載體摻入農桿菌中、選擇受體馬鈴薯品種、植物轉化、開放閱讀框缺少的證據(jù)以及確認新馬鈴薯植物品種僅含有該天然DNA。本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3形成丙烯酰胺的可能性較小，并且與其未轉化的對應物相比蔗糖含量較低。實例1.pSIM1278轉化載體用于本發(fā)明的轉化載體pSIM1278源自pSIM106，pSIM106通過這樣產生：將一0.4kb馬鈴薯植物DNA片段(以GenBank登錄號AY566555保藏)與pCAMBIA1301(CAMBIA，澳大利亞堪培拉市(Canberra,Australia))的一5.9kbSacII-SphI片段連接，該SacII-SphI片段攜帶來自質粒pVS1和pBR322的細菌復制起始區(qū)，以及細菌抗卡那霉素的nptIII基因。將一表達盒作為一2.6kbSacII片段引入該載體骨架中(Rommens等人，2004)，該表達盒包含前接Ubi-3啟動子(Garbarino和Belknap,1994)并且后接Ubi-3終止子的農桿菌ipt基因。將攜帶兩個沉默盒的一天然10kbDNA片段插入進pSIM106的DNA插入物中，得到pSIM1278。該載體用于全部轉化。pSIM1278載體圖譜示于圖1.載體骨架區(qū)為9,511bp，在位置9,957bp處開始并在位置19,468bp處結束。該骨架DNA主要由細菌DNA組成并且在植物轉化之前支持DNA插入物的維持。骨架部分未轉移進植物細胞中。該骨架的各元件在表1中描述。表1實例2.植物DNA插入物及其開放閱讀框(ORF)用于pSIM1278中的DNA插入區(qū)(包括旁側邊界序列)為10,147bp長，從19,469bp到19,660bp以及從1bp到9,956bp。該DNA插入物僅由天然DNA組成并且穩(wěn)定地整合進馬鈴薯基因組中。該DNA插入物及其功能性部分為載體pSIM1278中整合進本發(fā)明的馬鈴薯植物品種中的唯一遺傳物質。該DNA插入物示于下面的圖2和表2中。表2用于構建本發(fā)明的馬鈴薯品系J3的表2所示DNA插入物不激活相鄰基因，并且不會對馬鈴薯植物品種J3的表型造成不利影響。此外，本發(fā)明的馬鈴薯植物品種J3未產生與DNA插入物編碼的開放閱讀框相關的新型蛋白質。實例3.農桿菌菌株和轉染通過精確地缺失超毒力質粒pTiBo542的轉移DNA而發(fā)展出C58衍生的農桿菌菌株AGL1(Lazo等人，1991)。常見重組基因(recA)中的轉座子插入使諸如pSIM1278的重組質粒載體穩(wěn)定(圖1)。AGL1表現(xiàn)出針對羧芐青霉素和利福平的抗性，并且用特美汀(timentin)將其從轉化的馬鈴薯組織消除。Atlantic品種的母株維持在裝有40ml半強度M516培養(yǎng)基的Magenta盒子中，該培養(yǎng)基包含3％蔗糖和2g/lgelrite(繁殖培養(yǎng)基)。從四周齡植物切取4到6毫米的馬鈴薯節(jié)間節(jié)段，用攜帶pSIM1278的農桿菌AGL1菌株感染，并轉移至含有3％蔗糖和6g/l瓊脂的組織培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基)。兩天后，將感染的外植體轉移至含有3％蔗糖、6g/l瓊脂和150mg/l特美汀的M404培養(yǎng)基(無激素培養(yǎng)基)以消除農桿菌。該方法的細節(jié)在Richael等人(2008)中有所描述。一個月以后，將感染的外植體轉移至缺少任何合成激素的新鮮培養(yǎng)基并在Percival生長室中在16小時光周期下于24℃溫育，其中它們開始形成苗。許多苗表達ipt基因并表現(xiàn)出細胞分裂素過度產生表型；這些苗不考慮用于進一步分析。PCR基因型分析證明，其余苗的約0.3至1.5％含有P-DNA的至少一部分而同時缺少ipt基因。因而，沒有標記被用于選擇轉化植物。有關基于ipt的無標記植物轉化的細節(jié)已在Richael等人(2008)中公布。消除農桿菌的過程在外植體感染后兩天開始。為此，使組織經受抗生素特美汀(150mg/L)處理直到證明沒有活的農桿菌。證據(jù)通過將轉化事件的莖節(jié)段在營養(yǎng)肉湯-酵母提取液(NBY培養(yǎng)基)上于28℃溫育2周(重復兩次)獲得。根據(jù)97CFRPart340，僅在沒有活的農桿菌時將轉化的植物運送并種植于田地中。通過DNA凝膠印跡分析對馬鈴薯植物品種J3進行分析，以確定整合的DNA插入序列的結構和拷貝數(shù)并證實載體骨架序列的缺失。此外，將分子表征用于確定該DNA插入物旁側的接合點的序列以及顯示插入的DNA的穩(wěn)定性。接合點的測序信息提供了用以針對轉入雜交親和物種基因的馬鈴薯植物品種J3開發(fā)特異性PCR測試的基礎。據(jù)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯栽培種J3包含在左邊界側反向連接的一個近乎完整的DNA插入物和一個部分拷貝的DNA插入物，其中缺失LB區(qū)和相鄰AGP啟動子的一部分，如當各種DNA消化物與AGP、ASN、PHL和GBS分子探針雜交時從雜交結果推導出的那樣。實例4.缺少載體骨架DNA的證據(jù)與許多商業(yè)轉基因作物不同，本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3被證實不含用于轉化的由農桿菌衍生的DNA序列，例如載體骨架DNA，采用了如下三種不同方法：1)首先，確定異戊烯異構酶(ipt)負可選標記基因在載體骨架中的存在與否，因為意外從農桿菌轉移包含ipt基因表達盒的骨架DNA至植物細胞將引發(fā)ipt基因表達，并因此引發(fā)細胞分裂素類型激素異戊烯腺苷的形成，2)然后將DNA印跡雜交用于已通過第一個篩選方法的轉化馬鈴薯植物以確認骨架DNA的不存在，以及3)然后設計PCR來擴增可指示DNA插入物邊界區(qū)與旁側骨架DNA之間的接合點或骨架DNA內處于DNA插入物旁側的區(qū)域的片段。該方法的功效通過將pSIM1278DNA用作陽性對照來確認。本發(fā)明的馬鈴薯栽培種J3未產生指示載體骨架DNA的存在的PCR條帶。實例5.插入的DNA的穩(wěn)定性使用DNA凝膠印跡雜交和性狀評價二者，在初始的轉化株中并然后再在繁殖的植物材料中評價了DNA插入物的穩(wěn)定性。進行這些研究以確保轉入雜交親和物種基因的事件以一致且可靠的方式表達摻入的性狀。不穩(wěn)定性可通過罕見的重組事件引發(fā)或者也可由甲基化引起。因為馬鈴薯通常是無性繁殖，因此用于有性繁殖作物的標準評估不是直接適用的，將塊莖而不是種子用于定義后代。DNA印跡雜交的結果證明，在多個世代中存在連續(xù)的條帶，從而表明了穩(wěn)定性。通過在第一代和第二代塊莖種子中確認性狀功效獲得了穩(wěn)定性的進一步證據(jù)。通過提取并評價來自體外繁殖并且從未在土壤中種植的植物的葉子的DNA，在初始轉化的材料(G0)中證明了DNA插入物穩(wěn)定性。對于第一代(G1)分析，將來自各轉入雜交親和物種基因的品種的兩株繁殖植物和來自各對照的一株植物種植于溫室中；將從各植物收獲的塊莖中的一者進行種植以從G1植物獲得葉子，將該葉子用于分離DNA并評價G1代。再次種植來自該代的塊莖，將所得的G2植物的葉子用于進行該世代的表征。在所有泳道中，從本發(fā)明的Atlantic馬鈴薯栽培種J3分離出的DNA與GBS探針的雜交顯示具有三根共有條帶(8.6kb、7.8kb和7.1kb)，并且與AGP探針的雜交顯示具有四根條帶(7.2kb、5.0kb、2.0kb和1.4kb)。這些條帶可指示未經修飾的基因組的DNA片段。從所有轉入雜交親和物種基因的材料分離出的DNA中三根額外條帶(其中一根為2.2kb的條帶，指示內部DNA插入片段；另外兩根表示DNA插入物連接片段(在與GBS的雜交中，為5.9kb和約13kb；在與AGP的雜交中，為1.6kb和5.7kb))的存在指示初始轉化株(G0)的插入物在第一無性世代G1和第二無性世代G2中保持穩(wěn)定。AtlanticG2塊莖不能使用兒茶酚檢測法分析Ppo活性，因為未轉化的Atlantic品種的切割塊莖表面在暴露于兒茶酚時不能顯影棕色沉淀劑?？赡艿氖牵崔D化的Atlantic馬鈴薯不產生催化多酚氧化的酶。取而代之的是，通過PCR分析來證明插入的DNA的穩(wěn)定性，結果表明，J3塊莖包含擴增的0.8kb產物并且未表現(xiàn)出G2塊莖中的不穩(wěn)定性，所述產物是Asn1/Ppo5基因的一部分。實例6.接合點分析和品種特異性檢測至少一個DNA插入物/旁側植物DNA接合點用接頭連接介導的PCR或熱不對稱交錯PCR進行了測序。使用連接序列設計馬鈴薯栽培種J3的引物，并且這些引物被應用于品種特異性的基于PCR的檢測方法。可使用引物擴增464kb的J3特異性DNA片段，得到用于品種J3的品系特異性測試方法。將開發(fā)的方法用于監(jiān)測田地和儲存中的植物和塊莖以確認塊莖或加工的食品中轉入雜交親和物種基因的材料的不存在，以及確保有機種植的純凈。實例7.基因沉默的功效和組織特異性利用基因沉默方法降低Asn1、Ppo5、PhL和R1天然蛋白質的活性，并評價轉錄物水平而不是蛋白質含量，以將新的表型性狀與分子水平的變化相關聯(lián)。因為涉及葉子和莖中的ASN(天冬酰胺)形成的Asn1基因的強沉默可能會不利地影響生長，所以將Agp啟動子和Gbss啟動子(其為塊莖特異性啟動子和匍匐莖特異性啟動子并且在光合作用活躍組織和根中活性低很多)用于驅動塊莖和匍匐莖中的基因沉默。通過RNA印跡分析確定植物品種J3及其未轉化的對應物的不同組織中的四個靶標基因的轉錄物水平。在未轉化的對照的塊莖中，對于Asn1、PhL和R1基因，轉錄物水平“高”(可通過RNA印跡雜交容易地檢測)，對于Ppo5基因轉錄物水平“低”。將RNA印跡分析進行比較表明，在來自溫室和田間的塊莖中Asn1、Ppo5和PhL以相似水平表達。相比之下，在溫室培養(yǎng)的對照塊莖中比在來自田間的塊莖中R1基因得到稍微更有效的沉默。品種J3的塊莖中Asn1和Ppo5基因的轉錄物水平大幅降低與產生丙烯酰胺的低可能性相關聯(lián)。品系J3的塊莖中PhL基因的轉錄物水平部分降低。該變化與葡萄糖和果糖的量降低相關聯(lián)。J3塊莖中的R1轉錄物部分減少(“降低”)，有助于限制淀粉降解成糖。在未轉化的植物的匍匐莖中Asn1、Ppo5和R1基因以低水平表達。相比之下，對照中的高轉錄物水平與PhL基因相關。在轉入雜交親和物種基因的品種J3的匍匐莖中，PhL基因的表達也被下調。品種J3的匍匐莖中的R1基因的轉錄物含量輕微減少(“降低”)。該分子改變有助于限制淀粉降解成糖。品系J3與其未轉化的對應物的葉組織中的Asn1基因轉錄物水平類似。在所有情況下，均未檢測到用于Ppo5基因表達的轉錄物水平，而PhL基因的含量在初始品種Atlantic和轉化后的衍生物J3中始終較高。與其對照相比，品種J3中的R1基因的轉錄物水平保持不變。在莖組織中，事件J3與其對照的Asn1基因轉錄物水平類似。在本發(fā)明的品種J3中，Ppo5基因的轉錄物水平降低。品系J3與其對照的PhL基因表達非常類似，并且R1基因表達未降低。在品種J3的根組織中，Asn1和Ppo5基因的轉錄物水平均降低。這些結果表明，用于驅動沉默的啟動子在地下組織中具有部分功能。本發(fā)明的品種J3的花組織中的Asn1基因轉錄物水平比初始品種Atlantic低。未檢出Ppo5基因的轉錄物，并且PhL和R1基因的表達水平與對照類似。這些結果表明，馬鈴薯品種J3的塊莖和匍匐莖中的Asn1和Ppo5基因的表達水平被下調，并且R1和PhL基因在品種J3的塊莖和匍匐莖中至少部分地沉默。沉默在塊莖和匍匐莖中最有效。所選馬鈴薯品種J3在Asn1和Ppo5基因的表達水平方面受到的影響比在R1和PhL基因的表達水平方面受到的影響強。這些結果與本發(fā)明人的如下意圖相一致：(1)以最大可能的程度防止Ppo蛋白和游離ASN的形成，以及(2)僅僅部分阻斷淀粉向葡萄糖和果糖的轉化。轉錄物水平在除了塊莖和匍匐莖之外的組織中的偶爾改變證明了塊莖/匍匐莖特異性啟動子有一定滲漏。還有可能的是，塊莖中通過沉默盒的表達產生的小RNA遷移進其他組織中，尤其是根和莖中(Molnar等人，2010)。在除了塊莖和匍匐莖之外的組織中表達水平改變的大多數(shù)情形中，差異較小。在轉入雜交親和物種基因的馬鈴薯栽培種J3的特定組織中的下調轉錄物水平匯總示于表3中。在表3中，A＝Asn1，P＝Ppo5，L＝PhL，R＝R1。表3中帶下劃線的字母指示下調基因表達水平。表3品種塊莖匍匐莖根莖葉花J3APLRAPRAPLRA實例8.田間表現(xiàn)和塊莖評價2009、2010和2011年的試驗用機械化種植以方便收獲并且確保轉入雜交親和物種基因的馬鈴薯保持與未修飾材料分離。對于2009年的評價，將來自每個事件和對照品種的“核心種子(nuclearseed)”微型種薯(minituber)用于種植四到五個單行樣區(qū)(single-rowplot)(20個微型種薯/樣區(qū))，其中樣區(qū)隨機分布在整個田地的區(qū)組內。該隨機化完全區(qū)組設計(RCB)對于新馬鈴薯品種和事件而言是典型的。在2010年和2011年進行的方法是每個點每個事件和對照使用三個隨機樣區(qū)，還使用了重復數(shù)(每個事件的樣區(qū)數(shù))等于區(qū)組數(shù)的RCB。2010年的每個樣區(qū)包括三行、每行20個種子片，均來自2009年在內布拉斯加州切里縣(CherryCounty,NE)生產的Atlantic的“核心種子”微型種薯。用于2011年試驗的Atlantic種子是2010年在內布拉斯加州切里縣(CherryCounty,NE)生產的第一代(G1)。在所有試驗中，轉入雜交親和物種基因的品系的種子類似于其未經修飾的對照進行處理。田間生長的塊莖比微型種薯更合適作為種子，因為它們生成更有活力且更均一的產生更高塊莖產量和品質的植物。針對對昆蟲、病害和環(huán)境脅迫的差異性響應對每個樣塊進行定性評價(在一些情形中使用標準化的監(jiān)測尺度)，所述環(huán)境脅迫不是人工誘導的而是在生長季節(jié)期間可能自發(fā)出現(xiàn)的。在2009、2010和2011年剛好在早期行鋪滿(rowclosure)和開花之前或在早期行鋪滿和開花期間(對于大多數(shù)試驗在六月到七月，弗羅里達的試驗除外，其在四月進行評價)進行季節(jié)中期監(jiān)測，以評估植物活力、葉顏色、葉尺寸、葉卷曲、病害癥狀(存在/不存在)，以及昆蟲相關的植物損害。在2011年，對生長區(qū)域普通的特定昆蟲、病害和非生物脅迫因素進行評價。在季節(jié)中期和晚期期間病害和昆蟲壓力通常是最高的，但從七月到九月(對于弗羅里達的試驗是從三月到五月)針對病原體和昆蟲引起的癥狀對植物進行監(jiān)測。在殺藤(旨在確保塊莖成熟和季節(jié)晚期表皮長好(skinset)的過程)之前進行藤成熟度和病害的季節(jié)晚期監(jiān)測。藤殺死通過收割或撲打藤或通過根據(jù)制造商的建議(明尼蘇達州羅斯維爾市(Roseville,MN)的JRJohnson公司)使用批準的除草劑如Reglone來誘導。在此時，還針對病害癥狀和昆蟲損害對植物進行評估。在鑒別了病害癥狀時的一些情形中，還進行發(fā)芽測試以確認該發(fā)現(xiàn)。使用JMP9.0.2計算了平均值、標準偏差和90％置信區(qū)間。通過獲得實驗中包括的所有常規(guī)品種的最小和最大平均值(年份*位置*條目(entry))生成常規(guī)品種范圍。在JMP9.0.2中，通過合并多年多個位置的數(shù)據(jù)，分析Atlantic品種的所有特性。實例9.馬鈴薯栽培種J3特征匯總馬鈴薯品種J3通過降低反應物(即，天冬酰胺)的濃度來減少丙烯酰胺的形成，同時減少糖的形成，從而滿足了馬鈴薯產業(yè)提高質量的需求。馬鈴薯品種J3使用馬鈴薯植物基因組天然的核酸序列進行轉化，并且不包含外來DNA、農桿菌DNA、病毒標志物或載體骨架序列。此外，進行農藝學研究以確保該事件以與常規(guī)對照相同的方式生長，但與性狀相關的特性除外。農藝學特性對2009年、2010年和2011年生長的馬鈴薯品種J3事件和對照的農藝學特性的評價示于表4至表7中。在可能的情況下通過統(tǒng)計方法分析了結果?？傮w數(shù)據(jù)表明，在Atlantic對照與J3Atlantic事件之間沒有重大差異。表4示出了針對品種J3測試的每種特性的位點-年數(shù)目。J3和Atlantic對照的農藝學特性示于表5中。其中五種農藝學特性在J3與對照之間未檢測出統(tǒng)計意義上的顯著差異。葉片卷曲和藤成熟度等級數(shù)據(jù)不能進行統(tǒng)計學比較，因為J3的葉片卷曲平均值與對照相同，并且J3的觀測值在常規(guī)品種總范圍之外(分別為2.89與3.00-3.50)。在J3與對照之間檢測出每株植物的莖(3.42與3.14)和衰老(52.37與47.37)存在統(tǒng)計意義上的顯著差異；然而，在兩種情況下，J3的值均在常規(guī)品種范圍內。在表5中，每株植物的莖和最終出苗數(shù)據(jù)僅來自2011年的記錄；常規(guī)品種(ConV)范圍等于常規(guī)的Ranger、Burbank和Atlantic品種的平均值范圍；NA表示不能進行統(tǒng)計學比較。J3和Atlantic對照的產量和等級特性示于表6中。在總產量、A級％、揀選率(pickouts)％或總內部缺陷方面未檢測出統(tǒng)計意義上的顯著差異。無法對B級％進行統(tǒng)計分析，但J3的平均值在常規(guī)的品種范圍內。在J3和對照之間檢測到三方面的統(tǒng)計意義上的顯著差異：U.S.#1(分別為84.7與87.1)、過大率％(5.4與8.3)和比重(1.094與1.092)。在這些差異方面，J3的所有值均在常規(guī)品種范圍內。在表6中，常規(guī)品種(ConV)范圍等于常規(guī)的Ranger、Burbank和Atlantic品種的平均值范圍；NA表示不能進行統(tǒng)計學比較。J3和Atlantic對照的花顏色示于表7中。對于每個條目，在不同樣區(qū)中觀察到紫色和混合的花顏色。表4表5表6表7基于表4至表7提供的關于馬鈴薯栽培種J3的數(shù)據(jù)，可以推斷出，未轉化的Atlantic品種與馬鈴薯栽培種J3之間在農藝學特性、花顏色、產量和等級、以及生態(tài)相互作用方面沒有重大差異。因此，基于多年的數(shù)據(jù)，Atlantic品種J3不會因雜草性或產生植物害蟲的可能性而在環(huán)境方面造成重大的持久性風險。天冬酰胺和丙烯酰胺水平天冬酰胺合成酶基因的沉默導致馬鈴薯品種J3中游離天冬酰胺平均減少77％。較低的天冬酰胺水平(其在美拉德反應中與還原糖化合而形成丙烯酰胺)導致炸薯條中平均減少67％的丙烯酰胺。Atlantic對照與馬鈴薯J3在天冬酰胺和丙烯酰胺方面的差異示于表8中。在測試丙烯酰胺之前，將對照和J3制成炸薯條。所有結果均來自收獲不久時分析的塊莖。表8馬鈴薯栽培種J3是具有改進質量的Atlantic品種，其具有降低的丙烯酰胺水平。本發(fā)明的另外的實施例得到組合了上面提及的有利特性的馬鈴薯品種的研究大部分是經驗性的。該研究需要大量投入時間、勞力和金錢。馬鈴薯栽培種的開發(fā)從溫室到商業(yè)利用通常耗費八年或更久。育種始于對優(yōu)異親本的仔細選擇以將最重要的特性摻入子代中。因為所有所需性狀通常并不通過僅一次雜交而出現(xiàn)，所以育種必須是累積的。當前的育種技術一直是對親本克隆進行控制授粉。通常，花粉收集于明膠膠囊中以供后面用于對母本進行授粉。將雜種種子播種于溫室中并從數(shù)以千計的獨立籽苗收獲塊莖并保留。下一年，將來自每株所得籽苗的一到四個塊莖種植于田地中，其中要極其小心以避免病毒和病害傳播。從該第一年的籽苗作物，來自每個雜種個體(其通過了選擇過程)的數(shù)個“種子”塊莖被保留用于下一年的種植。在第二年之后，獲取樣品以供密度測量以及煎炸測試來確定塊莖對于商業(yè)利用的合適性。然后將到目前為止已通過選擇過程的植物以擴大量種植第三年，以供更復雜的一系列煎炸測試和密度測定。在開發(fā)的第四年階段，將存留下來的選擇株在數(shù)個州接受田間試驗，以確定它們對不同生長條件的適應性。最終，將具有優(yōu)異品質的品種轉移至其他農場并將種子增加至商業(yè)規(guī)模。一般而言，到此時，已經投入了八年或更多年的種植、收獲和測試以圖開發(fā)新的且改良的馬鈴薯栽培種。隨著使得能對編碼特定蛋白質產物的基因進行分離和表征的分子生物學技術的出現(xiàn)，植物生物學領域中的科學家在工程改造植物基因組以含有和表達外來基因、或者天然或內源基因的額外形式或修飾形式(或許通過不同的啟動子驅動)以通過特定方式改變植物的性狀方面產生了強烈的興趣。這種外來的額外的和/或經修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉基因”。在最后的十五到二十年間，已經開發(fā)了若干用于產生轉基因植物的方法，并且在特定的實施例中，本發(fā)明還涉及要求權利保護的品種或品系的轉化形式。植物轉化涉及構建將會在植物細胞中有功能的表達載體。這樣一種載體包含DNA，該DNA包含處于調控元件(例如啟動子)的控制下的基因，或與調控元件(例如啟動子)有效連接的基因。表達載體可以含有一個或多個這種有效連接的基因/調控元件組合。載體可以是以質粒的形式，并且可以單獨使用或與其他質粒組合使用，以利用下面描述的將轉基因摻入進馬鈴薯植物的遺傳物質中的轉化方法來提供轉化的馬鈴薯植物。傳統(tǒng)的植物育種通常依賴于植物染色體的隨機重組來產生具有新的且改良的特性的品種。根據(jù)標準的、眾所周知的技術，包含基因和調控元件的遺傳“表達盒”插入在農桿菌分離的轉移DNA(T-DNA)的邊界序列內并整合進植物基因組中。農桿菌介導的T-DNA物質的轉化通常包括如下標準程序：(1)體外重組遺傳元件以產生用于轉化選擇的表達盒，所述遺傳元件的至少一者是外源的，(2)將該表達盒(通常與至少一個含有外來DNA的其他表達盒一起)插入進二元載體的T-DNA區(qū)中，所述二元載體通常由旁側為T-DNA邊界序列的數(shù)百個堿基對的農桿菌DNA組成，(3)位于T-DNA邊界序列之間的序列(通常伴隨有來自農桿菌的額外二元載體序列的一些或全部)轉移至植物細胞，以及(4)選擇表現(xiàn)出所需性狀(如產量增加、活力改善、對病害和昆蟲的抗性增強或者在脅迫下存活的能力更強)的穩(wěn)定轉化的植物細胞。因而，遺傳改造方法依賴于引入外來的非原生核酸，包括調控元件如啟動子和終止子，以及來自病毒、細菌和植物的涉及作為轉化株的鑒定和選擇的標記的新性狀或功能的表達的基因。標記基因通常源于細菌來源并且賦予抗生素或除草劑抗性。經典的育種方法是費力費時的，并且新品種通常僅表型出相對適度的改善。在該“反義”技術中，將天然基因的序列反轉以沉默轉基因植物中的基因的表達。然而，反向DNA通常含有插入在啟動子和終止子之間的新的未表征的開放閱讀框，這些開放閱讀框編碼外來氨基酸序列，所述氨基酸序列可能是不期望的，因為它們干擾植物發(fā)育和/或降低其營養(yǎng)價值。用于馬鈴薯轉化的表達載體：標記基因表達載體包括至少一個與調控元件(例如啟動子)有效連接的遺傳標記，該遺傳標記使得含有該標記的轉化細胞能通過負向選擇(即抑制不含該可選標記基因的細胞的生長)，或通過正向選擇(即針對該遺傳標記編碼的產物進行篩選)進行回收。用于植物轉化的許多通常使用的可選標記基因是轉化領域熟知的，并且包括例如編碼通過代謝使選擇性化學劑(其可以是抗生素或除草劑)解毒的酶的基因，或編碼對抑制劑不敏感的變更的靶標物的基因。許多正向選擇方法也是本領域已知的。用于植物轉化的一種通常使用的可選標記基因是新霉素磷酸轉移酶II(nptII)基因，其在處于植物調控信號的控制下時，賦予針對卡那霉素的抗性。Fraleyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983)(Fraley等人，《美國國家科學院院刊》，第80卷，第4803頁，1983年)。另一通常使用的可選標記基因是潮霉素磷酸轉移酶基因，其賦予針對抗生素潮霉素的抗性。VandenElzenetal.,PlantMol.Biol.,5:299(1985)(VandenElzen等人，《植物分子生物學》，第5卷，第299頁，1985年)。賦予抗生素抗性的細菌起源的其他可選標記基因包括慶大霉素乙酰轉移酶、鏈霉素磷酸轉移酶和氨基糖苷-3'-腺苷酰轉移酶、博來霉素抗性決定子。Hayfordetal.,PlantPhysiol.86:1216(1988)(Hayford等人，《植物生理學》，第86卷，第1216頁，1988年)；Jonesetal.,Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)(Jones等人，《分子和普通遺傳學》，第210卷，第86頁，1987年)；Svabetal.,PlantMol.Biol.14:197(1990)(Svab等人，《植物分子生物學》，第14卷，第197頁，1990年)；Hilleetal.,PlantMol.Biol.7:171(1986)(Hille等人，《植物分子生物學》，第7卷，第171頁，1986年)。其他可選標記賦予針對除草劑如草甘膦、草銨膦、溴草腈的抗性。Comaietal.,Nature317:741-744(1985)(Comai等人，《自然》，第317卷，第741-744頁，1985年)；Gordon-Kammetal.,PlantCell2:603-618(1990)(Gordon-Kamm等人，《植物細胞》，第2卷，第603-618頁，1990年)；以及Stalkeretal.,Science242:419-423(1988)(Stalker等人，《科學》，第242卷，第419-423頁，1988年)。非細菌起源的用于植物轉化的可選標記基因包括(例如)小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholtzetal.,SomaticCellMol.Genet.13:67(1987)(Eichholtz等人，《體細胞和分子遺傳學》，第13卷，第67頁，1987年)；Shahetal.,Science233:478(1986)(Shah等人，《科學》，第233卷，第478頁，1986年)；Charestetal.,PlantCellRep.8:643(1990)(Charest等人，《植物細胞報告》，第8卷，第643頁，1990年)。用于植物轉化的另一類標記基因需要針對對毒性物質如抗生素的抗性篩選推定轉化的植物細胞而不是直接遺傳選擇轉化的細胞。這些基因尤其可用于對特定組織中基因表達的空間模式進行定量或可視化，并且常常稱為報告基因，因為它們可融合至基因或基因調控序列以供基因表達的調查研究。用于篩選推定轉化的細胞的通常使用的基因包括β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、熒光素酶和氯霉素乙酰轉移酶。Jefferson,R.A.,PlantMol.Biol.Rep.5:387(1987)(Jefferson,R.A.，《植物分子生物學報告》，第5卷，第387頁，1987年)；Teerietal.,EMBOJ.8:343(1989)(Teeri等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第8卷，第343頁，1989年)；Konczetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:131(1987)(Koncz等人，《美國國家科學院院刊》，第84卷，第131頁，1987年)；DeBlocketal.,EMBOJ.3:1681(1984)(DeBlock等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第3卷，第1681頁，1984年)。用于使GUS活性可視化而不需要破壞植物組織的體內方法是可用的。MolecularProbespublication2908,IMAGENEGREEN,p.1-4(1993)(分子探針出版物2908，IMAGENEGREEN，第1-4頁，1993年)和Nalewayetal.,J.CellBiol.115:151a(1991)(Naleway等人，《細胞生物學雜志》，第115卷，第151a頁，1991年)。然而，因為低靈敏度、高熒光背景和與使用熒光素酶基因作為可選標記相關的局限性，這些用于可視化GUS活性的體內方法尚未證實可用于回收轉化的細胞。更近些時候，編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因已被用作原核細胞和真核細胞中基因表達的標記。Chalfieetal.,Science263:802(1994)(Chalfie等人，《科學》，第263卷，第802頁，1994年)。GFP和GFP的突變體可用作篩選標記。用于馬鈴薯轉化的表達載體：啟動子表達載體中包括的基因必須由包含調控元件例如啟動子的核苷酸序列驅動。數(shù)種類型的啟動子是轉化領域熟知的，可單獨使用或與啟動子組合使用的其他調控元件也是轉化領域所熟知的。如本文所用，“啟動子”包括提及處于轉錄起始區(qū)上游并且涉及RNA聚合酶及其他蛋白質的識別和結合以啟動轉錄的DNA區(qū)?！爸参飭幼印笔悄軌蛟谥参锛毎袉愚D錄的啟動子。處于發(fā)育控制下的啟動子的例子包括優(yōu)先在某些組織如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞或厚壁組織中啟動轉錄的啟動子。這類啟動子稱為“組織偏好的”。僅在某些組織中啟動轉錄的啟動子稱為“組織特異性的”?！凹毎汀碧禺愋詥幼又饕谝环N或多種器官中的某些細胞類型(例如根或葉中的維管細胞)中驅動表達?！罢T導型”啟動子是在環(huán)境控制下的啟動子。可通過誘導型啟動子實現(xiàn)轉錄的環(huán)境條件的例子包括無氧條件或光的存在。組織特異性啟動子、組織偏好啟動子、細胞類型特異性啟動子和誘導型啟動子構成一類“非組成型”啟動子?！敖M成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動子。A.誘導型啟動子誘導型啟動子與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接。任選地，誘導型啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列有效連接，該信號序列與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接。使用誘導型啟動子，轉錄速率響應誘導劑而增加。任何誘導型啟動子均可用于本發(fā)明。參見Wardetal.,PlantMol.Biol.22:361-366(1993)(Ward等人，《植物分子生物學》，第22卷，第361-366頁，1993年)。示例性誘導型啟動子包括但不限于：響應于銅的來自ACEI系統(tǒng)的啟動子(Mettetal.,PNAS90:4567-4571(1993)(Mett等人，《美國國家科學院院刊》，第90卷，第4567-4571頁，1993年))、響應于苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉蜀黍的In2基因(Hersheyetal.,Mol.GenGenetics227:229-237(1991)(Hershey等人，《分子和普通遺傳學》，第227卷，第229-237頁，1991年)和Gatzetal.,Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994)(Gatz等人，《分子和普通遺傳學》，第243卷，第32-38頁，1994年))或來自Tn10的Tet阻遏物(Gatzetal.,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)(Gatz等人，《分子和普通遺傳學》，第227卷，第229-237頁，1991年))。特別優(yōu)選的誘導型啟動子是響應植物通常不響應的誘導劑的啟動子。示例性的誘導型啟動子是來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，該啟動子的轉錄活性受糖皮質類固醇激素的誘導。Schenaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:0421(1991)(Schena等人，《美國國家科學院院刊》，第88卷，第0421頁，1991年)。B.組成型啟動子組成型啟動子與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接，或者組成型啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列有效連接，該信號序列與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接。在本發(fā)明中可利用許多不同的組成型啟動子。示例性組成型啟動子包括但不限于：來自植物病毒的啟動子，例如來自CaMV的35S啟動子(Odelletal.,Nature313:810-812(1985)(Odell等人，《自然》)，第313卷，第810-812頁，1985年)，以及來自諸如水稻肌動蛋白的此類基因的啟動子(McElroyetal.,PlantCell2:163-171(1990)(McElroy等人，《植物細胞》，第2卷，第163-171頁，1990年))；泛素(Christensenetal.,PlantMol.Biol.12:619-632(1989)(Christensen等人，《植物分子生物學》，第12卷，第619-632頁，1989年)和Christensenetal.,PlantMol.Biol.18:675-689(1992)(Christensen等人，《植物分子生物學》，第18卷，第675-689頁，1992年))；pEMU(Lastetal.,Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991)(Last等人，《理論與應用遺傳學》，第81卷，第581-588頁，1991年))；MAS(Veltenetal.,EMBOJ.3:2723-2730(1984)(Velten等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第3卷，第2723-2730頁，1984年))和玉蜀黍H3組蛋白(Lepetitetal.,Mol.Gen.Genetics231:276-285(1992)(Lepetit等人，《分子和普通遺傳學》，第231卷，第276-285頁，1992年)和Atanassovaetal.,PlantJournal2(3):291-300(1992)(Atanassova等人，《植物雜志》，第2卷，第3期，第291-300頁，1992年))。ALS啟動子為歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3結構基因5'的Xba1/Ncol片段(或類似于所述Xba1/Ncol片段的核苷酸序列)，其代表一特別有用的組成型啟動子。參見PCT申請WO96/30530。C.組織特異性啟動子或組織偏好啟動子組織特異性啟動子與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接。任選地，組織特異性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列有效連接，該信號序列與要在馬鈴薯中表達的基因有效連接。轉化有與組織特異性啟動子有效連接的所關注基因的植物在特定組織中僅僅或優(yōu)先產生所述轉基因的蛋白質產物。任何組織特異性或組織偏好啟動子均可用于本發(fā)明。示例性組織特異性或組織偏好啟動子包括但不限于：根偏好啟動子，例如來自菜豆素基因的啟動子(Muraietal.,Science23:476-482(1983)(Murai等人，《科學》，第23卷，第476-482頁，1983年)和Sengupta-Gopalanetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3320-3324(1985)(Sengupta-Gopalan等人，《美國國家科學院院刊》，第82卷，第3320-3324頁，1985年))；葉特異性的光誘導型啟動子，例如來自cab或rubisco的啟動子(Simpsonetal.,EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)(Simpson等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第4卷，第11期，第2723-2729頁，1985年)和Timkoetal.,Nature318:579-582(1985)(Timko等人，《自然》，第318卷，第579-582頁，1985年))；花藥特異性啟動子，例如來自LAT52的啟動子(Twelletal.,Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989)(Twell等人，《分子和普通遺傳學》，第217卷，第240-245頁，1989年))；花粉特異性啟動子，例如來自Zm13的啟動子(Guerreroetal.,Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993)(Guerrero等人，《分子和普通遺傳學》，第244卷，第161-168頁，1993年))或小孢子偏好啟動子，例如來自apg的啟動子(Twelletal.,Sex.PlantReprod.6:217-224(1993)(Twell等人，《植物有性生殖》，第6卷，第217-224頁，1993年))。用于將靶標蛋白質靶向至亞細胞區(qū)室的信號序列將轉基因產生的蛋白質運輸至亞細胞區(qū)室如葉綠體、液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細胞壁或線粒體或者用于分泌進質外體中可通過將編碼信號序列的核苷酸序列與編碼所關注蛋白質的基因的5’和/或3’區(qū)有效連接來實現(xiàn)。結構基因5’和/或3’端處的靶向序列可在蛋白質合成和加工期間決定所編碼的蛋白質最終在哪區(qū)室化。信號序列的存在將多肽引導至細胞內的細胞器或亞細胞區(qū)室，或用于分泌進質外體。許多信號序列是本領域已知的。參見例如Beckeretal.,PlantMol.Biol.20:49(1992)(Becker等人，《植物分子生物學》，第20卷，第49頁，1992年)；Close,P.S.,Master’sThesis,IowaStateUniversity(1993)(Close,P.S.，碩士論文，愛荷華州立大學，1993年)；Knox,C.,etal.,PlantMol.Biol.9:3-17(1987)(Knox,C.等人，《植物分子生物學》，第9卷，第3-17頁，1987年)；Lerneretal.,PlantPhysiol.91:124-129(1989)(Lerner等人，《植物生理學》，第91卷，第124-129頁，1989年)；Frontesetal.,PlantCell3:483-496(1991)(Frontes等人，《植物細胞》，第3卷，第483-496頁，1991年)；Matsuokaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:834(1991)(Matsuoka等人，《美國國家科學院院刊》，第88卷，第834頁，1991年)；Gouldetal.,J.Cell.Biol.108:1657(1989)(Gould等人，《細胞生物學雜志》，第108卷，第1657頁，1989年)；Creissenetal.,PlantJ.2:129(1991)(Creissen等人，《植物雜志》，第2卷，第129頁，1991年)；Kalderon,etal.,Cell39:499-509(1984)(Kalderon等人，《細胞》，第39卷，第499-509頁，1984年)；Steifel,etal.,PlantCell2:785-793(1990)(Steifel等人，《植物細胞》，第2卷，第785-793頁，1990年)。外來蛋白質基因和農藝學基因使用根據(jù)本發(fā)明的轉基因植物，可以商業(yè)量產生外來蛋白質。因而，轉基因植物選擇和繁殖的技術(其為本領域周知的)可產生以常規(guī)方式收獲的許多轉基因植物，并然后可從所關注的組織或從總生物質提取外來蛋白質。植物生物質中的蛋白質提取可通過已知方法實現(xiàn)，所述已知方法在例如HeneyandOrr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)(Heney和Orr，《分析生物化學》，第114卷，第92-6頁，1981年)中有所論述。根據(jù)一個優(yōu)選的實施例，提供外來蛋白質的商業(yè)生產的轉基因植物是馬鈴薯植物。在另一個優(yōu)選的實施例中，所關注的生物質是種子或塊莖。對于數(shù)目相對較少的顯示較高表達水平的轉基因植物，可以生成遺傳圖譜，主要通過常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析生成，其可鑒定整合的DNA分子大概的染色體位置。對于這一方面的示例性方法，參見GlickandThompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPress,BocaRaton269:284(1993)(Glick和Thompson，《植物分子生物學和生物技術方法》)，CRC出版社，博卡拉頓市，第269卷，第284頁，1993年)。有關染色體位置的圖譜信息可用于對主題轉基因植物的專有保護。如果進行了未授權的繁殖以及與其他種質雜交，則可將整合區(qū)的圖譜與可疑植物的類似圖譜進行比較，以確定后者是否與主題植物具有共同的系譜(parentage)。圖譜比較將涉及雜交、RFLP、PCR、SSR和測序，所有這些均是常規(guī)的技術。同樣，借助于本發(fā)明，可在轉化植物中表達農藝學基因。更具體而言，可對植物進行遺傳改造以表達農藝學感興趣的各種表型。在這一方面所牽涉的示例性基因包括但不限于下面歸類的那些：1.賦予針對害蟲或病害的抗性并編碼以下各方面的基因：A.植物抗病基因。植物防御往往由植物中的抗病基因(R)的產物與病原體中的相應無毒(Avr)基因的產物之間的特異性相互作用激活?？捎每寺〉目剐曰蜣D化植物品種，以工程構建出對特定的病原體株系有抗性的植物。參見例如Jonesetal.,Science266:789(1994)(Jones等人，《科學》，第266卷，第789頁，1994年)(用于抵抗黃枝孢菌(Cladosporiumfulvum)的番茄Cf-9基因的克隆)；Martinetal.,Science262:1432(1993)(Martin等人，《科學》，第262卷，第1432頁，1993年)(用于抵抗丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)的番茄Pto基因編碼一種蛋白質激酶)；Mindrinosetal.Cell78:1089(1994)(Mindrinos等人，《細胞》，第78卷，第1089頁，1994年)(用于抵抗丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的擬南芥RSP2基因)。B.賦予針對害蟲如大豆異皮線蟲的抗性的基因。參見例如PCT申請WO96/30517；PCT申請WO93/19181。C.蘇云金桿菌蛋白、其衍生物或模擬其的合成多肽。參見例如，Geiseretal.,Gene48:109(1986)(Geiser等人，《基因》，第48卷，第109頁，1986年)，其公開了Btδ-內毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ-內毒素基因的DNA分子可購自弗吉尼亞州馬納薩斯市的美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)，例如以ATCC登錄號40098、67136、31995和31998。D.凝集素。參見例如VanDammeetal.,PlantMolec.Biol.24:25(1994)(VanDamme等人，《植物分子生物學》，第24卷，第25頁，1994年)，其公開了多種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結合凝集素基因的核苷酸序列。E.維生素結合蛋白，如親和素。參見PCT申請US93/06487，其教導了親和素及親和素同系物作為對抗昆蟲害蟲的殺幼蟲劑的用途。F.酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abeetal.,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(Abe等人，《生物化學雜志》，第262卷，第16793頁，1987年)(水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)；Huubetal.,PlantMolec.Biol.21:985(1993)(Huub等人，《植物分子生物學》，第21卷，第985頁，1993年)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitanietal.,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(Sumitani等人，《生物科學，生物技術與生物化學》，第57卷，第1243頁，1993年)(硝孢鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國專利No.5,494,813(Hepher和Atkinson，公布于1996年2月27日)。G.昆蟲特異性激素或信息素，如蛻皮類固醇或保幼激素、其變體、基于其的模擬物或者其拮抗劑或激動劑。參見例如，Hammocketal.,Nature344:458(1990)(Hammock等人，《自然》，第344卷，第458頁，1990年)的公開內容，其公開了克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的失活劑)的桿狀病毒表達。H.在表達時能破壞受影響的害蟲的生理的昆蟲特異性肽。例如，參見以下文獻的公開內容：Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(Regan,J，《生物化學》，第269卷，第9頁，1994年)(表達克隆生成編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)和Prattetal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(Pratt等人，《生物化學與生物物理研究通訊》，第163卷，第1243頁，1989年)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鑒定出抑咽側體素)。還可參見頒給Tomalski等人的美國專利No.5,266,317，其公開了編碼昆蟲特異性麻痹性神經毒素的基因。I.在自然界由蛇、黃蜂等產生的昆蟲特異性毒液。例如，參見Pangetal.,Gene116:165(1992)(Pang等人，《基因》，第116卷，第165頁，1992年)，了解有關在具有編碼蝎子昆蟲毒性肽的基因的植物中進行異源表達的公開內容。J.負責單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、苯丙素衍生物或者另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質分子的超量積聚的酶。K.涉及生物活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是合成的。參見PCT申請WO93/02197(Scott等人)，其公開了愈創(chuàng)葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有幾丁質酶編碼序列的DNA分子可例如以登錄號39637和67152從ATCC獲得。還可參見Krameretal.,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(Kramer等人，《昆蟲生物化學與分子生物學》，第23卷，第691頁，1993年)，其提出了編碼煙草天蛾(tobaccohornworm)幾丁質酶的cDNA的核苷酸序列；和Kawallecketal.,PlantMolec.Biol.21:673(1993)(Kawalleck等人，《植物分子生物學》，第21卷，第673頁，1993年)，其提供了歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列。L.刺激信號轉導的分子。例如，參見以下文獻的公開內容：Botellaetal.,PlantMolec.Biol.24:757(1994)(Botella等人，《植物分子生物學》，第24卷，第757頁，1994年)，其提供了綠豆鈣調蛋白cDNA克隆的核苷酸序列；和Griessetal.,PlantPhysiol.104:1467(1994)(Griess等人，《植物生理學》，第104卷，第1467頁，1994年)，其提供了玉蜀黍鈣調蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。M.疏水力矩肽。參見PCT申請WO95/16776，其公開了鱟素(Tachyplesin)的肽衍生物，該衍生物可抑制真菌植物病原體；以及PCT申請WO95/18855，其教導了合成的抗微生物肽，該肽可賦予抗病性。N.透膜酶、通道形成劑(channelformer)或通道阻斷劑。例如，參見Jaynes等人，PlantSci(《植物科學》)89:43(1993)的公開內容，其公開了異源表達天蠶抗菌肽-β裂解肽類似物以賦予轉基因煙草植物針對青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)的抗性。O.病毒侵入性蛋白(viral-1nvasiveprotein)或由其衍生的復合毒素。例如，病毒外殼蛋白在轉化的植物細胞中積累可賦予針對由衍生該外殼蛋白基因的病毒以及相關病毒造成的病毒感染和/或病害發(fā)展的抗性。參見Beachyetal.,Ann.Rev.Phytopathol.28:451(1990)(Beachy等人，《植物病理學年評》，第28卷，第451頁，1990年)。外殼蛋白介導的抗性已被賦予轉化植物以對抗苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒。P.昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道中的關鍵代謝功能的抗體將會使受影響的酶失活，從而殺死昆蟲。參閱Tayloretal.,Abstract#497,SeventhInt'lSymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(Taylor等人，第497號摘要，《第七屆分子植物-微生物相互作用國際學術報告會》(蘇格蘭愛丁堡)，1994年，通過產生單鏈抗體片段在轉基因煙草中進行酶失活)。Q.病毒特異性抗體。參見例如，Tavladorakietal.,Nature366:469(1993)(Tavladoraki等人，《自然》，第366卷，第469頁，1993年)，其表明表達重組抗體基因的轉基因植物免于病毒攻擊。R.在自然界由病原體或寄生蟲產生的發(fā)育遲滯蛋白。因此，真菌內切-α-1,4-D-聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細胞壁同型-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶而有利于真菌定植和植物營養(yǎng)物釋放。參見Lambetal.,Bio/Technology10:1436(1992)(Lamb等人，《生物技術》，第10卷，第1436頁，1992年)。Toubartetal.,PlantJ.2:367(1992)(Toubart等人，《植物雜志》，第2卷，第367頁，1992年)描述了編碼豆類內切聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。S.在自然界由植物產生的發(fā)育遲滯蛋白。例如，Logemannetal.,Bio/Technology10:305(1992)(Logemann等人，《生物技術》，第10卷，第305頁，1992年)已表明表達大麥核糖體失活基因的轉基因植物具有增加的針對真菌病害的抗性。T.涉及系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)響應的基因和/或發(fā)病相關基因。Briggs,S.CurrentBiology,5(2)(1995)(Briggs,S.，《當代生物學》，第5卷，第2期，1995年)。U.抗真菌基因。參見CornelissenandMelchers,PlantPhysiol.,101:709-712(1993)(Cornelissen和Melchers，《植物生理學》，第101卷，第709-712頁，1993年)；Parijsetal.,Planta183:258-264(1991)(Parijs等人，《植物》，第183卷，第258-264頁，1991年)和Bushnelletal.,Can.J.ofPlantPath.20(2):137-149(1998)(Bushnell等人，《加拿大植物病理學雜志》，第20卷，第2期，第137-149頁，1998年)。V.賦予針對疫霉枯萎病(Phytophthorablight)的基因，如R1、R2、R3、R4及其他抗性基因。參見Naess,S.K.,et.al.,(2000)ResistancetolateblightinSolanumbulbocastanumismappedtochromosome8.Theor.Appl.Genet.101：697-704(Naess,S.K.等人，2000年，馬鈴薯野生種(Solanumbulbocastanum)的晚疫病抗性被映射到8號染色體，《理論與應用遺傳學》，第101卷，第697-704頁)和Li,X.,et.al.,(1998)AutotetraploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkers:theR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.Theor.Appl.Genet.96：1121-1128(Li,X.等人，1998年，使用常見AFLP標記進行同源四倍體和遺傳圖譜繪制：賦予致病疫霉(Phytophthorainfestans)抗性的R2等位基因被映射到馬鈴薯4號染色體，《理論與應用遺傳學》，第96卷，第1121-1128頁)。2.賦予針對除草劑的抗性的基因，例如以下除草劑：A.抑制生長點或分生組織的除草劑，如咪唑啉酮或磺酰脲。此類別中的示例性基因編碼突變ALS和AHAS酶，分別如例如Leeetal.,EMBOJ.7:1241(1988)(Lee等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第7卷，第1241頁，1988年)和Mikietal.,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)(Miki等人，《理論與應用遺傳學》，第80卷，第449頁，1990年)中所述。B.草甘膦(抗性分別由突變的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因和aroA基因削弱)和其他膦?；衔锶绮蒌@膦(草銨膦乙酰轉移酶(PAT)基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)PATbar基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制劑編碼基因)。參見例如，頒給Shah等人的美國專利No.4,940,835，其公開了EPSP形式的能賦予草甘膦抗性的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以以ATCC登錄號39256獲得，該突變基因的核苷酸序列在頒給Comai的美國專利No.4,769,061中公開。頒給Kumada等人的歐洲專利申請No.0333033和頒給Goodman等人的美國專利No.4,975,374公開了賦予對除草劑如L-草銨膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列在頒給Leemans等人的歐洲專利No.0242246中提供。DeGreefetal.,Bio/Technology7:61(1989)(DeGreef等人，《生物技術》，第7卷，第61頁，1989頁)，其描述了表達編碼草銨膦乙酰轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物的產生。賦予苯氧基丙酸和環(huán)己酮(例如拿捕凈和甲禾靈)抗性的示例性基因為Acc1-S1、Acc1-S2和Acc2-S3基因，如Marshalletal.,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)(Marshall等人，《理論與應用遺傳學》，第83卷，第435頁，1992年)。C.抑制光合作用的除草劑，如三嗪(psbA基因和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)。Przibilaetal.,PlantCell3:169(1991)(Przibila等人，《植物細胞》，第3卷，第169頁，1991年)描述了用編碼突變型psbA基因的質粒轉化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在頒給Stalker的美國專利No.4,810,648中公開，含有這些基因的DNA分子可以以ATCC登錄號53435,67441和67442獲得。編碼谷胱甘肽S-轉移酶的DNA的克隆和表達如Hayesetal.,Biochem.J.285:173(1992)(Hayes等人，《生物化學雜志》，第285卷，第173頁，1992年)中所述。D.乙酰羥酸合酶(其已被發(fā)現(xiàn)能使表達這種酶的植物能抵抗多種類型的除草劑)已被引入到多種植物中。參見Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246:419,1995(Hattori等人，《分子和普通遺傳學》，第246卷，第419頁，1995年)。賦予除草劑抗性的其他基因包括編碼大鼠細胞色素P4507A1和酵母NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白的基因(Shiotaetal.,PlantPhysiol.,106:17,1994(Shiota等人，《植物生理學》，第106卷，第17頁，1994年))、谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aonoetal.,PlantCellPhysiol.36:1687,1995(Aono等人，《植物細胞生理學》，第36卷，第1687頁，1995年))和各種磷酸轉移酶的基因(Dattaetal.,PlantMol.Biol.20:619,1992(Datta等人，《植物分子生物學》，第20卷，第619頁，1992年))。E.原卟啉原氧化酶(protox)是葉綠素的生成所必需的，而葉綠素是所有植物存活所必需的。該protox酶充當多種除草化合物的靶標。這些除草劑還抑制所存在的所有不同植物物種的生長，從而造成它們全部毀滅。具有改變的protox活性且抗這些除草劑的植物的培育在美國專利No.6,288,306、No.6,282,837、No.5,767,373和國際公布WO01/12825中有所描述。3.賦予或促成增值性狀的基因，例如以下增值性狀：A.經修飾的脂肪酸代謝，例如，通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉化植物以增加該植物的硬脂酸含量。參見Knultzonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2625(1992)(Knultzon等人，《美國國家科學院院刊》，第89卷，第2625頁，1992年)。B.降低的植酸鹽含量-1)引入植酸酶編碼基因將會增強植酸鹽的分解，從而為該轉化植物增加更多的游離磷酸鹽。例如，參見VanHartingsveldtetal.,Gene127:87(1993)(VanHartingsveldt等人，《基因》，第127卷，第87頁，1993年)關于黑曲霉(Aspergillusniger)植酸酶基因的核苷酸序列的公開內容。2)可引入降低植酸鹽含量的基因。在玉蜀黍中，例如，這可通過克隆并然后再引入與一單個等位基因相關的DNA來實現(xiàn)，該單個等位基因是造成表征為低水平植酸的玉蜀黍突變體的原因。參見Raboyetal.,Maydica35:383(1990)(Raboy等人，《Maydica》，第35卷，第383頁，1990年)。C.經修飾的碳水化合物組成，例如通過用編碼可改變淀粉的分支模式的酶的基因轉化植物來實現(xiàn)。參見Shirozaetal.,J.Bacteriol.170:810(1988)(Shiroza等人，《細菌學雜志》，第170卷，第810頁，1988年)(變形鏈球菌(Streptococcusmutants)果糖基轉移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetzetal.,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(Steinmetz等人，《分子和普通遺傳學》，第20卷，第220頁，1985年)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Penetal.,Bio/Technology10:292(1992)(Pen等人，《生物技術》，第10卷，第292頁，1992年)(表達地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifonnis)α-淀粉酶的轉基因植物的產生)；Elliotetal.,PlantMolec.Biol.21:515(1993)(Elliot等人，《植物分子生物學》，第21卷，第515頁，1993年)(番茄轉化酶基因的核苷酸序列)；etal.,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(等人，《生物化學雜志》，第268卷，第22480頁，1993年)(大麥α-淀粉酶基因的定點誘變)和Fisheretal.,PlantPhysiol.102:1045(1993)(Fisher等人，《植物生理學》，第102卷，第1045頁，1993年)(玉蜀黍胚乳淀粉分支酶II)。D.通過FAD-2基因修飾使油酸升高和/或通過FAD-3基因修飾使亞麻酸減少。參見美國專利No.6,063,947、No.6,323,392和國際公布WO93/11245。4.控制雄性不育的基因A.引入處于毯氈層特異性啟動子的控制下的脫乙酰酶以及應用化學N-Ac-PPT。參見國際專利申請公布WO01/29237。B.引入多種雄蕊特異性啟動子。參見國際專利申請公布WO92/13956和WO92/13957。C.引入barnase基因和barstar基因。參見Pauletal.,PlantMol.Biol.19:611-622,1992(Paul等人，《植物分子生物學》，第19卷，第611-622頁，1992年)。馬鈴薯轉化的方法已經開發(fā)出用于植物轉化的許多方法，包括生物學和物理植物轉化方案。參見例如Mikietal.，“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.(CRCPress,Inc.BocaRaton,1993)pages67-88(Miki等人，《植物分子生物學和生物技術方法》中的“將外來DNA引入植物的步驟”，Glick,B.R.和Thompson,J.E.編輯，CRC出版社，博卡拉頓，1993年，第67-88頁)。另外，用于植物細胞或組織轉化和再生植物的表達載體及體外培養(yǎng)方法是可用的。參見例如Gruberetal.，“VectorsforPlantTransformation”inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.(CRCPress,Inc.,BocaRaton,1993)pages89-119(Gruber等人，《植物分子生物學和生物技術方法》中的“用于植物轉化的載體”，Glick,B.R.和Thompson,J.E.編輯，CRC出版社，博卡拉頓，1993年，第89-119頁)。A.農桿菌介導的轉化-一種用于將表達載體引入植物中的方法是基于農桿菌的天然轉化系統(tǒng)。參見例如Horschetal.,Science227:1229(1985)(Horsch等人，《科學》，第227卷，第1229頁，1985年)。根癌農桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根農桿菌(A.rhizogenes)是在遺傳上轉化植物細胞的植物病原性土壤細菌。根癌農桿菌的Ti質粒和發(fā)根農桿菌的Ri質粒攜帶負責植物的遺傳轉化的基因。參見例如Kado,C.I.,Crit.Rev.PlantSci.10:1(1991)(Kado,C.I.，《植物科學評論》，第10卷，第1頁，1991年)。有關農桿菌載體系統(tǒng)和農桿菌介導的基因轉移方法的描述由Gruber等人(出處同上)、Miki等人(出處同上)以及Moloney等人，PlantCellReports(《植物細胞報道》)8:238(1989)提供。還可參見1996年10月8日頒發(fā)的美國專利No.5,563,055(Townsend和Thomas)。B.直接基因轉移-已經開發(fā)了數(shù)種植物轉化方法(統(tǒng)稱為直接基因轉移)作為農桿菌介導的轉化的備選。植物轉化普遍可適用的方法是微粒介導的轉化，其中在測量為1至4μm的微粒的表面上攜帶DNA。用生物射彈裝置將表達載體引入植物組織中，所述生物射彈裝置將微粒加速到300至600m/s的速度，其足以穿透植物細胞壁和細胞膜。Sanfordetal.,Part.Sci.Technol.5:27(1987)(Sanford等人，《顆?？茖W與技術》，第5卷，第27頁，1987年)；Sanford,J.C.,TrendsBiotech.6:299(1988)(Sanford,J.C.，《生物技術趨勢》，第6卷，第299頁，1988年)；Kleinetal.,Bio/Tech.6:559-563(1988)(Klein等人，《生物技術》，第6卷，第559-563頁，1988年)；Sanford,J.C.PhysiolPlant7:206(1990)(Sanford,J.C.，《植物生理學》，第7卷，第206頁，1990年)；Kleinetal.,Biotechnology10:268(1992)(Klein等人，《生物技術》，第10卷，第268頁，1992年)。還可參見1991年5月14日頒發(fā)的美國專利No.5,015,580(Christou等人))以及1994年6月21日頒發(fā)的美國專利No.5,322,783(Tomes等人)。另一種用于將DNA物理投遞至植物的方法是對靶細胞的超聲處理。Zhangetal.,Bio/Technology9:996(1991)(Zhang等人，《生物技術》，第9卷，第996頁，1991年)。作為另一種選擇，已使用脂質體和原生質球融合來將表達載體引入植物中。Deshayesetal.,EMBOJ.,4:2731(1985)(Deshayes等人，《歐洲分子生物學學會雜志》，第4卷，第2731頁，1985年)；Christouetal.,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:3962(1987)(Christou等人，《美國國家科學院院刊》，第84卷，第3962頁，1987年)。還已經報道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或多聚-L-鳥氨酸來使DNA直接攝取進原生質體中。Hainetal.,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)(Hain等人，《分子和普通遺傳學》，第199卷，第161頁，1985年)和Draperetal.,PlantCellPhysiol.23:451(1982)(Draper等人，《植物細胞生理學》，第23卷，第451頁，1982年)。還已經描述了原生質體及全細胞和組織的電穿孔。Donnetal.,InAbstractsofVIIthInternationalCongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC,A2-38,p53(1990)(Donn等人，IAPTC第七屆國際植物細胞和組織培養(yǎng)會議摘要，第A2-38卷，第53頁，1990年)；D’Halluinetal.,PlantCell4:1495-1505(1992)(D’Halluin等人，《植物細胞》，第4卷，第1495-1505頁，1992年)和Spenceretal.,PlantMol.Biol.24:51-61(1994)(Spencer等人，《植物分子生物學》，第24卷，第51-61頁，1994年)。轉化馬鈴薯靶標組織后，上述可選標記基因的表達容許優(yōu)先選擇經轉化的細胞、組織和/或植物，其中使用本領域中公知的再生和選擇方法來實現(xiàn)。前述轉化方法通常會用于產生轉基因品種。然后可以將轉基因品種與另一(非轉化的或經轉化的)品種雜交，以產生新轉基因品種?；蛘?，可以使用植物育種領域中公知的傳統(tǒng)回交技術將已使用前述轉化技術工程改造進特定馬鈴薯品系中的遺傳性狀移入另一品系中。例如，可以使用回交方法來將工程改造的性狀從公共的、非良種品種移進良種品種中，或者從在其基因組中含有外來基因的品種移進不含該基因的一個或多個品種中。如本文所用，“雜交”可以指簡單的X×Y雜交，或回交過程，這取決于上下文。本領域的普通技術人員將認識到，在本發(fā)明的上下文中使用術語馬鈴薯植物時，這還包括保留了J3的關鍵區(qū)分特性的衍生品種，例如該品種的基因轉化植物或具有一個或多個摻入其中的增值基因(例如除草劑或害蟲抗性)的轉基因衍生物?；亟环椒膳c本發(fā)明一起使用來改善該品種或將特性引入進該品種中。本文所用的術語“回交”是指雜種子代回過來與親本重復雜交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次。貢獻一種或多種所需特性的基因的親本馬鈴薯植株被稱為非回歸親本或供體親本。該術語是指這樣一個事實：該非回歸親本在該回交方案中使用一次并因而不回歸。轉移得到來自非回歸親本的一個或多個基因的親本馬鈴薯植物稱為回歸親本，因為在該回交方案中其被用了數(shù)輪。在典型的回交方案中，將所關注的最初品種(回歸親本)與攜帶要轉移的所關注基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然后使所得到的來自該雜交的子代再次與回歸親本雜交并重復該過程直到獲得一馬鈴薯植株，在該馬鈴薯植株中，除了從非回歸親本轉移的一個或多個基因以外，另外回歸親本的基本上全部的理想形態(tài)學和生理學特性得到恢復。對于成功的回交程序而言，對合適回歸親本的選擇是一個重要的步驟?；亟环桨傅哪康氖歉淖兓蛑脫Q初始品種中的一個或多個性狀或特性。為了實現(xiàn)這一點，將回歸品種的一個或多個基因進行修飾或用來自非回歸親本的理想基因替代或補充，而同時保留初始品種的基本上其余全部所需基因、并因而保留其理想生理學和形態(tài)學組成。對特定非回歸親本的選擇將取決于回交的目的。其中一個主要目的是給植物增添某些在商業(yè)上理想的、在農藝學上重要的性狀。精確回交方案將取決于被變更或增添以確定合適的測試方案的特性或性狀。盡管在被轉移的特性是顯性等位基因時回交方法得到簡化，但可以轉移隱性等位基因。在這種情況下，可能必需引入對子代的測試，以確定理想的特性是否已成功轉移。同樣，可使用多種本領域技術人員所熟知的已確立的重組方法中的任一者來將轉基因引入進植物中，例如如下方法：Gressel,1985,BiotechnologicallyConferringHerbicideResistanceinCrops:ThePresentRealities,InMolecularFormandFunctionofthePlantGenome,L.vanVloten-Doting,(ed.),PlenumPress,NewYork(Gressel，1985年，《植物基因組的分子形式和功能》中的“利用生物技術為作物賦予除草劑抗性：當前現(xiàn)狀”，L.vanVloten-Doting編輯，Plenum出版社，紐約)；Huttner,S.L.,etal.,1992,RevisingOversightofGeneticallyModifiedPlants,Bio/Technology(Huttner,S.L.等人，1992年，經遺傳修飾植物的修正管理，《生物技術》)；Klee,H.,etal.,1989,PlantGeneVectorsandGeneticTransformation:PlantTransformationSystemsBasedontheuseofAgrobacteriumtumefaciens,CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(Klee,H.等人，1989年，植物基因載體和遺傳轉化：基于使用根癌農桿菌、細胞培養(yǎng)物和植物體細胞遺傳學的植物轉化系統(tǒng))；Koncz,C.,etal.,1986,ThePromoterofTL-DNAGene5ControlstheTissue-SpecificExpressionofChimericGenesCarriedbyaNovelTypeofAgrobacteriumBinaryVector；MolecularandGeneralGenetics(Koncz,C.等人，1986年，TL-DNA基因5的啟動子控制新型農桿菌二元載體所攜帶的嵌合基因的組織特異性表達，《分子和普通遺傳學》)；Lawson,C.,etal.,1990,EngineeringResistancetoMixedVirusInfectioninaCommercialPotatoCultivar:ResistancetoPotatoVirusXandPotatoVirusYinTransgenicRussetBurbank,Bio/Technology(Lawson,C.等人，1990年，工程化改造商用馬鈴薯栽培種的混合病毒感染抗性：轉基因RussetBurbank對馬鈴薯病毒X和馬鈴薯病毒Y的抗性；《生物技術》)；Mitsky,T.A.,etal.,1996,PlantsResistanttoInfectionbyPLRV.U.S.PatentNo.5,510,253(Mitsky,T.A.等人，1996年，植物的PLRV感染抗性，美國專利No.5,510,253)；Newell,C.A.,etal.,1991,Agrobacterium-MediatedTransformationofSolanumtuberosumL.Cv.RussetBurbank,PlantCellReports(Newell,C.A.等人，1991年，由農桿菌介導的馬鈴薯栽培種RussetBurbank的轉化，《植物細胞報告》)；Perlak,F.J.,etal.,1993,GeneticallyImprovedPotatoes:ProtectionfromDamagebyColoradoPotatoBeetles,PlantMolecularBiology(Perlak,F.J.等人，1993年，遺傳改良的馬鈴薯：防止科羅拉多馬鈴薯甲蟲的侵害，《植物分子生物學》)；所有這些文獻均以引用方式并入本文用于此目的。已經鑒定了許多性狀，在新品種的開發(fā)中不通常選用這些性狀但可通過回交和遺傳工程技術改善這些性狀。這些性狀可以是轉基因的或者可以不是轉基因的；這些性狀的例子包括但不限于：除草劑抗性；對細菌、真菌或病毒病害的抗性；昆蟲抗性；淀粉及其他碳水化合物濃度的均一性或淀粉及其他碳水化合物濃度的增加；增加的營養(yǎng)品質；塊莖擦傷趨勢降低；以及淀粉轉化成糖的速率降低。這些基因通過細胞核遺傳繼承。這些性狀中的數(shù)種在美國專利No.5,500,365、美國專利No.5,387,756、美國專利No.5,789,657、美國專利No.5,503,999、美國專利No.5,589,612、美國專利No.5,510,253、美國專利No.5,304,730、美國專利No.5,382,429、美國專利No.5,503,999、美國專利No.5,648,249、美國專利No.5,312,912、美國專利No.5,498,533、美國專利No.5,276,268、美國專利No.4,900,676、美國專利No.5,633,434和美國專利No.4,970,168中進行了描述。保藏信息上文所公開的及所附權利要求書所引用的辛普勞公司(J.R.SimplotCompany)專有的馬鈴薯栽培種J3的塊莖保藏物由弗吉尼亞州馬納薩斯市大學路10801號的美國模式培養(yǎng)物保藏所(郵編20110)(AmericanTypeCultureCollection(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110)保藏。保藏日期為2013年5月23日。保藏的25瓶微型塊莖在本申請?zhí)峤蝗掌谥叭∽杂尚疗談诠?J.R.SimplotCompany)保存的同一保藏物。在授予專利后所有限制將不可撤回的取消，并且該保藏旨在滿足37C.F.R.§§1.801-1.809的全部要求。其ATCC登錄號為PTA-120371。該保藏物將維持在保藏所三十年，或最后要求后5年，或該專利的有效期，以較長者為準，并且在該期間內如有必要將進行替換。雖然在上面已經論述了許多示例性方面和實施例，但本領域技術人員將認識到某些修改、置換、增加以及它們的子組合。因此，意圖是如下隨附的權利要求及此后引入的權利要求應該理解為包括所有這些修改、置換、增加和子組合，因為它們在其真正的精神和范圍內。